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Cistanche puede mejorar la memoria

Teniendo en cuenta estos hallazgos, a continuación examinamos si la expresión de miR-466f-3p del hipocampo regulada al alza en ratones sobre el aprendizaje espacial ymemoriaLa formación también afectó la morfología neuronal in vivo. Significativamente, encontramos que la densidad media de la columna vertebral de las neuronas del hipocampo de los ratones GLN era más alta que la de los ratones PLN, como lo revela la impregnación de Golgi de la piramidal.

Figura 3. Efectos de la alteración de los niveles de expresión de miR-466f-3p del hipocampo en el rendimiento de MWM del ratón

(A) Línea de tiempo experimental de la tarea MWM, análisis de expresión o medición electrofisiológica de los cerebros de ratón después de la inyección de lentivirus.

(B) Paneles izquierdos: expresión de dsRed en hipocampo de ratón. Imágenes IF representativas de bajo y alto aumento del hipocampo de ratones infectados con lentivirus recombinantes que expresan dsRed solo como control (columna izquierda de imágenes) o miR-466f-3p más dsRed (derecha). columna de imágenes). Las áreas encuadradas de las dos imágenes superiores se amplían y se muestran a continuación. Barras de escala, 100 mm. Las líneas punteadas indican los límites de DG. Los núcleos se tiñeron con DAPI. GCL, capa de células granulares; ML, capa molecular. Histograma derecho, niveles de expresión relativos de miR-466f-3p en hipocampo de ratón infectado con lentivirus que expresa control o miR-466f-3p, según lo analizado por RT-qPCR ( n=16 por grupo).

(C) Rendimiento de MWM de ratones infectados con diferentes lentivirus recombinantes, empaquetados con el uso de cinco plásmidos diferentes que expresan solo dsRed, miR-466f-3p, mut-miR-466f{ {5}}p, y miR/SCR-esponjas, respectivamente, en su hipocampo (n=13, 26, 16, 19 y 11 por grupo, respectivamente). Panel izquierdo: latencia de escape durante el entrenamiento. Panel derecho: latencia de escape individual en la sexta sesión.

Los datos que se muestran en (B) se presentan como media ± SD, y los datos que se muestran en (C) se presentan como media ± SEM. La significación estadística se evaluó mediante la prueba t no pareada (B), ANOVA de dos vías con comparación post hoc de Bonferroni (C, panel izquierdo) o ANOVA de una vía con la prueba post hoc de Tukey (C, panel derecho). Diferencias estadísticas: #p < 0.05,="" **/##p="">< 0.01="" y="" ****p="">< 0.0001;="" *mir-466f-3p="" frente="" a="" otros;="" #mir-esponja="" versus="">

neuronas en el hipocampo de ratón GLN y PLN (Figura S3). Estos hallazgos demuestran que la regulación positiva de miR-466f-3p del hipocampo promueve el crecimiento de neuritas y la formación de espinas dendríticas, que es similar a la inducción de densidad de espinas observada en el hipocampo de ratones GLN en relación con ratones PLN.

miR-466f-3p modula positivamente el aprendizaje espacial del ratón ymemoriarendimiento, así como la plasticidad sináptica

Para investigar si miR-466f-3p regula positivamente el aprendizaje espacial del ratón ymemoriaformación, utilizamos un enfoque de infección por lentivirus recombinante para sobreexpresar el miARN en el hipocampo del ratón. Los ratones se analizaron 7 días después de la inyección de lentivirus en el DG (Figura 3A). Las imágenes representativas de los niveles de expresión de la cadera de miR-466f-3p fueron de hecho elevadas en el grupo de sobreexpresión de miR-466f-3p en comparación con el grupo de control (histograma derecho en la Figura 3B). Encontramos que los ratones con sobreexpresión hipocampal de miR-466f- 3p y sometidos a la tarea MWM exhibieron latencias de escape de 88 ± 5 s en la 1ra sesión y 19 ± 1 s en la 6ta sesión (rojo línea de puntos, Figura 3C), que fueron mejores que para los ratones de control de vector (línea negra) o ratones de control mutantes (línea de círculo rojo) y similares a las latencias de escape de los ratones GLN descritas en la Figura 1A. Paralelamente, examinamos el efecto de la pérdida de función de miR-466f-3p en el aprendizaje espacial ymemoriaal inhibir miR-466f-3p usando miR-sponge. En particular, el rendimiento MWM de los ratones en los que miR-466f-3p del hipocampo quedó atrapado por la esponja miR fue similar al de los ratones PLN, es decir, no aprendieron a encontrar la plataforma ni siquiera por la última sesión (línea cuadrada verde sólida,

Figura 3C). Además, los ratones inyectados con lentivirus no parecían haber interrumpido la plasticidad homeostática, ya que algunos ratones de cada grupo habían aprendido o al menos estaban en proceso de aprendizaje durante la última sesión (Figura 3C, histograma de la derecha).

Dado que la sobreexpresión de miR-466f-3p en el hipocampo del ratón mejoró su aprendizaje ymemoriacapacidad, analizamos la electrofisiología comparativa de neuronas hipocampales cultivadas que expresan diferentes niveles de miR-466f-3p. La corriente postsináptica excitatoria en miniatura (mEPSC) de las neuronas del hipocampo DIV14 que sobreexpresan miR-466f-3p o mut-miR-466f-3p, miR-esponja o control fue registrado utilizando pinzas de parche de células enteras. Mientras que no hubo diferencias significativas en la amplitud de mEPSC, el aumento de Tau o la disminución de Tau entre los cuatro conjuntos de muestras, la frecuencia de mEPSC de las neuronas que sobreexpresaron miR-466f-3p fue significativamente mayor en comparación con otros grupos (Figura 4A), lo que indica que los receptores glutaminérgicos postsinápticos se activaron más fuertemente con la sobreexpresión de miR-466f- 3p.

Luego medimos la potenciación a largo plazo (LTP) para determinar directamente el papel de miR-466f-3p en la plasticidad sináptica in vivo. Inyectamos el hipocampo de ratones con lentivirus recombinante como se describe en la Figura 3 y luego inducimos LTP en cortes de hipocampo mediante estimulación tetánica (tres trenes de estimulación de alta frecuencia [3xHFS]) de la vía colateral de Schaffer. Encontramos que nuestro protocolo indujo LTP en todos los grupos, como lo demuestra el aumento persistente en los potenciales postsinápticos excitadores de campo (fEPSP) en la región cornu ammonis 1 (CA1) (Figura 4B, panel izquierdo). La LTP fue más fuerte en los cortes con sobreexpresión de miR-466f-3p (188 % ± 2 % del valor inicial a los 40–50 min después de la estimulación, media ± SEM) en comparación con los mutantes (169 % ± 1 % del valor inicial), esponja SCR (173 % ± 3 % del valor inicial) y cortes infectados con virus de control (159 % ± 2 % del valor inicial), como inhibición de miR-466f-3p por miR-sponge redujo la LTP (128 por ciento ± 1 por ciento de la línea de base) en relación con los controles (Figura 4B, panel derecho). También medimos la LTP de los grupos GLN y PLN después del entrenamiento. Los datos respectivos también revelaron diferencias significativas en la pendiente de fEPSP en la región CA1 entre los grupos GLN y PLN (Figura 4C). Por lo tanto, un nivel elevado de miR-466f-3p mejora la LTP y la plasticidad sináptica que, a su vez, puede promover el aprendizaje ymemoriacapacidad de los ratones. Juntos, los datos presentados en las Figuras 2, 3 y 4 demuestran que miR-466f-3p juega un papel positivo crítico en el aprendizaje espacial ymemoriaformación, probablemente al mejorar la formación de la columna vertebral, LTP y la fuerza de la plasticidad sináptica.

El ARNm de Mef2a es un objetivo regulador de miR-466f-3p

Realizamos un análisis bioinformático para identificar posibles mRNA diana regulados por la unión de miR-466f-3p a sus 30 UTR. Entre los candidatos que identificamos estaba el ARNm de Mef2a que codifica MEF2A. Curiosamente, se descubrió previamente que la expresión de MEF2A estaba regulada a la baja después del entrenamiento con MWM, y la sobreexpresión de este factor ejercía un efecto negativo en el rendimiento de los ratones (Cole et al., 2012). Por lo tanto, utilizamos un ensayo indicador de luciferasa para examinar si miR-466f-3p regula la traducción del ARNm de Mef2a uniéndose a su 30 UTR. Insertamos secuencias Mef2a 30 UTR de tipo salvaje o mutante aguas abajo de un ADNc de luciferasa impulsado por el promotor SV40- (Luc), lo que resultó en el plásmido informador psiCHECK2-MEF2A 30 UTR o psiCHECK2- mut-MEF2A 30 UTR (Figura 5A). Como se muestra en el histograma de la izquierda de la Figura 5B, la coexpresión de miR-466f-3p atenuó la expresión de luciferasa dirigida por Mef2a 30 UTR. Este efecto parecía depender de la interacción entre miR-466f-3p y Mef2a 30 UTR ya que la mutación del sitio de unión predicho de miR-466f-3p en la Mef2a 30 UTR (50-UGU-GUAU-30) o la región semilla de miR-466f-3p (50-AUACACA-30) reconocer Mef2a 30 UTR anuló el efecto inhibitorio de miR-466f-3p sobre la actividad de luciferasa (Figura 5B, histograma central). Además, la coexpresión de la esponja miR, pero no la esponja CR, también eliminó el efecto represivo de miR-466f-3p sobre la actividad de la luciferasa (Figura 5B, histograma derecho). En particular, ni la sobreexpresión de miR-466f-3p ni la esponja de miR tuvieron ningún efecto sobre los niveles de ARNm de Mef2a en las neuronas primarias del hipocampo (Figura 5C), pero sí redujeron o aumentaron, respectivamente, la nivel de proteína MEF2A (Figura 5D). También encontramos que la sobreexpresión de miR-466f-3p o miR-esponja, respectivamente, regulaba a la baja o al alza el nivel de ARNm de la proteína asociada al citoesqueleto regulada por actividad (Arc) en las neuronas primarias del hipocampo (Figura 5C) , que era un objetivo corriente abajo regulado positivamente por MEF2A (Flavell et al., 2006)

También realizamos hibridación fluorescente in situ (FISH) para detectar miR-466f-3p y lo combinamos con el etiquetado IF de MEF2A en neuronas hipocampales primarias DIV14 sin o con tratamiento con forskolina. Se sabe que la forskolina induce la LTP química y activa la adenilil ciclasa, elevando así los niveles de AMPc intracelular. Observamos la colocalización nuclear de MEF2A con miR-466f- 3p, como se ilustra en las imágenes representativas de la Figura 5E. Sin embargo, después de la estimulación con forskolina, la señal de miR-466f-3p aumentó tanto en el soma como en las dendritas, mientras que la señal de MEF2A en el

núcleo disminuido, como lo muestran los cambios recíprocos de las intensidades de las señales MEF2A y Fast Red, respectivamente, de las células neuronales individuales (Figura 5E). En resumen, los datos de las Figuras 5A–5E indican que miR-466f-3p regula negativamente la expresión de la proteína MEF2A al unirse a la 30 UTR del ARNm de Mef2a y, en consecuencia, reprimir su traducción.

De acuerdo con los resultados descritos anteriormente, encontramos que los niveles de proteína MEF2A en el hipocampo se redujeron en ratones GLN después del entrenamiento MWM, pero no en ratones PLN (Figura 5F). Además, los niveles relativos de MEF2A en ratones GLN individuales (puntos) y ratones PLN (cuadrados) se correlacionaron inversamente con los niveles de miR-466f-3p (R=0.60, Figura 5G). Así, patrones heterogéneos de aprendizaje espacial ymemoriaLa capacidad está modulada por aumentos estocásticos de miR- 466f-3p del hipocampo en ratones individuales y las consiguientes disminuciones de MEF2A tras la estimulación de la actividad neuronal.

Activación estocástica de CREB del hipocampo y la consiguiente regulación positiva transcripcional del grupo miR- 466-669 durante el entrenamiento MWM

Investigamos los mecanismos por los cuales miR-466f-3p en el hipocampo de ratón podría aumentarse estocásticamente mediante la tarea MWM. Hay tres precursores de miARN que codifican miR-466f-3p, todos los cuales pertenecen al grupo miR-466-669 específico de roedores ubicado en el intrón 10 de su gen huésped, mSfmbt2 (Inoue et al. ., 2017) (Figura 6A). Curiosamente, en contraste con miR-466f-3p, no hubo una diferencia significativa en los niveles de expresión de mSfmbt2 entre los grupos GLN y PLN (Figura 6B), lo que sugiere que el grupo miR-466-669 podría codificar una transcripción separada en lugar de ser parte de la transcripción primaria de mSfmbt2. En consecuencia, diseñamos varios conjuntos de cebadores para identificar la supuesta transcripción primaria del grupo miR-466-669 por RT-qPCR. Como se muestra en la figura 6A, un fragmento largo de PCR (más de 282 a 2381), junto con una serie de bandas de qPCR superpuestas, a saber, A (más de 282 a 115), B (de 131 a 406), C (de 388 a 686), D (662 a 1028), E (1004 a 1299), F (1242 a 1629), G (1605 a 2029) y H(2005 a 2381), se pudo detectar en el hipocampo de ratón, pero no en la parte I (2306 a 2776). ) (datos no mostrados). Estos datos respaldan que el grupo miR-466-669 codificó una transcripción larga cerca de aproximadamente 2388 pb aguas arriba del primer precursor de miARN (es decir, pre-mir-466m, indicado como más 1 en la Figura 6A). Sorprendentemente, similar a lo que encontramos para miR-466f-3p, el nivel promedio de esta transcripción en el hipocampo de ratones GLN fue más alto que para ratones PLN (Figura 6C). Por lo tanto, mejorar el aprendizaje ymemoriaLa capacidad de los ratones GLN se debe a la activación transcripcional del grupo miR-466-669.

La activación de CREB nuclear por fosforilación durante tareas MWM o en otras formas de aprendizaje es un paso crítico para convertir corto plazo en largo plazomemoria(Lisman et al., 2018; Rogerson et al., 2014). Por lo tanto, investigamos si los niveles variables de miR-466f-3p entre ratones individuales que se sometieron a la tarea MWM podrían estar correlacionados con el estado de activación de CREB. Para explorar esta idea, primero examinamos los niveles de fosforilación de CREB del hipocampo en ratones individuales. Como se muestra en la Figura 6D, la activación de CREB (por fosforilación en el residuo S-133) se mejoró en ratones GLN en relación con ratones PLN y HC. También confirmamos que miR-466f-3p se coexpresó de hecho con pCREB en neuronas al realizar miRNA ISH combinado con tinción IF de pCREB y MAP2 en neuronas primarias del hipocampo (Figura S2A). Además, los niveles de transcripción primaria del grupo miR- 466-669 se correlacionaron positivamente con pCREB en ratones GLN (R=0.52), mientras que se correlacionó negativamente con pCREB en ratones PLN (R=0 .71) (Figura 6E). Buscamos una correlación entre los niveles de otro factor activo, la quinasa regulada por señal fosfoextracelular (pERK), y los niveles de transcripción primaria del grupo miR-466-669. Encontramos que ambos tipos de ratones entrenados en MWM presentaron correlaciones positivas entre la señal de grupo miR-466-669 y pERK (R=0.59 y 0.48, respectivamente; Figura S4A), y no hubo diferencia en pERK/ Expresión de tERK entre esos dos grupos (Figura S4B). Para aclarar aún más el impacto de la activación de CREB en la regulación positiva transcripcional del grupo miR-466-669y, en consecuencia,

En la inducción de miR-466f-3p, usamos un inhibidor de CREB específico,666- 15 (Xie et al., 2015), en combinación con el tratamiento con forskolina de las neuronas primarias del hipocampo DIV14. Se sabe que la forskolina activa la fosforilación de CREB (Malhotra et al., 2015). Descubrimos que el pretratamiento de las neuronas primarias del hipocampo con 666-15 bloqueó la activación de CREB inducida por forskolina (Figura 6F) y redujo los niveles de grupo miR-466f-3p y miR-466-669 transcripción (Figuras 6G y 6H). Al mismo tiempo, los niveles de ARNm de los genes diana pCREB conocidos nurr1 y homer1a (Bridi et al., 2017; Jensen et al., 2017) también se redujeron con el tratamiento 666-15 (Figura 6H). En conjunto, la Figura 6 muestra que la activación estocástica de CREB en el hipocampo de una subpoblación de ratones endogámicos sometidos a la tarea MWM induce la transcripción del grupo miR-466-669 y, en consecuencia, la inducción de miR-466f{{23 }}p, mejorando así su aprendizaje espacial ymemoriacapacidad para desempeñarse mejor en la tarea.

DISCUSIÓN

Hemos explorado el posible papel de los miARN en la modulación de la capacidad variable de aprendizaje espacial ymemoriaentre ratones C57BL/6J endogámicos. Sugerimos que la activación estocástica de CREB y la consiguiente regulación positiva de miR-466f-3p del hipocampo explican el mayor aprendizaje espacial ymemoriacapacidad de un subgrupo de nuestros ratones de prueba, probablemente debido a miR-466f-3p que media la inhibición traduccional del ARNm de Mef2a que codifica elmemoriaregulador negativo MEF2A. Nuestros hallazgos proporcionan un escenario que demuestra el papel funcional y evolutivo de un miARN específico en la regulación de la cognición a través de la inducción estocástica de un eje CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A por estímulos ambientales.

La tarea MWM se ha utilizado ampliamente para examinar la capacidad variable de aprendizaje espacial ymemoriapara roedores. En condiciones normales, los roedores usan señales distales para orientarse, lo que les permite aprender y memorizar la ubicación de la plataforma oculta en la tarea. La mayoría de nuestros ratones C57BL/6J consanguíneos de prueba (62 por ciento) exhibieron un patrón normal de latencia de escape, encontrando la plataforma dentro de los 30 s para las sesiones 3.-6 (Figura 1A, GLN). Por el contrario, un grupo de ratones (38 por ciento) no aprendió la tarea ni siquiera en la sexta sesión (PLN). En particular, también hemos sometido a los ratones a otras dos pruebas de reconocimiento. La primera fue la prueba de reconocimiento de objetos novedosos (NOR), que es una prueba única basada en la exploración innata sin refuerzo ni estrés para motivar el comportamiento (Leger et al., 2013). La correlación entre las tareas NOR y MWM en términos de rendimiento del ratón es pobre (R {{1{{20}}}}.13), que es similar a la correlación entre el rendimiento NOR y los niveles de expresión del hipocampo. de miR-466f-3p (R=0.01; datos no mostrados). La prueba NOR tampoco reveló diferencias en el índice de discriminación entre los grupos MWM GLN y PLN (0,36 ± 0,25 versus 0,29 ± 0,18; Figura S1B). El otro aprendizaje espacial ymemoriaLa tarea dependiente que hemos aplicado es el laberinto de Barnes (BM), que es similar al MWM. Se basa en la suposición de que los roedores ubicados en un entorno aversivo deben aprender y recordar la ubicación de una caja de escape ubicada debajo de la superficie de la plataforma. Como se muestra en la Figura S1C, hemos descubierto que el rendimiento de los ratones en los ensayos de la sonda BM también se correlaciona positivamente con los niveles de expresión del hipocampo de miR-466f-3p. Así, la inducción del eje CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A en el hipocampo durante el aprendizaje ymemoriala formación es espacialmente dependiente del contexto.