Parte 2 El liposoma de glucósido de feniletanol inhibe la activación de HSC inducida por PDGF a través de la regulación de la vía de señalización FAKPI3KAkt

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4. Materiales y Métodos

4.1. Materiales

CPhGs (glicósido feniletanoide de cistanche)se adquirieron de Hetian Di Chen Medical Biotechnology Co., Ltd. (Xinjiang, China). el contenido de laequináceafue más del 35 por ciento, y la del acteósido fue más del 16 por ciento. La lecitina se adquirió de Shanghai Lanji Technology Co., Ltd. (Shanghai, China). 1,2-dipalmitoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (DPPC) y colesterol fueron suministrados por Avanti Polar Lipid Inc. (Birmingham, AL, EE. UU.). Shanghai Zhongqiaoxinzhou Biotech (Shanghai, China) proporcionó una célula estrellada hepática de rata inmortalizada. El medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) se compró a Thermo Fisher Scientific, Inc. (Waltham, MA, EE. UU.). El suero bovino fetal (FBS) se adquirió de Gibco Life Technologies (Waltham, MA, EE. UU.). La penicilina (100 µg/ml) y la estreptomicina (100 µg/ml) eran productos de Thermo Fisher Scientific, Inc. MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il){ {13}},5-bromuro de difeniltetrazolio] (5 mg/ml) se adquirió de Sigma (Oakville, ON, Canadá). La actividad de LDH se evaluó utilizando un kit de ensayo de LDH de Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd. (Beijing, China). El kit I de detección de apoptosis con anexina V de FITC y el tampón de tinción de RNasa/yoduro de propidio (PI) se compraron a BD Biosciences (San Diego, CA, EE. UU.) y R&D Systems (Minneapolis, MN, EE. UU.) proporcionó rrPDGF-BB. El reactivo TRIzol se compró a Thermo Fisher Scientific, Inc. El kit de síntesis de ADNc de primera cadena RevertAid fue un producto de Thermo Fisher Scientific, Inc. (Vilnius, Lituania). TB Green Premix Ex Taq TM II se adquirió de Takara (Dalian, China). La solución de pirólisis Ripa fue proporcionada por Thermo Fisher Scientific, Inc. El fluoruro de fenilmetilsulfonilo inhibidor de proteasa y la mezcla inhibidora de fosfatasa de amplio espectro se compraron a Boster Biological Technology Co., Ltd. (Wuhan, China). Las bandas de proteínas se visualizaron mediante un sustrato de transferencia de Western Pierce™ ECL, proporcionado por Invitrogen (Carlsbad, CA, EE. UU.). La enzima de rábano picante que marca la IgG anti-conejo de cabra se adquirió de Zhongshan JinQiao Shanghai Co., Ltd. (Shanghai, China). El kit de prueba Super Signal West Femto fue suministrado por Thermo Fisher Scientific, Inc. Anti-p-actina de conejo, a-SMA, colágeno-1, FAK, PI3K, fosfo-PI3K, Akt y el anticuerpo fosfo-Akt todos fueron adquiridos de Beijing Bioss Antibodies Biological Co., Ltd. (Beijing, China). El X-3-FAK y el X-3-NC se compraron a Shanghai GenePharma Co., Ltd. (Shanghai, China). La Lipofectamine 2000 fue proporcionada por Invitrogen.

4.2. Preparación de los liposomas CPhG

Se disolvieron lecitina, DPPC y colesterol (1:2:2, m/m/m) en una mezcla de cloroformo y metanol (2:1 v/v), se rotaron para formar una película a 49-50 grados, yCPhG(glucósido feniletanoide de cistanche)(250 μg/ml) se añadieron posteriormente. La solución reactiva se hizo rotar e hidratar continuamente, y la membrana de fosfolípidos se transfirió al agua para formar liposomas CPG. El proceso de liposoma encapsulado se repitió de acuerdo con los métodos anteriores. Para obtener un liposoma uniforme, el liposoma encapsulado se extruyó 5 veces con una membrana microporosa de 0,45 µm y se filtró 18-20 veces con una membrana de 0,22 µm. Los liposomas CPG se almacenaron a 4 grados. La distribución del tamaño de partícula se midió mediante un analizador de tamaño de partícula láser, la forma de partícula se observó mediante microscopía electrónica de transmisión y la carga de fármaco y la eficiencia de encapsulación se determinaron mediante HPLC.

4.3. Liberación in vitro del liposoma CPG y CPhG(glucósido feniletanoide de cistanche)

El perfil de liberación in vitro de los liposomas CPG yCPhG(glucósido feniletanoide de cistanche) se llevó a cabo mediante el método de la membrana de diálisis. Se transfirió un total de 5 ml de cada muestra a una bolsa de diálisis con un peso molecular de corte de 14,000 Da. La bolsa de diálisis se sumergió en 20{{10 }} mL de solución amortiguadora de PBS (pH=6.0) vibró a 37 grados. El medio de liberación (3 mL) se retiró y se reemplazó con una solución tampón de PBS isopícnica (pH=6.0) a intervalos de tiempo programados (0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 24 y 48). h). Las concentraciones del equinacósido en los liposomas CPG yCPhGen el medio de liberación fueron determinados por

HPLC. La liberación acumulada (porcentaje) de los liposomas CPG yCPhG(glucósido feniletanoide de cistanche) se calculó utilizando la siguiente Ecuación (1):

donde Cn es la concentración de fármaco en el medio de liberación en el enésimo punto de muestreo, V es el volumen del medio liberado y W es la dosis total.

Para comprender mejor la característica de liberación in vitro de laCPhG(glucósido feniletanoide de cistanche) liposoma yCPhG, se aplicaron tres modelos diferentes para ajustar los datos de liberación obtenidos: (a) el modelo cinético de orden cero, (b) el modelo cinético de primer orden y (c) el modelo Higuchi dado en las Ecuaciones (2)-(4) :

donde Mt/Mo es la fracción de curcumina liberada de la muestra en el tiempo t, y k es la constante de liberación de los diferentes modelos. El coeficiente de correlación se calcula para ilustrar el grado de ajuste entre el modelo de liberación y los datos.

4.4. citotoxicidad

Para las HSC, se sembró una densidad de 1 x 105 células/ml en 96-placas de pocillos y se dejó crecer durante la noche a 37 grados en una incubadora con CO2 al 5 %. La vitalidad celular se probó en una amplia gama deCPhGconcentraciones de liposomas (117,79,58,90, 29,45, 14,72, 7,36, 3,68,1,84, 0,92 y 0,46 卩g/mL) para detectar la vitalidad de las células de prueba y calcular los valores de IC50. Luego, las células se incubaron a 37 grados durante 4 h con 20 µL de MTT (5 mg/mL en solución de PBS). El producto producto MTT púrpura se disolvió en 150 µl de DMSO y se usó un lector de absorbancia de espectro Multiskan (Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU.) para medir el absorbente a 490 nm. Se utilizó la siguiente fórmula (Ecuación (5)) para calcular el porcentaje de viabilidad celular:

4.5. Toxicidad celular de los liposomas CPhG en HSC

Las células se sembraron en 6-placas de pocillos y la toxicidad de las HSC se midió utilizando un kit de detección de LDH. Las células se colocaron en placas a una densidad de 2 x 105 células/pocillo en 6-placas de pocillos a 37 grados en una incubadora con 5 por ciento de CO2. Después del crecimiento durante la noche, las células se trataron conCPhGliposomas (29,45, 14,72 y 7,36 µg/ml). Simultáneamente se mantuvo un control en blanco (medio DEME). Después de 24 h, las células se recogieron por tripsina y centrifugación. Cada grupo de células se administró estrictamente de acuerdo con las instrucciones del kit. Luego se calculó la tasa de fuga de LDH del fluido de cultivo celular.

4.6. Análisis de apoptosis

Las células se cultivaron en 6-placas de pocillos con una densidad de 2 x 105 células/pocillo a 37 grados en una incubadora con 5 por ciento de CO2. Después del crecimiento durante la noche, las células se trataron conCPhGliposomas (29,45, 14,72 y 7,36 µg/ml) y, a continuación, se midió la apoptosis de las HSC con el kit de detección de apoptosis de anexina V FITC. Las concentraciones se basaron en la IC50 determinada a partir del ensayo de citotoxicidad. Simultáneamente se mantuvo un control en blanco (medio DEME). Después de 24 h, las células se recogieron mediante tripsina y centrifugación, se lavaron con PBS y se suspendieron en 500 µl de tampón de unión. Luego, las células se tiñeron con 5 µL de Anexina V-FITC y 5 µL de PE. Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad y la tasa de apoptosis se midió con un citómetro FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, EE. UU.).

4.7. Análisis de detención del ciclo celular

Las HSC (2 X 105 células/2 ml/pocillo) se trataron durante 24 h conCPhGliposomas a 29,45, 14,72 y 7,36 ^g/ml en 6-placas de pocillos. Simultáneamente se mantuvo un control en blanco (medio DEME). Las células se recogieron y se lavaron con 1 ml de PBS y se fijaron con etanol al 75 por ciento durante la noche a 4 grados. A continuación, las células se centrifugaron y se resuspendieron en soluciones al 500 de yoduro de propidio (PI)/tampón de tinción de ARNasa a 37 grados durante 30 min en la oscuridad. Finalmente, las células se midieron utilizando un citómetro FACSCalibur (Becton Dickinson). Las proporciones de las células en las fases G0/G1, S y G2/M del ciclo celular se analizaron mediante el software FACS Diva (Becton Dickinson).

4.8. Efecto de laCPhG(glucósido feniletanoide de cistanche) Liposoma en la vía de señalización FAK y PI3K/Akt mediada por PDGF

4.8.1. Ensayo de proliferación

Las líneas HSC (1 X 105 células/ml) se sembraron en 96-placas de pocillos y se dejaron crecer durante la noche a 37 grados en una incubadora con CO2 al 5 por ciento. Después de 24 h de cultivo celular, las células se dividieron al azar en los siguientes cinco grupos: un control en blanco (cultivado en DMEM que contenía solo 10 por ciento de FBS), PDGF-BB (cultivado en DMEM que contenía 50 µg/L de PDGF-BB), aCPhGintervención de liposomas (estimulados con medio que contiene 50 µg/mL de PDGF-BB 24 h). Luego, las células se trataron con 29,45, 14,72 y 7,36 µg/ml de liposomas CPhG. Las células se cultivaron continuamente durante 24 h, 48 h y 72 h en la incubadora a 37 grados durante 4 h con 20 rL de MTT (5 mg/mL en solución de PBS). El producto púrpura de MTT-formazán se disolvió en 150 rl de DMSO y se estimó midiendo la absorbancia a 490 nm en un lector de absorbancia Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific, Inc.) y se calculó la IC50. Se corrieron muestras por cuadruplicado para cada concentración en cuatro experimentos independientes. La siguiente fórmula (Ecuación (6)) calculó el porcentaje de viabilidad celular:

4.8.2. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)

Las células se sembraron en {{0}}placas de pocillos con una densidad de 1 X 105 células/ml. Este método de agrupación es el mismo que el anterior. Después de 24 h, el ARN total se extrajo de las células cultivadas con un reactivo TRIzol. La concentración y la pureza del ARN se midieron a 260/280 nm usando un espectrofotómetro ultravioleta de acuerdo con la relación estándar OD260/OD280 de 1.8-2.0. Las reacciones de transcripción inversa se transcribieron de forma inversa a partir del ARN utilizando el kit de síntesis de ADNc de la primera cadena RevertAid. Se usó TB Green Premix Ex TaqTM II para medir la expresión génica. La qRT-PCR se realizó con un sistema de PCR en tiempo real ABI QuantStudio™6 Flex (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). Las secuencias de cebadores fueron sintetizadas por Sangon Biotech (Shanghai, China) (Tabla 4).

4.8.3. Análisis de Western Blot

Las proteínas totales extraídas de HSC en diferentes grupos se prepararon como se describió anteriormente. Brevemente, las proteínas similares se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 10 por ciento (SDS-PAGE) y luego se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Baden-Wurtemberg, Alemania). Luego, las membranas de PVDF se bloquearon en BSA al 3 por ciento y se incubaron durante la noche a 4 ◦C con los anticuerpos primarios. Al día siguiente, se añadió IgG anti-conejo de cabra marcada con HRP (dilución 1:25, 000; 1 h). Las bandas de proteínas se visualizaron a través de un sustrato de transferencia Western Pierce™ ECL y se tomaron imágenes usando el sistema de imágenes FluorChem E (Protein Simple, San Francisco, CA, EE. UU.), que se normalizaron con -actina como control interno.

4.8.4. Experimentos de sobreexpresión FAK

Las células se dividieron en el grupo de control de medio normal, el grupo de estimulación de PDGF-BB, el grupo de estimulación de PDGF-BB más X-3-FAK, el grupo de estimulación de PDGF-BB más X-3-NC, el grupo de PDGF-BB -Estimulación BB más X-3-FAK másCPhGgrupo de liposomas, y la estimulación rrPDGF-BB más X-3-NC másCPhGgrupo de liposomas. Las líneas HSC (1 × 105 células/ml) se sembraron en 6-placas de pocillos y se dejaron crecer durante la noche a 37 ◦C en una incubadora con CO2 al 5 %. Al día siguiente, se añadieron y cultivaron células PDGF-BB (cultivadas en DMEM que contenía 50 µg/l de PDGF-BB). Al tercer día, pEX-3-FAK y X-3-NC se diluyeron en un medio libre de antibióticos, se mezclaron bien con lipofectamine 2000 y se dejaron reposar a 37 ◦C durante 20 min, antes de agregarlos. a cada pocillo de las células a 37 ◦C. Después de 5 h de incubación, se reemplazó el medio que contenía suero al 10 por ciento durante 48 h y, al quinto día, se reemplazó el medio con la concentración de liposoma CPhG de 29,45 µg/mL durante 24 h. Luego, cada pocillo se recolectó en el segundo, tercer, quinto y sexto día y se detectaron las expresiones de las proteínas génicas FAK, PI3K, Akt, p-PI3K y p-Akt.

4.9. Análisis estadístico

Los datos se expresaron como media ± desviación estándar (DE). Se utilizó el software SPSS 16.0 (IBM, Nueva York, NY, EE. UU.) para los análisis estadísticos. La significación de la diferencia se calculó mediante una prueba ANOVA de una vía y seguida de una prueba LSD. La ecuación de disolución del fármaco fue ajustada por Origin 8.5 (OriginLab, Northampton, MA, EE. UU.).

5. Conclusiones

En conclusión, nuestros resultados demuestran queCPhG(glucósido feniletanoide de cistanche) Los liposomas inhiben significativamente la activación de las HSC, atenuando notablemente el desarrollo de fibrosis hepática al aumentar la apoptosis y regular el ciclo celular en las HSC. La inhibición de la activación de las vías de señalización FAK/PI3K/Akt puede ser el mecanismo subyacente por el cual elCPhGlos liposomas protegen contra la enfermedad hepática crónica asociada con la fibrosis. Estos hallazgos brindan nuevos conocimientos sobre los mecanismos de esta nueva formulación de fármaco como candidato antifibrogénico para el futuro tratamiento de la fibrosis hepática. Sin embargo, los mecanismos subyacentes son más complejos de lo que se describe aquí, y nuestros resultados no excluyen la posible participación de otros dispositivos causados ​​por laCPhGliposomas para tratar la fibrosis hepática.

Contribuciones de autor:TL, JZ, S.-PY, LM y S.-LZ concibieron y diseñaron los experimentos. S.-LZ, S.-PY, TL, JZ, X.-TM y X.-YY analizaron los datos. S.-LZ y JZ escribieron el manuscrito. TL, LM y JZ revisaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Fondos:Esta investigación fue financiada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, número de subvención 81560628.

Expresiones de gratitud:Este trabajo fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 8156140127). Los autores desean expresar su más sincero agradecimiento a Jun Zhao y Xin Wang por mejorar la redacción de este documento.

Conflictos de interés:Los autores no reportan declaraciones de interés.

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