Parte 2: La enfermedad renal crónica proteinúrica está asociada con la alteración de la vida útil, la deformabilidad y el metabolismo de los glóbulos rojos

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La lesión renal inducida por doxorrubicina altera la vida útil, la morfología y las propiedades biofísicas de los glóbulos rojos murinos

Veinte días después de la inducción de DIN, coincidiendo con el desarrollo de reducciónFunción del riñón(Figura 1b), el colorante fluorescente 5(6)-CFDA, SE,24 que se absorbe rápidamente en los glóbulos rojos, se inyectó iv para examinar la tasa de eliminación de glóbulos rojos en los puntos de tiempo indicados in vivo. Los histogramas representativos, que se muestran en la Figura 4a, indican la eliminación de los glóbulos rojos marcados de la circulación y el reemplazo por glóbulos rojos sin marcar. El aumento de la pérdida de glóbulos rojos ya era evidente 3 días después de la administración del tinte, y la eliminación de los glóbulos rojos fue significativamente más rápida en los ratones 129S1/SvImJ con DIN hasta el día 37. En el día 41, se eliminó un 17 % más de glóbulos rojos de la circulación en estos ratones en comparación con con ratones sanos (Figura 4b).

CistanchemejorarFunción del riñónybeneficiosriñones

Las imágenes tomadas de un frotis de sangre revelaron cambios morfológicos en los glóbulos rojos extraídos de ratones 129S1/SvImJ con ratones DIN (Figura 4c) y Nphs2Dipod (Figura complementaria S4A). En ratones sanos, los glóbulos rojos muestran una forma de disco bicóncava. En ratones 129S1/SvImJ con DIN, observamos un mayor número de estomatocitos (estrellas rojas), células en forma de lágrima (triángulo negro), esquistocitos (puntos negros) y células microcíticas (flecha negra) (Figura 4c). Los ratones Nphs2Dipod mostraron una mayor proporción de esquistocitos (puntos negros, Figura complementaria S4A, imagen inferior, lado izquierdo) y las células eran policromáticas (Figura complementaria S4A, imagen inferior, lado derecho).

Para investigar más a fondo los cambios funcionales de RBC, se realizaron mediciones de deformabilidad en el día 30 mediante ektacitometría.³²La deformabilidad de los glóbulos rojos se redujo significativamente en ratones 129S1/SvImJ con DIN, así como en ratones Nphs2Dipod, como lo indica un índice de elongación máxima reducido (EImax) (Figura 4d y Figura complementaria S4B). La tensión de cizallamiento para el 50 por ciento (SS1/2) de EImax (Figura 4e) y, por lo tanto, la relación SS1/2 EImax (Figura 4f) aumentaron significativamente en ratones 129S1/SvImJ con DIN, lo que indica glóbulos rojos más rígidos. SS1/2 de EImax fue similar en ratones Nphs2Dipod (Figura complementaria S4C). La relación SS1/2 EImax tendió a aumentar en ratones Nphs2Dipod en comparación con ratones sanos C57BL/6; sin embargo, la diferencia no alcanzó significación estadística (P=0.06) (Figura complementaria S4D).

Como la exposición de los glóbulos rojos a condiciones extracelulares hipertónicas in vitro imita el entorno osmótico que se encuentra en la médula renal, se puede realizar un cosmos el día 30 y se determinaron varios parámetros osmosensibles, como se describió anteriormente.³³ Omin representa la osmolalidad en la deformabilidad mínima de los glóbulos rojos, más allá de la cual los glóbulos rojos se lisarían con una mayor disminución de la osmolaridad. Los valores de Omin fueron más altos en los ratones 129S1/SvImJ con DIN y se desplazaron hacia la derecha (Figura 5a y d). Se observó una tendencia similar hacia un Omin más alto en ratones Nphs2Dipod (Figura complementaria S4E). Los valores de Ohyper, que reflejan el estado de hidratación de las células, fueron significativamente más altos en los ratones 129S1/SvImJ con DIN (Figura 5b), pero fueron similares en los ratones Nphs2Dipod y sus respectivos ratones de control (Figura complementaria S4F). La deformabilidad máxima (EImax) en la isotonicidad es el punto en el que las células han alcanzado la elipticidad máxima. EImax en isotonicidad se redujo significativamente en ratones 129S1/SvImJ con DIN (Figura 5c) pero no mostró diferencias en ratones Nphs2Dipod en comparación con ratones sanos C57BL/6 (Figura complementaria S4G). En general, estos resultados indican una reducción de la integridad y la elasticidad de la membrana, pero también cambios de forma en los ratones 129S1/SvImJ y Nphs2Dipod, así como una mayor fragilidad osmótica de los glóbulos rojos de los ratones 129S1/SvImJ con DIN.

Los glóbulos rojos se reprograman metabólicamente durante la enfermedad renal proteinúrica en ratones

Para comprender mejor las adaptaciones moleculares asociadas con los cambios en la abundancia y la morfología de los glóbulos rojos en función de la lesión renal, se analizaron los glóbulos rojos de ratones 129S1/SvImJ con ratones DIN y Nphs2Dipod mediante metabolómica basada en espectrometría de masas (Figura 6a y Figura complementaria S5A). Usando este enfoque, se determinaron los niveles relativos de 256 metabolitos para ratones 129S1/SvImJ y ratones Nphs2Dipod. Para analizar estos datos de manera sistemática, se realizaron análisis multivariantes, incluido el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales y el análisis de conglomerados jerárquicos. Curiosamente, el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales de los metabolomas de glóbulos rojos de ambos modelos reveló patrones de agrupamiento similares.

Específicamente, aunque las muestras en el momento de la inducción del modelo se agruparon junto con muestras sanas de todos los puntos temporales, las muestras de ratones nefróticos se agruparon independientemente de las muestras de control sanas junto con el componente 1 (Figura 6b y Figura complementaria S5B). De acuerdo con los patrones de agrupamiento evidentes en los 2 modelos, el análisis de agrupamiento jerárquico de los datos metabolómicos para cada modelo resaltó tendencias similares para los metabolitos involucrados en el manejo del estrés oxidativo, así como nucleótidos, aminoácidos, acilcarnitinas y ácidos grasos (Figura 6c). y figuras complementarias S5C, S6 y S7). Por ejemplo, los niveles de alantoína, un catabolito de purina y marcador de estrés oxidativo en los glóbulos rojos,³⁴ y el glutatión reducido se acumularon significativamente con el tiempo en ambos modelos de ratones nefróticos, lo que indica la generación continua de especies reactivas de oxígeno y la activación del sistema de glutatión antioxidante (Figura 6d y Figura complementaria S5D). Del mismo modo, los niveles del pantotenato precursor de la coenzima A (CoA) se acumularon con el tiempo (Figura 6e y Figura complementaria S5E).

Se evidenciaron patrones similares en los niveles de los ácidos grasos libres ácido hexadecenoico (C16:1), ácido octadecenoico (C18:1) y ácido docosapentaenoico (C22:5), aunque cada modelo tenía patrones temporales únicos (Figura 6f y Figura complementaria S5F).

Además de los ácidos grasos, las acilcarnitinas, incluida la hidroxioctanoil-carnitina (AC C8-OH), la hidroxidecanoil-carnitina (AC C10-OH) y la dodecanoil-carnitina (AC C12:1), también respondieron a la inducción de nefropatía proteinúrica en ambos modelos (Figura 6g y Figura complementaria S5G).

Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que en la inducción de proteinuriaenfermedad del riñonen 2 modelos de ratones similares, el aumento de los niveles de estrés oxidativo puede dañar las cadenas de acilo en los lípidos de la membrana. Debido a que los glóbulos rojos carecen de la capacidad de sintetizar nuevos lípidos, hacen uso de un sistema que depende de la eliminación mediada por fosfolipasa de las cadenas de acilo dañadas y el reemplazo con ácidos grasos no dañados. Este sistema, denominado ciclo de Lands,35 depende de la activación de la cadena de acilo por conjugación con CoA, que establece un equilibrio con la acilcarnitina para el reemplazo de la membrana36 (Figura 6h y Figura complementaria S5H).

Los pacientes con ERC proteinúrica con anemia muestran una mayor muerte de glóbulos rojos

To confirm that PS-exposing RBCs occur also in human CKD, as described earlier,37 we analyzed blood samples from 25 patients treated by our outpatient clinic. To match the mouse models that represent nephrotic syndrome with preserved GFR during the first 10 days, and then advanced CKD with reduced GFR from day 20 onwards (Figure 1 and Supplementary Figure S2), we analyzed 10 patients with primary nephrotic syndrome representing proteinuric CKD with preserved GFR (>60 ml/min por 1,73 m2) y 15 pacientes con ERC con proteinuria en rango nefrótico y FG<60 ml/min="" per="" 1.73="">². Las características de los pacientes se muestran en la Tabla 1. Anemia asociada a enfermedad renal, definida por una concentración de hemoglobina<13.5 g/dl="" in="" men="" and=""><12 g/dl="" in="" women,="" was="" observed="" in="" 4="" of="" the="" 10="" primary="" nephrotic="" patients="" (red="" triangles="" in="" figure="" 7),="" whereas="" 14="" of="" 15="" ckd="" patients="" with="" nephrotic-range="" proteinuria="" and="" reduced="" gfr="" were="" anemic="" (figure="" 7a).="" in="" the="" latter="" group,="" plasma="" epo="" concentrations="" and="" reticulocyte="" production="" index="" were="" not="" increased="" (figure="" 7b="" and="" c),="" consistent="" with="" reduced="" erythropoiesis.="" in="" fluorescence-activated="" cell="" sorting="" analysis,="" primary="" nephrotic="" patients="" and="" patients="" with="" advanced="" ckd="" had="" a="" higher="" rate="" of="" ps-exposing="" cells="" (mean,="" 1.0%="" 0.3%="" and="" 1.4%="" 0.7%,="" respectively)="" compared="" with="" healthy="" subjects="" (mean,="" 0.6%="" 0.1%;="" figure="" 7d).="" rbc="" cell="" death="" in="" patients="" with="" primary="" nephrotic="" syndrome="" and="" advanced="" ckd="" was="" triggered="" by="" higher="" levels="" of="" reactive="" oxygen="" species="" (figure="" 7e)="" and="" increased="" ceramide="" levels="" (figure="" 7f).="" augmented="" intracellular="" calcium="" concentration="" was="" found="" in="" patients="" with="" advanced="" ckd="" (figure="">

Los glóbulos rojos humanos de pacientes con síndrome nefrótico primario y ERC avanzada mostraron alteraciones morfológicas, como se observa en los modelos de ratón (Figuras 4c y 7j-l y Figura complementaria S4A). Aunque la morfología de los glóbulos rojos era normal en los controles, los pacientes anémicos con síndrome nefrótico primario y pacientes con ERC avanzada tenían un mayor número de células en forma de lágrima (triángulos negros) y equinocitos (cruces negras) (Figura 7k y l). Además, se produjeron células diana en pacientes nefróticos primarios con anemia y en pacientes con ERC avanzada (cruces rojas; Figura 7k y l). Todos los grupos de pacientes, incluidos los pacientes nefróticos primarios sin anemia, tenían una mayor proporción de esferocitos (flechas azules; Figura 7j-l). Para analizar la deformabilidad de los glóbulos rojos humanos, se realizó ektacitometría. En comparación con controles sanos, la deformabilidad máxima (EImax) se redujo en pacientes con ERC avanzada (Figura 7h); El EImax tendió a ser menor en pacientes con síndrome nefrótico primario sin alcanzar significación estadística (Figura 7h). Los parámetros SS1/2, Omin, Ohyper y EImax en isotonicidad no fueron significativamente diferentes entre los controles sanos, los pacientes nefróticos primarios y los pacientes con ERC avanzada (Figura complementaria S8A-D).

Beneficios de la cistancheriñones y ayudar con la ERC.

DISCUSIÓN

El presente estudio revela nuevos mecanismos fisiopatológicos que conducen a la anemia asociada a la enfermedad renal en 2 modelos murinos de proteinuria.enfermedad del riñoncon grave deterioroFunción del riñón. Nuestro estudio demuestra que en estos modelos, la anemia es el resultado de una vida útil reducida de los glóbulos rojos provocada por la exposición a PS y la eliminación fagocítica acelerada. Curiosamente, la anemia en estos ratones se desarrolló a pesar de la eritropoyesis estimulada, lo que sugiere que la vida útil reducida de los glóbulos rojos, a través del aumento de la muerte celular de los glóbulos rojos, podría ser una explicación alternativa para estos hallazgos. A diferencia de los pacientes con CKD y anemia (Figura 77), ambos modelos de ratón se caracterizaron por una mayor concentración de EPO en plasma. Esto se puede suponer por la preservación de la capacidad secretora de EPO en estos modelos que probablemente respetan las células secretoras de EPO ubicadas en el intersticio del riñón. Sin embargo, el aumento de la secreción de EPO en estos modelos no invalida la conclusión de que la muerte celular de los glóbulos rojos es un factor importante en la patogenia de la anemia asociada a la enfermedad renal. Por el contrario, la estimulación de la eritropoyesis por el aumento de la secreción de EPO puede considerarse como un mecanismo compensatorio del aumento de la muerte de glóbulos rojos inducida porinsuficiencia renalen estos modelos. En este sentido, recientemente se observó un aumento de la eritropoyesis extramedular con aumento del volumen del bazo en otro modelo de ratón proteinúrico con anemia.³⁸

En pacientes con ERC proteinúrica y anemia concomitante, también observamos un mayor porcentaje de glóbulos rojos expuestos a PS junto con niveles más altos de especies reactivas de oxígeno y ceramida. Esto sugiere que la muerte acelerada de glóbulos rojos podría estar involucrada en la patogenia de la anemia asociada a la enfermedad renal en la ERC humana. Las concentraciones plasmáticas de EPO y el índice de producción de reticulocitos no aumentaron en pacientes anémicos con CKD, lo que indica una reducción de la eritropoyesis, que junto con la muerte de glóbulos rojos se espera que agrave la anemia asociada a la enfermedad renal. Las razones de la pérdida de secreción de EPO del riñón en la ERC humana siguen sin estar claras. Sorprendentemente, aunque no todos los pacientes con TFG normal tenían anemia, aquellos con TFG reducida estaban todos anémicos, lo que apunta a un efecto de la ERC avanzada y de larga duración. En particular, el déficit relativo de EPO en la ERC se puede superar mediante el uso de la nueva clase de inhibidores de la prolil hidroxilasa,³⁹lo que sugiere la detección de oxígeno perturbada como una posible causa de la hiposecreción de EPO.

CistanchemejorarFunción del riñóns y ayuda con la ERC.

Nuestros datos demuestran una menor deformabilidad de los glóbulos rojos en ambos modelos de nefropatía proteinúrica en ratones, lo que puede estar directamente relacionado con niveles elevados de Ca2+ citoplasmático.⁴⁰ Juntos, estos mecanismos podrían actuar en conjunto para facilitar la inducción de la muerte de células RBC y la eliminación de RBC senescentes y lesionados de la circulación sanguínea.¹⁵Además, observamos una reprogramación metabólica en estas células, indicativa de estrés oxidativo y remodelación de lípidos de membrana. Aunque la CoA y la acil-CoA no se midieron directamente en estas muestras, se convierten activamente en acilcarnitinas en los glóbulos rojos mediante la carnitina palmitoil transferasa.³⁶Los niveles acumulados de la última clase de compuestos indican la activación de estos mecanismos en la nefropatía, ya que estos metabolitos no se transportan fácilmente a través de las membranas de los glóbulos rojos.⁴¹ Como apoyo adicional, observamos la acumulación en ambos modelos de precursores de CoA, incluido el pantotenato, que se absorbe⁴²y metabolizado⁴³por los glóbulos rojos, en paralelo con el aumento de los ácidos grasos libres y la disminución de la carnitina libre. Curiosamente, previamente encontramos que estas alteraciones ocurren en asociación con niveles suprafisiológicos de Ca2+ intracelular.¹⁶Aunque esos resultados se generaron ex vivo, aquí informamos respuestas similares in vivo. Además, las acilcarnitinas son capaces de modular directamente las propiedades de la membrana.⁴⁴y se correlacionan con la deformabilidad de RBC^,45, así como hemólisis osmótica y oxidativa.⁴⁶La carnitina libre no conjugada promueve la deformabilidad de la membrana a través de la mediación de interacciones entre proteínas de membrana.⁴⁷ Nuestras observaciones de niveles significativamente reducidos de carnitina en glóbulos rojos de ratones con nefropatía, presumiblemente debido a un mayor consumo para la generación de acilcarnitinas, pueden contribuir a los parámetros reológicos deteriorados que observamos en paralelo.

Nuestros hallazgos sugieren mecanismos comunes que conducen a la muerte de glóbulos rojos en ratones con deficiencia tanto de DIN como de podocina, lo que puede estar relacionado tanto con la proteinuria de rango nefrótico como, lo que es más importante, con el desarrollo deinsuficiencia renalen los modelos de ratón observados a partir del día 20. En humanos, la ERC avanzada con TFG reducida es un fuerte predictor de anemia,⁴⁸y la estimulación de la muerte de glóbulos rojos podría estar relacionada con el medio urémico. Uno tiene que reconocer que en la ERC avanzada, muchos factores y trastornos pueden entrar en juego y promover la anemia asociada a la enfermedad renal. La contribución de la proteinuria intensa a la estimulación de la muerte de los glóbulos rojos sigue sin estar clara, pero, aunque no está probada, podría involucrar factores que se pierden en la orina, como la transferrina u otros que regulan el metabolismo de los glóbulos rojos.⁴⁹Hasta el momento, el tratamiento actual de la anemia asociada a la enfermedad renal se centra en aumentar la eritropoyesis mediante la sustitución de hierro o EPO,⁵⁰mediante la aplicación de estabilizadores orales de proteínas del factor inducible por hipoxia,⁵¹o por administración oral o intravenosa de hierro.⁵²Sin embargo, estos tratamientos no tienen en cuenta el aumento de la muerte de glóbulos rojos. En un estudio transversal previo en pacientes de hemodiálisis y diálisis peritoneal, encontramos que los pacientes con un mayor porcentaje de glóbulos rojos expuestos a PS fueron tratados con dosis más altas de EPO.¹⁴ Por lo tanto, la mejora de la muerte celular de los glóbulos rojos promete ser un posible enfoque terapéutico en el tratamiento de la anemia asociada a la enfermedad renal. En este contexto, el efecto inhibitorio de varios agentes farmacológicos sobre la muerte de células RBC53 requiere más estudios en humanos y animales.

En conclusión, el metabolismo celular alterado contribuye a la disfunción de los glóbulos rojos, aumenta la muerte de los glóbulos rojos y, por lo tanto, la anemia en modelos de ratón con ERC proteinúrica, a pesar del aumento de los niveles séricos de EPO. Los hallazgos de este estudio pueden explicar en parte los mecanismos de anemia asociados con la ERC en humanos.

Cistanche beneficiosfunciones renales y ayuda con la ERC.

DIVULGACIÓN

Aunque sin relación con el contenido de los artículos, ADA y TN son fundadores de Omix Technologies, Inc. Todos los demás autores declararon no tener intereses en competencia.

DECLARACIÓN DE DATOS

Los datos estarán disponibles a petición razonable.

EXPRESIONES DE GRATITUD

Los autores agradecen la asistencia técnica experta de Andrea Janessa. Estos estudios fueron apoyados por una subvención de la Fundación Alemana de Investigación a RB (BI 2149/2-1) y FA (AR 1092/2-2). LS recibió el apoyo de una beca Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) de la facultad de medicina de la Universidad de Tübingen. SMQ fue apoyado por recursos de Canadian Blood Services. Como condición para la financiación del gobierno canadiense, este informe debe contener la declaración "Las opiniones expresadas en este documento no representan necesariamente la opinión del gobierno federal de Canadá".

CONTRIBUCIONES DE AUTOR

RB y FA diseñaron el estudio. La recopilación de datos fue realizada por RB, TN, MG, TD, DE, MW, LS, MX, JMB, MZK, KO, LK, IG-M y BF.

Los análisis estadísticos fueron realizados por RB, TN, MG, TD, LS, JMB, LK, IG-M y ADh; y las cifras fueron generadas por RB, TN, MZK, IG-M, LQ-M, BF y ADh. RB, TN, ADA, MG, BNB, LS, COMO, TB, MS, ALB, FG, SMQ,

y FA interpretó los datos. El manuscrito fue escrito, revisado y editado por RB, TN, ADA, MG, BNB, TB, ALB, FG, SMQ y FA.

MATERIAL SUPLEMENTARIO

Archivo complementario (PDF)

Materiales y métodos complementarios.

Figura S1. Diseño experimental de los estudios en ratones 129S1/SvImJ y Nphs2Dipod.

Figura S2. Eliminación de la expresión de podocina y características del síndrome nefrótico en ratones Nphs2Dipod.

Figura S3. Reducción de la tasa de supervivencia de glóbulos rojos en el síndrome nefrótico experimental en ratones Nphs2Dipod.

Figura S4. Morfología alterada y deformabilidad reducida de glóbulos rojos en ratones Nphs2Dipod.

Figura S5. La metabolómica indica la acumulación de estrés oxidativo y la activación de la remodelación de lípidos de membrana dentro de los glóbulos rojos en ratones Nphs2Dipod.

Figura S6. La metabolómica indica un metabolismo alterado dentro de los glóbulos rojos obtenidos de ratones 129S1/SvImJ.

Figura S7. La metabolómica indica un metabolismo alterado dentro de los glóbulos rojos recibidos de ratones Nphs2Dipod.

Figura S8. El esfuerzo cortante a la mitad de la deformabilidad máxima de glóbulos rojos (RBC) y la sensibilidad osmótica de RBC no son significativamente diferentes en el síndrome nefrótico primario y en pacientes avanzados con enfermedad renal crónica (CKD).

REFERENCIAS

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