Parte 2: El echinacósido protege contra la apoptosis neuronal inducida por MPP plus a través de la regulación de la vía ROS/ATF3/CHOP

equinacósidoProtege contra la apoptosis neuronal inducida por MPP plus a través de la regulación de la ruta ROS/ATF3/CHOP

Qing Zhao1 • Xiaoyan Yang2 • Dingfang Cai3,4 • Ling Ye5,6 • Yuqing Hou1 •

Lijun Zhang1 • Jiwei Cheng1 • Yuan Shen1 • Kaizhe Wang5 • Yu Bai1

Contacto:joanna.jia@wecistanche.com

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Cistanche equinacósidotiene propiedades antioxidantes

Tinción de inmunofluorescencia

1 mmol/L MPP?, 40 LG/mL ECH, o una combinación de MPP? y ECH. A continuación, las células se incubaron en un tampón de bloqueo (BSA al 3 % en PBS) a temperatura ambiente (TA) durante 30 min. A continuación, los anticuerpos anti-ATF3, anti-CHOP o anti-caspasa 3 escindida se diluyeron a 1:100 en tampón de bloqueo (BSA al 1 % en PBS con Triton X al 0,3 %-100) y se incubaron durante la noche a 4ºC. Después de lavar tres veces con PBS, las células se incubaron con Alexa 488-goat anti-rabbit IgG (Life Technologies, Carlsbad, CA) a temperatura ambiente durante

1 hora Los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342. Las imágenes se capturaron con un microscopio confocal (Leica SP8, Wetzlar, Alemania).

Ensayo de marcado de extremo de muesca de dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL)

Teñimos cada décima sección coronal (total 14–15) a través de la SNc desde bregma -2.92 nm a -3.64 mm.

Se utilizaron cuatro secciones típicas a través de la SNc al mismo nivel en cada grupo para los recuentos de TH y TUNEL [10]. Se realizaron ensayos TUNEL para analizar la apoptosis en secciones de tejido con un kit de detección de muerte celular in situ (Roche, Rotkreuz, Suiza), siguiendo las instrucciones del fabricante. Después del marcaje del ADN, las secciones se usaron para la tinción de inmunofluorescencia con anticuerpo anti-TH y las imágenes se capturaron con un microscopio confocal (Leica SP8, Wetzlar, Alemania). Después de la delimitación de la SNc a bajo aumento (objetivos 10 9) de acuerdo con el atlas de cerebro de ratón [20], las células TH positivas y las células doblemente positivas TH/TUNEL se contaron con un aumento mayor ({{7} } objetivos) por dos observadores ciegos al tratamiento. Se calculó la proporción de células TH/TUNEL doblemente positivas a células TH-positivas.

Cistancheechinacoside tieneantiinflamatoriopropiedades

Análisis estadístico

Todos los datos se presentan como media ± SD. ANOVA unidireccional seguido de análisis post hoc con HSD de Tukey y la prueba de comparaciones múltiples de Student-Newman-Keuls se realizaron con fines estadísticos. Un valor de P \ 0.05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

ECH disminuye los productos y atenuaciones de ROS

Apoptosis inducida por MPP1-

Se ha demostrado que ECH protege a las neuronas de la apoptosis en modelos animales, así como también reduce los niveles de citocinas proinflamatorias en las células de neuroblastoma [12]. Sin embargo, no está claro si ECH modula directamente la apoptosis neuronal inducida por MPP?. Nuestros datos mostraron que ECH no afectó la proliferación o muerte de las células SH-SY5Y (Fig. 1B), y su morfología permaneció sin cambios (Fig. 1C). Curiosamente, después de la exposición de las células SH-SY5Y a MPP?, la supervivencia aumentó de manera dependiente de la dosis después del tratamiento con ECH (10–40 lg/mL) (Fig. 1B, C).

Estudios anteriores han demostrado que MPP? inhibe específicamente la cadena de transporte de electrones en las mitocondrias y también se asocia con la generación de ROS [6, 21]. Usando DCFH-DA como una sonda fluorescente para evaluar los cambios en los niveles de ROS, encontramos que ECH suprimió notablemente la generación de ROS inducida por MPP? (Fig. 2A). La microscopía confocal reveló que los productos de ROS disminuidos estaban asociados con los niveles de ECH (Fig. 2C). También se demostró que ECH protege la membrana celular contra ROS y disminuye los niveles de MDA, el producto final de la peroxidación lipídica (Fig. 2B). Tomados en conjunto,

ECH promueve la supervivencia celular al disminuir los productos ROS inducidos por MPP? en las neuronas.

ECH suprime la expresión génica inducida por ROS relacionada con el estrés/MPP1-y aumenta el GDNF

Expresión en celdas tratadas con MPP1-

Se ha demostrado que los productos ROS estimulan la respuesta de la proteína desplegada e inducen la expresión de genes relacionados con el estrés, incluidos ATF3, ATF4 y CHOP [22]. ATF3 y CHOP juegan un papel especialmente importante en la apoptosis neuronal inducida por estrés [9, 23]. La expresión anormal de a-sinucleína también es uno de los marcadores críticos en la patología de la EP [2]. Usando qRT-PCR, analizamos la expresión de ATF3, CHOP, SNCA y el factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF) en el MPP? modelo celular y encontró que MPP? mejoró significativamente la expresión de ATF3, CHOP y SNCA en comparación con el grupo de control de PBS. ECH no afectó la expresión de estos genes en células SH-SY5Y que no fueron tratadas con MPP?. Sin embargo, ECH anuló su expresión inducida por MPP? (Fig. 3). Además, MPP? suprimió significativamente la expresión de GDNF en células SH-SY5Y, pero ECH revirtió parcialmente este fenómeno (Fig. 3B).

ECH inhibe la activación de caspasa inducida por MPP1--3 en células SH-SY5Y

Los altos niveles de ATF3 y CHOP promueven directamente la apoptosis neuronal [9, 23]. Nuestros datos mostraron que ECH inhibió la expresión de ATF3 y CHOP de una manera dependiente de la dosis (Fig. 4A). ECH también bloqueó la caspasa inducida por MPP?-3

actividad (Fig. 4A, B). El análisis de inmunofluorescencia de la forma escindida de caspasa-3 mostró además que ECH disminuyó notablemente la expresión de la proteína caspasa-3 escindida en células tratadas con MPP \beta (Fig. 4C).

ECH invierte la acumulación de ATF3 y CHOP inducida por MPP1-en células SH-SY5Y

Después de la exposición a toxinas ambientales, las proteínas ATF3 y CHOP se localizan en el citoplasma y el núcleo [24, 25] y esto conduce a la apoptosis. Nuestros resultados sugirieron que MPP? el tratamiento aumentó la expresión de ATF3 y CHOP en el núcleo, y ECH atenuó efectivamente este proceso (Fig. 5A, B). El análisis de transferencia Western mostró que MPP? niveles notablemente aumentados de ambas proteínas en el citoplasma y el núcleo. Curiosamente, ECH derogó el MPP? y suprimió la acumulación de ATF3 y CHOP en el núcleo (Fig. 5C-E).

ATF3 juega un papel fundamental en la apoptosis inducida por MPP1-en células SH-SY5Y

Se ha demostrado que ATF3 induce apoptosis en células SH-SY5Y [23], y los resultados del presente estudio indican que ECH suprime significativamente la expresión de proteína y ARNm de ATF3 inducida por MPP? en estas celdas. Sin embargo, el papel de ATF3 en la apoptosis y la protección ECH de la supervivencia celular seguía sin estar claro. Así que usamos ARN de horquilla pequeña (shRNA) específico para ATF3 para investigar esto y no encontramos diferencias en la viabilidad entre el grupo de eliminación de ATF3-y el grupo de control en condiciones normales (Fig. 6A). Sin embargo, la supresión de ATF3 o el tratamiento con ECH rescataron significativamente los cambios morfológicos inducidos por MPP? (Figura 6B). ¿Las células de eliminación de ATF3-tenían una mayor viabilidad que el grupo de control después de la exposición a MPP? (Figura 6C). Los niveles de proteína de CHOP y caspasa activada-3 fueron más bajos en las células inactivadas ATF3-que

en células de control con shRNA no específico (Fig. 6C, D). Estos datos indicaron que ATF3 juega un papel crítico en la apoptosis inducida por MPP \beta de células de neuroblastoma. Por lo tanto, estos resultados respaldan la hipótesis de que ECH protege a las células SH-SY5Y contra los efectos inducidos por MPP? a través de la regulación a la baja de la vía ROS/ATF3/CHOP. Curiosamente, nuestros datos mostraron que ECH también inhibió el aumento inducido por MPP? de los niveles de p53 y PUMA (p53-modulador regulado al alza de la apoptosis) en células SH-SY5Y (Fig. 7).

Cistancheechinacósidotiene el efecto de mejorarinmunidad

ECH protege las neuronas DA contra la apoptosis

Inducida por MPP1 in Vitro o por MPTP in Vivo

Para confirmar la acción de ECH en la EP, las neuronas DA primarias se trataron con MPP? o MPP? y ECH. Los experimentos in vitro revelaron que MPP? redujo significativamente la viabilidad de las neuronas DA y esto fue impedido por ECH

(Figura 8). Además, evaluamos la apoptosis en las neuronas DA en el SNc después de diferentes tratamientos en ratones con EP inducida por MPTP y controles. Se encontraron más neuronas TH positivas en esta área en el control que en el grupo MPTP (Fig. 9A). Los ensayos TUNEL mostraron que NS y ECH no indujeron la apoptosis en las neuronas DA en el SNc, pero MPTP sí lo hizo y ECH protegió a las neuronas contra ella (Figs. 9B, S2). Curiosamente, la transferencia de Western de lisados ​​​​de SNc del modelo de ratón de PD mostró que los niveles de proteína ATF3 y CHOP también disminuyeron por ECH (Fig. 10).

Cistancheechinacósidotiene unefecto antiapoptótico