Parte 1: Verbascoside protege las células pancreáticas contra el estrés ER

Contacto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correo electrónico:audrey.hu@wecistanche.com

Alessandra Galli 1, más, Paola Marciani 1, más, Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3, Michela Castagna 1 y Carla Perego 1,*

Resumen:

Evidencia epidemiológica sustancial indica que una dieta rica en polifenoles protege contra el desarrollo de diabetes tipo 2. El glucósido feniletanoideverbascósido/actósido, un compuesto vegetal polifenólico generalizado, tiene varias propiedades biológicas que incluyen fuertes actividades antioxidantes, antiinflamatorias y neuroprotectoras. El objetivo de esta investigación fue probar los posibles efectos deverbascosideen células pancreáticas, un objetivo nunca antes probado. Se incubaron células humanas y de ratón converbascoside(0.8–16 uM) durante hasta cinco días y se utilizó una combinación de técnicas bioquímicas y de imágenes para evaluar la supervivencia y función de las células beta en condiciones normales o inductoras de estrés del retículo endoplásmico (RE). Encontramos un efecto protector dependiente de la dosis deverbascosidecontra el estrés oxidativo en células clonales y humanas. Los estudios mecanísticos revelaron que el polifenol protege a las células frente a las disfunciones mediadas por el estrés del RE, modulando la activación de la rama de la quinasa del retículo endoplásmico similar al ARN (PERK) de la proteína quinasa de la respuesta proteica desplegada y promoviendo la dinámica mitocondrial. Como resultado, se detectó una mayor viabilidad, función mitocondrial y contenido de insulina en estas células. Estos estudios proporcionan la evidencia de queverbascosideaumenta la capacidad de las células β para hacer frente al estrés del RE, un contribuyente importante de la disfunción y el fracaso de las células β en las condiciones diabéticas y respalda el potencial terapéutico del verbascósido en la diabetes.

Palabras clave:

verbascósido; polifenoles; células productoras de insulina; diabetes; EPU; estrés oxidativo; ER-estrés; GAJE; antiinflamatorio; mitocondrias

1. Introducción

La diabetes es un trastorno crónico que afecta a cientos de millones de personas [1]. Diferentes etiologías caracterizan la diabetes tipo 1 (T1D) y tipo 2 (T2D), ambas con falta de insulina [2]. La insulina regula la concentración de glucosa en plasma estimulando la captación de glucosa en las células musculares y grasas y modulando el metabolismo de la glucosa en el hígado. La disponibilidad de nutrientes, las hormonas y las entradas neuronales regulan la secreción de insulina pancreática y mantienen las concentraciones de glucosa en sangre dentro de un rango fisiológico [3–5]. Por lo tanto, la disfunción de las células β conduce a la diabetes caracterizada por hiperglucemia en ayunas.

La DT2 es una afección progresiva en la que la resistencia a la insulina y el mal funcionamiento de las células β están relacionados entre sí y la evidencia reciente aumentó el interés en el papel primario crítico de las células β en el estado de hiperglucemia [6,7]. En sujetos obesos no diabéticos, las células β compensan la resistencia a la insulina con una mayor secreción de la hormona. Sin embargo, en algunos sujetos, a medida que sus condiciones se deterioran, la insulinemia cae y el nivel de glucosa sube a hiperglucemia [8,9].

La glucosa es el modulador más importante de las funciones de las células beta. La estimulación de glucosa afecta la regulación de genes y la expresión de proteínas involucradas en muchas funciones celulares como la glucólisis, la síntesis y secreción de insulina [10]. La secreción de insulina inducida por glucosa se basa en el metabolismo oxidativo para producir trifosfato de adenosina (ATP) y se produce fisiológicamente un bajo nivel de especies reactivas de oxígeno (ROS). Sin embargo, las células beta no están muy bien equipadas con enzimas secuestrantes y esta debilidad las hace muy susceptibles al estrés oxidativo [11,12]. A medida que aumenta el estrés oxidativo, la producción de insulina de las células beta disminuye, y las células beta producen citocinas que desencadenan el daño celular a través de la inflamación y la apoptosis [13]. Curiosamente, aunque la masa de células beta reducida se ha atribuido previamente a la muerte celular, estudios recientes sugieren un papel importante de la desdiferenciación celular [14,15]. Ha quedado claro que varias etapas conducen a la DT2. Las agresiones metabólicas y oxidativas causan estrés en el retículo endoplásmico (ER) que conduce a la disminución de la síntesis y secreción de insulina, los procesos de inflamación siguen a la liberación de citoquinas y la pérdida de células puede ocurrir a través de la apoptosis y la desdiferenciación. Este conocimiento es fundamental para desarrollar estrategias de tratamiento apropiadas, ya que se puede contrarrestar el estrés oxidativo y la inflamación, y la plasticidad de las células pancreáticas permite la posibilidad de revertir las células madre a células beta como se demostró en ratones [16].

Recientemente, la vulnerabilidad de las células beta al estrés oxidativo ha impulsado con éxito el uso de antioxidantes dietéticos para prevenir la diabetes [17]. Entre los alimentos antioxidantes más interesantes, el aceite de oliva es conocido por sus propiedades beneficiosas desde los antiguos griegos. El aceite de oliva contiene una buena cantidad de ácidos grasos monoinsaturados (MUFA) y varios polifenoles como tirosol, hidroxitirosol, oleuropeína y verbascoside.

Verbascoside, también conocido como acteósido, es un glucósido feniletanoide extraído de Olea europea, plantas de la especie Verbascum y otras 23 familias de plantas [18–20]. También se puede obtener a partir de subproductos del aceite de oliva (se enriquece en las aguas residuales de las almazaras derivadas del procesamiento de la aceituna) o se puede producir mediante enfoques de ingeniería metabólica y biología sintética [21].

Aún no se han informado datos sobre la biodisponibilidad del verbascósido en humanos. Los estudios realizados en ratones, SKBR3 y células Caco-2 sugieren que es factible que el verbascósido no metabolizado atraviese la barrera intestinal, circule en el plasma sanguíneo y ejerza efectos antioxidantes [20,22,23]. A diferencia de la mayoría de los polifenoles vegetales, el verbascósido actúa principalmente sobre las células a través de la modulación de la transcripción génica de una variedad de enzimas y factores reguladores, con efectos antioxidantes y antiinflamatorios [24–30].

Aunque se conocen muchos efectos beneficiosos del verbascósido para la salud humana, no hay datos sobre su efecto sobre las células pancreáticas. Dado que el estrés oxidativo y la inflamación son la base de la patogénesis de la diabetes tipo 2, investigamos si el tratamiento con verbascósido podría mejorar la viabilidad de las células beta y

función en condiciones inductoras de estrés ER y caracterizamos los mecanismos moleculares de su acción. Nuestros datos revelan que el verbascósido previene el estrés oxidativo de las células beta y la inflamación modulando la activación de la respuesta proteica desplegada y promoviendo la dinámica mitocondrial, lo que resulta en un aumento de la viabilidad de las células beta y del contenido de insulina.

2. Materiales y métodos

2.1. Cultivo de células y materiales

Se cultivaron células tc3 de ratón (amablemente proporcionadas por el Prof. Hanahan—Departamento de Bioquímica y Biofísica, Universidad de California, San Francisco, CA [31]) en medio RPMI 1640 (Euroclone SpA, ECB90 0, Pero MI, Italia) complementado con 10 % (v/v) de suero fetal de ternera inactivado por calor (Euroclone SpA, ECS0180L, Pero MI, Italia), 1 % (v/v) de penicilina-estreptomicina (EuroClone SpA, ECB3001D, Pero MI, Italia) y 1 por ciento (v/v) de L-glutamina (EuroClone SpA, ECB300D, Pero MI, Italia). Se aislaron islotes humanos de Langerhans en Milán (Niguarda Ca' Granda) de donantes cadavéricos multiorgánicos según el procedimiento descrito por Ricordi et al. [32]; se cultivaron en medio de cultivo RPMI que contenía 5,5 mmol/L de glucosa, 10 % de suero bovino fetal inactivado por calor, 0,7 mM de glutamina, 50 unidades/mL de penicilina y 50 ug/mL de estreptomicina (EuroClone, SpA, Pero MI, Italia). Se usaron cuatro preparaciones diferentes de islotes, la pureza de los islotes fue del 80 ± 10 por ciento. El aislamiento de islotes y los estudios de islotes fueron aprobados por el Comité de Ética del hospital Niguarda Ca' Granda de Milán (11.12.2009). Las células tc3 se trataron con 0,8, 1,6 y 16 uM de verbascósido (Carbosynth, OV08034, Compton, Reino Unido), ácido cafeico e hidroxitirosol (obsequio del Prof. Dell'Agli, Departamento de Ciencias Farmacológicas y Biomoleculares, Universita degli Studi di Milano, Milán, Italia) en medio RPMI completo durante 5 días, mientras que islotes humanos con verbascoside 16 uM. Las células tratadas con metanol/etanol se usaron como controles. Para inducir el estrés oxidativo, las células se trataron con H2O2 (Sigma Aldrich, H1009, St. Louis MO, EE. UU.) 500 uM en medio RPMI completo durante 20 min antes del análisis, mientras que el tratamiento con tunicamicina 2 ug/mL (T7765, Sigma Aldrich ) durante 7 h para inducir estrés ER.

2.2. Detección de Viabilidad Celular por Prueba MTT

Las células se sembraron en placas de 96 pocillos múltiples y, cinco días después del tratamiento con verbascósido, se incubaron con 0,5 mg/ml de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol{{7} bromuro de }il)-2,5-difeniltetrazolio) (Sigma-Aldrich, M5655, St. Louis, MO, EE. UU.) durante 4 h en una atmósfera humidificada que contiene 5 por ciento de CO2 a 37 oC. Después de la incubación, las células se resuspendieron suavemente en 100 uL de DMSO (Euro-Clone SpA, BK12611S, Pero MI, Italia) y se detectó la absorbancia a 540 nm con un lector de microplacas (Benchmark, lector de microplacas, Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, UU.) [33]. Los experimentos se realizaron por triplicado y los datos se expresaron como veces de aumento con respecto a las muestras de control.

2.3. Detección de muerte celular por citometría de flujo

Cinco días después de la incubación con verbascósido 16 uM, las células se separaron mediante una incubación de 7 min con tripsina/EDTA, se recogieron y se centrifugaron; el sedimento se resuspendió suavemente en solución salina tamponada con fosfato con bajo contenido de sales. Las células se tiñeron con MuseTM recuento y reactivo de viabilidad (Millipore, MCH100102, Burlington MA, EE. UU.) siguiendo el protocolo del fabricante y se analizaron mediante citometría de flujo. Los experimentos se realizaron por triplicado y los datos se expresaron como porcentaje de células muertas sobre el total.

2.4. Generación de ROS

Las ROS intracelulares se evaluaron con DCFDA (diacetato de 2/,7/-diclorofluoresceína) (Sigma Aldrich, D6883, St. Louis, MO, EE. UU.), una sonda permeable a la membrana que se vuelve fluorescente cuando se une a las ROS [34]. Las células tc3 se precargaron con DCFDA 15 uM en tampón de Krebs-Ringer (NaCl 125 mM, KCl 5 mM, MgSO4 1,2 mM, KH2PO4 1,2 mM, HEPES-NaOH 25 mM pH 7,4 y CaCl2 2 mM)

suplementado con glucosa 11 mM durante 1 h a 37 oC. El contenido de ROS se detectó durante 30 min tanto en condiciones basales como de estrés con un lector de microplacas (485/528 nm Ex/Em) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Suiza). Los valores medios y las desviaciones estándar se basaron en tres experimentos independientes.

2.5. Transferencia occidental

Las células tc3 se recogieron y solubilizaron en tampón RIPA (NaCl 150 mM, Tris HCl 50 mM pH 7,6, EDTA 1 mM, TERGITOLw NP40 al 1 por ciento, desoxicolato al 0,5 por ciento) al que se añadió aprotinina (Sigma Aldrich, A4529, St. Louis, MO, EE. UU.), PMSF (Sigma Aldrich, 10837091001, St. Louis, MO, EE. UU.) e inhibidores de Roche (Sigma Aldrich, 5892953001, St. Louis, MO, EE. UU.) durante 40 min a 4 oC. La concentración de proteínas se determinó mediante el ensayo de Bradford [35] utilizando el reactivo de Bradford (Sigma Aldrich, B6916, St. Louis, MO, EE. UU.), se resolvieron 30 ug de proteínas mediante SDS-PAGE al 10 % y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Millipore, Burlington MA, EE. UU.). Los anticuerpos primarios se aplicaron durante 2 h en tampón de bloqueo con soluciones de leche desnatada al 5 % o BSA al 5 %; Se usaron los siguientes anticuerpos primarios: anti- -actina de ratón (Novus International Inc., NB600501, St. Louis, MO, EE. UU.), antiacroleína de ratón (Abcam, ab48501, Cambridge, Reino Unido), anti-BIP de ratón (obsequio del Prof. Borgese Nica, Instituto de Neurociencia, CNR, Milán, Italia), anti-HNE de conejo (-diagnostic International Inc., HNE11S, San Antonio, TX, EE. UU.), anti-HSP70 de ratón (Enzo Life Sciences Inc. ., C92F3A-5, Farmingdale, NY, EE. UU.), conejo anti-fosfo-IKB (Ser32) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, EE. UU.), ratón anti-IKB (Cell Signaling Technology Inc. ., 4814, Danvers, MA, EE. UU.), conejo anti-fosfo-NFKB p65 (Ser 536) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, EE. UU.), conejo anti-NFkB p65 (Cell Signaling Technology Inc., 8242, Danvers MA, EE. UU.), oveja anti-SOD1 (Merck, KGaA, Darmstadt, Germania), conejo anti-PERK (Cell Signaling Technology Inc., 3192, Danvers, MA, EE. UU.), conejo anti-eIF2 (Cell Signaling Technology Inc., 5324, Danvers, MA, EE. UU.) y conejo anti-P-eIF2 (Ser 51) (Cell Signaling Technology Inc., 3597, Danvers, MA, EE. UU.). Los anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Dako Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.) se usaron a una dilución de 1:5000. Las proteínas se detectaron utilizando el sistema de detección ECL (Euro-Clone SpA, Pero MI, Italia) utilizando el sistema de imagen Odyssey Fc (LI-COR Biotechnology GmbH, Bad Homburg, Alemania) y la densidad de banda se cuantificó mediante el software Image Studiow Lite (LI -COR Biosciences, Lincoln, NE, EE. UU.) [36]. Los experimentos se realizaron por triplicado y los datos se expresaron como veces de aumento con respecto a las muestras de control.

2.6. Potencial de la membrana mitocondrial

Se incubaron células tc3 e islotes humanos de Langerhans con MitoSpyw Orange CTMMRos 100 nM (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milán, Italia) o MitoSpyw Green FM 100 uM (BioLegend, 424805, Campoverde Srl, Milán, Italia) durante 30 min a 37ºC. jefe; Las intensidades de fluorescencia se detectaron con el lector de microplacas TECAN Infinite⑧ F500 (551/576 nm Ex/Em para MitoSpyw Orange CTMMRos; 490/516 nm Ex/Em para MitoSpyw Green) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Suiza). Las células se incubaron con H2O2 500 uM durante 20 min y se detectó la intensidad de la fluorescencia como se describió anteriormente. Los valores medios y las desviaciones estándar se basaron en tres experimentos diferentes.

2.7. Morfología y dinámica mitocondrial

Las células tc3 se precargaron con MitoSpyw Orange CTMMRos 100 nM (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milán, Italia) en tampón de glucosa Krebs-Ringer 11 mM a 37 oC durante 30 min. Las muestras se colocaron en una cámara de imágenes y se tomaron imágenes de campos aleatorios utilizando el filtro rhodan del microscopio Axio Observer Z1 (Zeiss, Oberkochen, Alemania). Para evaluar la morfología mitocondrial, se analizaron los siguientes parámetros utilizando el software analizador de partículas ImageJ: área (um2), circularidad (4mArea2/Perimeter2) y diámetro máximo de Feret (um) [37].

Para los experimentos de lapso de tiempo, se realizaron imágenes de una sola célula a 1 cuadro por segundo durante 30 s bajo condiciones de control o estrés oxidativo. Para medir la distancia acumulada mitocondrial (um2), primero se corrigieron las imágenes para el blanqueamiento fotográfico, luego se analizaron los videos utilizando un complemento Image-Pro Plus existente (seguimiento de objetos) (Media Cybernetics, Rockville, MD, EE. UU.). hasta doce

se tomaron imágenes de las células en tres experimentos independientes y los datos se presentaron como valores medios y desviaciones estándar.

2.8. Secreción de insulina

Se sembraron islotes humanos aislados de Langerhans en 96-placa de pocillos a una densidad de 20 islotes por pocillo y, después de 5 días de tratamiento, se midió el contenido y la secreción de insulina en basal (glucosa 3,3 mM) y estimulada (glucosa 16,7 mM). ) por medio de un inmunoensayo ELISA (Mercodia, 10-1113-01, Uppsala, Suecia).

2.9. Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism 8.0 en réplicas biológicas independientes. Se evaluaron las medias entre dos grupos usando la prueba t de Student de dos colas y se tomó un valor de p < 0.05="" como="" evidencia="" de="" significación="" estadística.="" las="" medias="" entre="" tres="" o="" más="" grupos="" se="" compararon="" mediante="" análisis="" de="" varianza="" (anova),="" seguido="" de="" una="" prueba="" de="" comparación="" post-hoc="" múltiple="" (tukey).="" la="" prueba="" estadística="" utilizada,="" los="" valores="" p="" exactos="" y="" el="" número="" de="" réplicas="" (n)="" se="" indican="" en="" las="" leyendas="" de="" las="" figuras="" individuales.="" las="" barras="" de="" error="" en="" las="" figuras="" muestran="" la="" media="" ±="" sd="" o="" la="" media="" ±="" se,="" como="" se="">

3. Resultados

3.1. Verbascoside mejora la viabilidad de las células

Dado que no había datos sobre el efecto del verbascósido en las células, realizamos la prueba MTT para evaluar la viabilidad celular y, como se muestra en la Figura 1A, se observó una tendencia positiva dependiente de la dosis. Por lo tanto, para estudios posteriores, seleccionamos la concentración de 16 uM que estadísticamente demostró ser eficaz para mejorar la viabilidad de las células beta. Mediante citometría de flujo, estudiamos el impacto de cinco días de incubación de verbascósido en la supervivencia de las células beta en condiciones basales y después de 2{{21} } min de pretratamiento con 500 uM H2O2. En la condición basal, el verbascósido no afectó la supervivencia celular, lo que sugiere que el aumento de la viabilidad celular observado en el ensayo MTT puede deberse a una actividad mitocondrial mejorada. Mientras que, después de la exposición al H2O2, el pretratamiento con verbascósido 16 uM redujo significativamente la muerte celular inducida por el estrés oxidativo (Figura 1B,C). El verbascósido es una molécula compleja que puede modificarse hidrolizando enzimas [18]. Para probar si los metabolitos de verbascósido podrían ser responsables del efecto protector observado, las células tc3 se trataron con hidroxitirosol y ácidos cafeicos (0,8 y 16 uM) durante 5 días. Ambos metabolitos no mejoraron la viabilidad celular, por el contrario, se detectó un efecto citotóxico, más relevante después de la exposición al H2O2, para la concentración de 16 uM (Figura S1). Este hallazgo demuestra que el verbascósido y no sus metabolitos ejerce el efecto protector del tratamiento con H2O2.

3.2. Verbascoside modula la homeostasis redox y ejerce un efecto antiinflamatorio en las células

Primero confirmamos en las células tc3 los efectos antiinflamatorios y antioxidantes del verbascósido observados en otros tipos de células [24,29,34]. La actividad eliminadora de ROS del verbascósido se evaluó con células tc3 marcadas con la sonda permeable celular DCFDA (diacetato de 2/,7/-diclorofluoresceína) específica para ROS. Como se muestra en la Figura 2A, se detectó una disminución significativa del contenido de ROS después del pretratamiento con verbascósido, tanto en condiciones de estrés basal como oxidativo.

Los análisis de transferencia Western revelaron una disminución significativa de la expresión de los marcadores de estrés oxidativo acroleína e 4-hidroxinonenal (HNE) en las células tratadas con verbascósido. Además, encontramos un aumento de la expresión de superóxido dismutasa (SOD1), lo que sugiere que el verbascósido ejerce su actividad antioxidante probablemente con dos mecanismos diferentes, directamente como un eliminador de ROS e indirectamente al inducir la expresión de enzimas antioxidantes (Figura 2B,C).

El efecto antiinflamatorio del verbascósido sobre las células se evaluó evaluando la activación de la vía NFKB, la vía proinflamatoria más importante en estas células [38]. Por análisis de Western blot, encontramos una expresión reducida del inhibidor del factor nuclear kappa B (IKB) y del potenciador de la cadena ligera kappa del factor nuclear (NFKB), y una disminución significativa de la fosforilación de NFKB en células pretratadas, lo que respalda la hipótesis de la efectividad del verbascósido para reducir la inflamación celular (Figura 2D,E).

3.3. Verbascoside modula la respuesta proteica desplegada de las células

Luego analizamos en profundidad el mecanismo molecular por el cual el verbascósido ejerce funciones antioxidantes y antiinflamatorias, centrándonos en el retículo endoplásmico que emerge como un sensor clave de señales metabólicas y de estrés en las células. Bajo condiciones de estrés, el orgánulo monta una respuesta homeostática, conocida como respuesta de proteína desplegada (UPR), destinada a recuperar la función ER; sin embargo, la activación excesiva de esta vía da como resultado la apoptosis [39,40].

Los marcadores de mayor estrés en el RE son la regulación positiva de las proteínas chaperonas y la activación de la respuesta UPR. El análisis de transferencia Western de las células tratadas con verbascósido reveló niveles reducidos de las dos chaperoninas proteína de choque térmico 70 (HSP70) y proteína de inmunoglobulina de unión (BIP) (Figura 3A,B). Además, se detectó una reducción significativa de la expresión de la quinasa ER similar al ARN de la proteína quinasa (PERK) y una disminución de la fosforilación de su efector aguas abajo, el factor de iniciación de la traducción eucariota 2 (eIF2).

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