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2.6. Efectos antiapoptóticos de las citoquininas determinados por mediciones de actividad de caspasa-3/7

Como muestran los ensayos de tinción de PI descritos anteriormente, SAL indujo aumentos en las tasas de muerte de las células SH-SY5Y. Como SAL se asocia tanto con la apoptosis como con la necrosis [51], también investigamos la activación de caspasa-3 y 7 (casp-3/7) como marcador específico de apoptosis (fase de ejecución) [52] después de exponer las células a las CK. Las actividades de caspasa-3/7 registradas después del tratamiento con cada uno de los compuestos de prueba se normalizaron con respecto a las registradas después del tratamiento con 50{{30}} uM SAL (establecido como 100 por ciento). Como se muestra en la Figura 4, el conocido inhibidor de caspasa Ac-DEVD-CHO (incluido como un control específico relacionado con la apoptosis) inhibió fuertemente la actividad de la caspasa-3/7 en concentraciones submicromolares (hasta 36,3 ± 2,66 y 25,2 ± 2,69 por ciento de los niveles en células tratadas con SAL solo a 0,05 y 0,5 uM, respectivamente). Previamente se han observado niveles similares de inhibición [53] en diferentes modelos de neurodegeneración basados ​​en células SH-SY5Y in vitro. El NAC de control positivo también redujo significativamente la actividad de caspasa-3/7, a 88,7 ± 1,87 por ciento y 78,5 ± 2,56 por ciento de los niveles inducidos por SAL a 100 uM y 1000 uM, respectivamente. Las CK probadas tuvieron una amplia gama de efectos en las actividades de caspasa-3/7. Curiosamente, de los ribósidos de CK, solo cZR tuvo efectos significativos en las actividades a 0,1 uM (reduciéndolos a 83,3 ± 4,33 por ciento de los niveles inducidos por SAL, respectivamente), mientras que iPR a 1 uM no produjo una reducción significativa de casp-3 ,7. Finalmente, K3G disminuyó la actividad de caspasa-3/7 con un efecto máximo a 10 uM (a 81,7 ± 4,31 por ciento del nivel inducido por SAL). En general, SAL indujo un aumento de 1.6-veces en la actividad de la caspasa-3/7 en comparación con las células de control sanas (CTR, Figura 4), de acuerdo con los resultados de un estudio anterior, en el que un Se utilizaron concentraciones de SAL (400 uM) y la misma línea celular [54]. Se sabe que la NAC influye en la actividad de la caspasa-3/7 en varios modelos deneuronalesmuerte [55-58]. Sin embargo, los resultados presentados aquí proporcionan la primera demostración de su caspasa-3/7 en un modelo inducido por SAL basado en células SH-SY5Y deneuronalesmuerte. El control positivo redujo la actividad de caspasa-3/7 inducida por SAL 500 uM de manera similar a las CK, pero cZR y K3G fueron efectivos incluso en concentraciones submicromolares o micromolares. Otros estudios con modelos de estrés asociados con la EP (inhibidor del proteasoma MG 132- o H2O2-toxicidad inducida en células SH-SY5Y [17] y fibroblastos [15]) y la enfermedad de Huntington (modelo de inanición de suero en Las células PC12 [19]) también han demostrado que las CK K y tZR pueden tener actividades antiapoptóticas (caspasa-3) [17], y que tanto K como tZR pueden tener actividades antisenescencia [17,19] . Además, las asociaciones entre la disminución de casp-3,7 activación yneuroprotectorSe informaron actividades para SAL y modelos relacionados con SAL [54,59,60].

Figura 4. Actividad de caspasa-3/7 en el modelo de EP inducido por SAL. Triplica en al menos cuatro días independientes. * P comparado con el vehículo con 500 uM SAL, # P comparado con el vehículo sin 500 uM SAL.

2.7. Identificación de la actividad neuroprotectora de la citoquinina en el modelo CellDeath inducido por glutamato

Como las células SH-SY5Y no expresan todas las subunidades del receptor NMDA [61], el mecanismo más probable de toxicidad del glutamato (Glu) es el bloqueo del antiportador cistina/glutamato Xc con inducción masiva de estrés oxidativo [62]. Autores anteriores ya han demostrado una asociación entre la muerte celular inducida por glutamato y la necroptosis en células SH-SY5Y [63], y la importancia de la activación de caspasa-3 en la toxicidad inducida por glutamato hacia ellas [62,64]. Varios estudios también han demostrado la aparición de muerte celular provocada por el hierro (ferroptosis) después de la intoxicación con glutamato [62,65,66] e indicaron la aparición de tres tipos de muerte celular (necroptosis, apoptosis y ferroptosis) después del bloqueo de la Xc -sistema antiportador. Con el fin de completar una evaluación integral de laneuroprotectorpotencial de la pruebacitoquininas, el sistema de ensayo de muerte celular inducida por glutamato se incluyó en un panel analítico con el conocidoneuroprotectorquelante de hierro deferoxamina (DFO) e inhibidor de la necroptosis necrostatina-1 (NEC-1) [67] como controles positivos. Aquí, las células SH-SY5Y se diferenciaron durante 48 h, luego se trataron con Glu 160 mM o en co-tratamiento de las mismas con varioscitoquininaconcentraciones ({{0}}.1–10 uM) durante 24 h y teñidas por PI. En este modelo, el efecto de Glu sobre la muerte celular fue del 100 por ciento de la señal de PI, por lo que se evaluó la reducción de la muerte celular por los compuestos de prueba. Glu indujo un aumento de casi 4-veces en la muerte celular en comparación con los controles sanos SH-SY5Y (26,1 ± 0,42 por ciento). Cribado de controles positivos ycitoquininasreveló que ambos controles positivos NEC-1 (50 uM, 76,6 ± 2,51 por ciento) y DFO (10 uM, 84,2 ± 4,54 por ciento) redujeron la muerte celular inducida por glutamato. Como se muestra en la Figura 5A, desde el panel decitoquininas, solo trescitoquininasfueron capaces de protegerneurona-como las células SH-SY5Y de forma similar a los controles positivos. el mas activocitoquininasfueron trans-zeatina (tZ) (0.1 uM, 79.5 ± 2.91 por ciento; 1 uM, 81.3 ± 2.77 por ciento) y cis-zeatina (CZ) (0.1 uM, 82.1 ± 3.29 por ciento; 1 uM, {{20}}.2 ± 2.89 por ciento) y cinetina (K) (1 uM, 88.0 ± 3.76 por ciento; 10 uM, 79.9 ± 3,44 por ciento). Para confirmar su actividad prometedora, se utilizó un ensayo ortogonal para dilucidar con más detalle los efectos biológicos de las CK en este modelo: un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) [68], que también mostró un aumento espectacular (4-veces) aumento de la toxicidad después del tratamiento con Glu. Curiosamente, la determinación de la liberación de LDH nos permitió diferenciar entre las actividades de las CK y los controles positivos (NEC-1 y DFO). Las CK tenían una actividad protectora moderada pero significativa (tZ redujo las tasas de mortalidad a 91,9 ± 1,40 por ciento a 0,1 uM; cZ las redujo a 92,3 ± 1,15 por ciento a 0,1 uM y 91,7 por ciento ± 1,56 por ciento a 1 uM; K las redujo a 92,2 ± 1,06 por ciento a 1 uM). Los controles positivos NEC-1 y DFO tuvieron efectos protectores más fuertes pero fueron efectivos en concentraciones mucho más altas (reduciendo las tasas a 76,9 ± 2,94 por ciento y 81,6 ± 3,74 por ciento a 50 y 10 uM, respectivamente) (Figura 5B). El ensayo LDH validó las indicaciones obtenidas con la tinción PI y los efectos observados de los controles positivos fueron consistentes con los datos publicados [69,70]. Los hallazgos sobre los efectos de K en el modelo de muerte celular inducida por Glu en células HT22 [18] y nuestras observaciones de los efectos de CK representativas como tZ, cZ y K muestran que las CK son candidatas prometedoras para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas asociadas con el estrés oxidativo [18]. 71]. Finalmente, se prefirieron tZ y cZ porque eran efectivos en concentraciones más bajas y se seleccionaron, junto con K, para estudios adicionales de sus efectos sobre los niveles de estrés oxidativo y la activación de caspasa-3,7.

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2.8. Efectos de las citoquininas sobre el estrés oxidativo inducido por Glu en células SH-SY5Y

A diferencia del modelo anterior, Glu puede inducir estrés oxidativo en células SH-SY5Y por diferentes vías. Uno se basa en el bloqueo del antiportador cistina/glutamato (Xc-), lo que conduce al agotamiento del glutatión (GSH) y a efectos negativos sobre la actividad de la superóxido dismutasa (SOD) [62]. La muerte celular mediada por Glu también involucra supuestamente la formación de ROS (particularmente radical superóxido) impulsada por Rac-NADPH-oxidasa en las células SH-SY5Y [72]. Estos hallazgos indican que la principal causa de muerte celular en el modelo inducido por Glu es OS. Dentro del modelo,neuronaLas células similares se cotrataron con Glu y los compuestos probados, se tiñeron con DHE y se observaron mediante microscopía de fluorescencia. Como se puede ver en la Figura 6A, se observó un aumento dramático en la fluorescencia roja de DHE en las células tratadas con Glu, que mejoró con las sustancias de control positivo y las CK analizadas. Basándose en la observación microscópica, la cuantificación de los niveles de superóxido se realizó en células inducidas por Glu de manera similar, mediante el ensayo de DHE, a aquellas en células inducidas por SAL. Los resultados se normalizaron con respecto a los niveles inducidos por Glu solo (establecidos como 100 por ciento), lo que causó un aumento dramático de casi 3-veces en los niveles de superóxido en solo 4 h enneuronacélulas similares a SH-SY5Y en relación con los niveles en células de control sanas (CTR: 33,79 ± 1,45 por ciento). Como se muestra en la Figura 6B, las CK como tZ, cZ y K redujeron significativamente el nivel de superóxido en las células intoxicadas con Glu: 0.1 uM tZ, 0.1 uM cZ, 1 uM y 10 uM K lo redujo a 81,0 ± 4,03, 80,6 ± 3,89, 81,8 ± 3,39 y 83,8 ± 2,32 por ciento de los niveles en células tratadas con Glu solo. Estos niveles son comparables a los obtenidos con el inhibidor de necroptosis NEC-1 (80,5 ± 3,19 por ciento a 5 uM y 80,4 ± 2,70 por ciento a 50 uM) y el quelante de hierro DFO (80,2 ± 3,80 por ciento a 10 uM). Los resultados obtenidos con el modelo de muerte celular inducida por Glu, particularmente los efectos de los controles positivos, son consistentes con informes previos [70,73]. La evidencia previa de que las CK tienen efectos reductores de OS en modelos inducidos por Glu o similares se limita a una demostración de que K es un potente agente reductor de OS (a aproximadamente 23 uM) en el modelo de muerte celular inducido por Glu basado en células HT22 [18 ]. Descubrimos que K tenía un efecto reductor de OS en concentraciones más bajas (1–10 uM) en nuestras células SH-SY5Y. Además, se han observado efectos benéficos a largo plazo de tZ en fibroblastos humanos, incluida la actividad de descomposición del peróxido de hidrógeno [15], lo que sugiere que tZ y cZ pueden tener efectos indirectos de reducción de OS en modelos de muerte celular inducida por Glu. Además, otros informes señalaron las asociaciones entre el efecto reductor del SG mediado por CK y la actividad protectora [22,74–76]. En conjunto, tZ, cZ y K mostraron efectos reductores de OS sorprendentemente fuertes, comparables a los de los controles positivos, a pesar de las diferentes fortalezas en general.neuroprotectorefecto.

Figura 5. (A) Tasa de mortalidad deneurona-como las células SH-SY5Y en el modelo de muerte celular inducido por glutamato (Glu); (B) Toxicidad inducida por Glu (liberación de LDH) deneurona-como las células SH-SY5Y. Se triplica en al menos tres días independientes.* P comparado con el vehículo con 160 uM Glu, # P comparado con el vehículo sin 160 uM Glu.

Figura 6. (A) Estrés oxidativo (OS) inducido por Glu y actividad reductora de OS de los compuestos indicados en humanosneuronaCélulas similares a SH-SY5Y visualizadas mediante microscopía de fluorescencia después del marcaje con dihidroetidio (DHE). Barras=50 um. Las imágenes muestranneurona-células SH-SY5Y tratadas con DMSO (control), glutamato (Glu) 160 mM solo y junto con: deferoxamina 10 uM (más DFO), necrostatina 50 uM{{6} } (más NEC-1), 0,1 uM tZ (más tZ) y 0,1 uM cZ (más cZ) durante 4 h, luego teñido con DHE. (B) Formación de radicales superóxido inducida por Glu enneurona-como células SH-SY5Y después de 4 h. El gráfico muestra la cuantificación de las células teñidas con DHE utilizando el lector de microplacas Infinite M200 Pro (Tecan, Austria). Triplica en cinco días independientes.

* P comparado con el vehículo con 160 uM Glu, # P comparado con el vehículo sin 160 uM Glu.

2.9. Efectos de las citoquininas sobre la actividad de la caspasa-3/7 en el modelo de muerte celular inducida por Glu

Glu tiene efectos tóxicos similares en las células SH-SY5Y a los efectos informados anteriormente en las células HT22 asociados con el bloqueo del antiportador Xc. Por lo tanto, los mecanismos de muerte celular no apoptóticos (ferroptosis, necroptosis, etc.) están involucrados en ambos casos [62] aunque la expresión de caspasa-3 y, hasta cierto punto, la subunidad NMDA de NR1 puede ocurrir con mayor fuerza en SH -Células SY5Y [61]. Por lo tanto, las etapas finales de muerte celular en las dos líneas celulares pueden diferir. Se ha observado un papel contribuyente de la actividad de la caspasa-3 en muchos estudios en el modelo de muerte celular inducido por Glu de células SH-SY5Y [62,77–79]. En este ensayo,neuronaLas células SH-SY5Y similares se trataron aquí con Glu 160 mM, lo que conduce a una elevación de la actividad de caspasa-3/7. En un esfuerzo por dilucidar el papel de la apoptosis en la muerte inducida por Glu de las células SH-SY5Y, se aplicó un inhibidor específico de caspasa-3/7, Ac-DEVD-CHO, y se encontró que tiene un fuerte efecto inhibidor: A 50 nM redujo la actividad de la caspasa-3,7 a 23,70 ± 1,01 por ciento del nivel en las células tratadas

con Glu solo y a 0.5 uM, bloqueó casi por completo la actividad (reduciéndola a un nivel normalizado de solo 7.22 ± 1.05 por ciento; comparable al nivel observado en células sanas:

7.8 ± 0.39 por ciento), como se muestra en la Figura 7. La aplicación de controles positivos dio como resultado una disminución gradual dependiente de la dosis en la actividad de la caspasa-3,7. Curiosamente, NEC-1 tuvo un ligero efecto con un efecto máximo a 50 uM y DFO tuvo una actividad inhibidora más robusta a 10 uM (reduciendo la actividad a 80,5 ± 1,85 y 75,8 ± 3 .00 por ciento, respectivamente). Por otro lado, tZ a 1 uM (89,5 ± 2,50 por ciento), cZ a 0,1 uM (87,4 ± 1,62 por ciento) y K a 1 uM ( 91,0 ± 2,06 por ciento). Tomados en conjunto, los resultados muestran que ambos controles positivos tenían una actividad de disminución de la actividad de caspasa-3/7 más fuerte que las CK analizadas, pero las CK tenían efectos en concentraciones mucho más bajas. En general, los resultados indican que la modulación de la actividad de la caspasa-3/7 juega un papel clave en la potenteneuroprotectoractividad de agentes como DFO [58] en el modelo de muerte celular inducido por Glu [79,80]. Sin embargo, como se muestra en esta sección, NEC-1 también teníaneuroprotectoractividad, lo que sugiere que otros tipos de muerte celular podrían estar involucrados en la muerte inducida por Glu de células SH-SY5Y similares a neuronas [63,67,81]. También se han obtenido indicaciones de que los mecanismos independientes de la caspasa están involucrados en la muerte celular inducida por Glu en los análisis de los efectos de NEC-1 [70], DFO [69] y K [18] en las células HT22.

Figura 7. Actividad de caspasa-3/7 en modelo Glu de daño oxidativo deneurona-como las células SH-SY5Y. Triplica en al menos cuatro días independientes. * P comparado con el vehículo con 160 uM Glu, # P comparado con el vehículo sin 160 uM Glu.

3 Conclusiones

En resumen, nuestro estudio reveló que las CK y sus metabolitos tienenneuroprotectoractividades en el modelo inducido por SAL deenfermedad de Parkinsony daño oxidativo inducido por Glu en SH-SY5Y humano diferenciadoneuronalescélulas. Se encontró que K3G, cZR e iPR tienen efectos biológicamente significativosneuroprotectoractividades. Además, las CK activas fueron eficaces a concentraciones más bajas (submicromolar y micromolar) que la sustancia de control positivo NAC. K3G, cZR e iPR también tuvieron efectos positivos sobre la viabilidad, la citotoxicidad, el estrés oxidativo y la actividad de la caspasa-3,7 (excepto iPR). Las demostraciones ortogonales indican claramente que la actividad del estrés antioxidante juega un papel clave en los efectos protectores de las CK en el modelo de muerte celular inducida por SAL. Solo tres metabolitos en el panel probado de CK (tZ, cZ y K) protegieronneurona-como las células SH-SY5Y en el modelo de daño oxidativo inducido por Glu de manera similar al quelante de hierro NEC1 y al inhibidor de necroptosis DFO. Para confirmar su actividad prometedora, probamos sus efectos en el ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) ortogonal. Las CK tenían una actividad protectora moderada pero significativa. Esto fue más débil que las actividades correspondientes de las sustancias de control, pero a pesar de las diferencias en la modulación deneuronalessalud, las tres CK probadas estimularon potentes reducciones en la formación de radicales superóxido, de manera similar a las sustancias de control positivo. Las CK también tuvieron efectos sobre el estrés oxidativo inducido por Glu en células SH-SY5Y comparables a los de NEC1 y DFO, pero estos compuestos tuvieron efectos inhibidores más fuertes sobre la actividad de la caspasa-3/7 que las CK. Como la muerte celular inducida por Glu no se basa en una vía dependiente de caspasa, como se muestra en los estudios de los efectos de DFO y NEC-1 en las células HT-22 [70], las CK aparentemente pueden modular tanto la caspasa- muerte celular dependiente e independiente al reducir el estrés oxidativo [18,82]. En estudios en curso, el mecanismo de acción detallado de las CK y/o sus efectos mitocondriales enneuronaleso se investigarán las células de astrocitos.

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4. Materiales y Métodos

4.1. Sustancias químicas y reactivos

citoquininaLos estándares se obtuvieron de OlChemIm (Olomouc, República Checa). La calceína AM (solución de 1 mg/ml) y el kit de liberación de LDH y un kit de crecimiento de Neurite se adquirieron de ThermoFisher. Yoduro de propidio, dihidroetidio, componentes del tampón de ensayo caspasa- 3/7, medio DMEM/F12 1:1, suero bovino fetal, tripsina, ATRA, bromhidrato de salsolinol, sal monosódica de glutamato, deferoxamina, N-acetilcisteína , Ac-DEVD-CHO y DMSO para cultivos celulares se adquirieron de Sigma Aldrich (Merck). El sustrato Ac-DEVD-AMC fue suministrado por Enzo Life Science.

4.2. Ensayos de actividad de barrido de radicales ORAC

La capacidad de los compuestos para eliminar los radicales libres in vitro se determinó mediante el ensayo de Capacidad de Absorción de Radicales de Oxígeno (ORAC). Brevemente, se añadieron fluoresceína (100 ul, 500 mM) y 25 ul de la solución del compuesto analizado a una microplaca de 96-pocillos preincubada a 37oC. A continuación, 25 uL de 250 mM 2,2<-azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride (aaph)="" was="" quickly="" added,="" the="" microplate="" was="" shaken="" for="" 5="" s="" and="" red="" fluorescence="" (with="" 485="" and="" 510="" nm="" excitation="" and="" emission="" wavelengths,="" respectively)="" was="" measured="" every="" 3="" min="" over="" 90="" min="" using="" an="" infinite="" 200="" microplate="" reader="" (tecan,="" männedorf,="" switzerland).="" nauc="" (net="" area="" under="" curve)="" values="" were="" used="" to="" express="" antioxidant="" activities="" relative="" to="" that="" of="" trolox="" (a="" synthetic="" hydrophilic="" analog="" of="" α-tocopherol,="" vitamin="" e).="" substances="" with="" orac="" values="" greater="" than="" zero="" are="" deemed="" to="" actively="" trap="" free="">

4.3. Cultivo celular SH-SY5Y

La línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y adquirida de ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EE. UU.) se cultivó en medio de Eagle modificado por Dulbecco y mezcla de nutrientes F12 de Ham (DMEM: F-12, 1:1 ), suplementado con 10 por ciento de suero bovino fetal (FBS) y 1 por ciento de penicilina y estreptomicina a 37 oC en una atmósfera humidificada con 5 por ciento de CO2. Las células se pasaron hasta 20 veces y los medios se cambiaron dos o tres veces por semana. La densidad celular se estableció según corresponda para el ensayo planificado (5000, 7000, 10 000 o 20 000 células por pocillo) en 96-placas multipocillo en volúmenes totales de 100 uL de medio para cada uno. experimento. El día después de la siembra, se añadió a las células ATRA en medio FBS DMEM/F12 al 1 por ciento hasta una concentración final de 10 uM, y se continuó la incubación durante 48 h más para inducir la diferenciación, permitir la formación de neuritas más largas y reducir proliferación.

4.4. Microscopía

Micrografías deneuronaSe obtuvieron células similares a SH-SY5Y utilizando un microscopio de fluorescencia LED DM IL (Leica Microsystems, Mannheim, Alemania) con un filtro de excitación apropiado para el ensayo, o una configuración de campo claro con una cámara digital de alto rendimiento DP73 (Olympus, Tokio, Japón). ). Dado que la relación señal-ruido para la tinción fue moderada, el contraste se ajustó ligeramente en el software ImageJ (Fiji) sin afectar la observación resultante. Las imágenes originales se incluyen en los Materiales complementarios.

4.5. Tinción de membrana celular (kit de crecimiento de neuritas, Invitrogen™)

NeuronaLas células similares a SH-SY5Y (5000 células por pocillo) obtenidas mediante el procedimiento de diferenciación de 48 h se tiñeron con un kit de crecimiento Neurite (Invitrogen™) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante con modificaciones menores. Las células se lavaron con PBS, se marcaron con una solución del colorante de tinción de membrana suministrado con el kit (siguiendo el protocolo para placas de 96 pocillos múltiples) en PBS durante 20 min a 37 oC, se lavaron nuevamente con PBS y se observaron con un microscopio de fluorescencia ( con longitudes de onda de excitación y emisión de 533 y 585 nm, respectivamente).

4.6. Tratamiento celular

Después del procedimiento de diferenciación, el medio de diferenciación se cambió a medio DMEM/F12 al 1 por ciento complementado con compuestos de prueba en concentraciones de 0.1, 1 y 10 uM (con 7000 células por pocillo para pruebas de citotoxicidad), o junto con la toxina SAL a 500 uM (con 7000–10 000 células por pocillo) o Glu 160 mM (con 20 000 células por pocillo) durante una duración adecuada para el tipo de ensayo (viabilidad, muerte celular, etc.). Las células de control se trataron con un medio que contenía 0,1 por ciento de DMSO.

4.7. Viabilidad celular y muerte celular

La viabilidad deneurona-Las células SH-SY5Y que crecen en microplacas de 96-pocillos (con aprox. 7000 células por pocillo) después de 24 h de tratamientos se evaluaron mediante el ensayo Calcein AM con modificaciones menores [31]. La solución de calceína AM en PBS utilizada tenía una concentración de 0,75 uM y el tiempo de incubación se fijó en 50 min. El número de células vivas en cada pocillo se determinó utilizando un lector de microplacas Infinite M200 Pro (Tecan, Austria), con longitudes de onda de excitación y emisión de 495 y 517 nm, respectivamente.

muerte celular deneurona-células similares (modelo SAL: 10,000 células por pocillo; modelo Glu: 20,000 células por pocillo) se determinó mediante ensayo PI según lo informado por Stone et al. 2003 con pequeñas modificaciones [83]. Brevemente, el medio del modelo inducido por SAL se aspiró y se cambió a una solución de 1 ug/mL de PI en PBS, pero las células sometidas a la inducción con Glu tienen una adherencia más débil, por lo que se agregó una solución de 1 mg/mL de PI en PBS. dar una concentración final de 1 ug/mL. En ambos casos, las células se incubaron durante 15 a 25 min más a temperatura ambiente y luego se midió la fluorescencia de PI con un lector Infinite M200 Pro (Tecan, Grödig, Austria) con 535 y 617 longitudes de onda de excitación y emisión, respectivamente. La fluorescencia de PI resultante obtenida con toxinas solas se fijó como 100 por ciento de muerte celular.

4.8. Medición del estrés oxidativo mediante el ensayo de dihidroetidio (DHE)

Las células se diferenciaron y trataron como se describe en la sección anterior para la inducción de SAL (10,000 células por pocillo, 24 h o la inducción de Glu (20,000 células por pocillo, 4 h). Después los tratamientos, las células se centrifugaron a 500 xg durante 330 s, luego los medios de cultivo se reemplazaron (después de la aspiración) con una solución de DHE 10 uM en PBS. 96-Las placas multipocillo con células se incubaron en la oscuridad durante 30 min a temperatura ambiente. temperatura, luego se midió la fluorescencia de DHE con un lector de microplacas Infinite M200 Pro (Tecan, Grödig, Austria) con longitudes de onda de excitación y emisión de 500 y 580 nm, respectivamente. Se obtuvieron microfotografías de fluorescencia ilustrativas de células teñidas con DHE después de la medición de DHE con el lector de microplacas.

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4.9. Medición de la actividad de Caspase-3/7

Se realizaron ensayos de caspasa-3/7 de un solo paso de acuerdo con un procedimiento publicado previamente [84]. Para los cultivos sometidos a inducción de SAL e inducción de Glu, las mezclas de reacción (caspasa-3, tampón 7 y componentes con células en 96-placas multipocillo) se incubaron durante 2 h y 3 h a 37 oC, respectivamente. A continuación, se midió la actividad de caspasa-3/7 mediante un lector de microplacas Infinite M200 Pro (Tecan, Austria) con longitudes de onda de excitación y emisión de 346 y 438 nm, respectivamente.

4.10. Análisis estadístico

Los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron en tres a cinco (n {{0}}–5) días independientes. Todos los datos se expresan como media ± SEM. Los valores de todas las variables medidas se expresan como medias ± SEM, que se calcularon utilizando Prism 8.4.3 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE. UU.), que también se utilizó para generar las cifras. El análisis estadístico se llevó a cabo mediante el paquete de software PAST (ver. 1.97) [85]. Para el experimento de diferenciación se utilizó la prueba t de Student. El resto de los experimentos se evaluaron mediante la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis con prueba post hoc de Mann-Whitney con corrección secuencial de Bonferroni. Se consideró significativo un valor de p <>

Materiales complementarios: las imágenes originales están disponibles en línea.

Contribuciones de los autores: Las contribuciones de los autores fueron las siguientes: Investigación, metodología, validación, análisis de datos, GG, CWD y JG; redacción—preparación del borrador original GG, CWD y MS; curación de datos, adquisición de fondos, supervisión, redacción: revisión y edición, CWD, MS y PK Todos los autores han leído y están de acuerdo con la versión publicada del manuscrito.

Financiamiento: Este trabajo fue apoyado financieramente en parte por subvenciones de la Agencia de Subvención Interna de la Universidad de Palacky en Olomouc, República Checa (IGA{{0}}PrF_2020_021), la Agencia de Subvención Checa ({{ 2}}S), y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional—Proyecto ENOCH (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/ 16_019/ 0000868) y una beca de estudiante del Fondo de Dotación de la Universidad de Palacky.

Declaración de la Junta de Revisión Institucional: No corresponde.

Declaración de consentimiento informado: No aplicable.

Declaración de disponibilidad de datos: Los datos están contenidos en el artículo o material complementario.

Agradecimientos: Los autores agradecen a Dita Jordovd, Jana Hrubešovd y Lucie Koplikovd por su excelente asistencia técnica. Además, los autores agradecen a Sees-editing Ltd., Reino Unido, por la edición en inglés del manuscrito.

Conflictos de interés: Los autores declaran no tener conflictos de interés.

Disponibilidad de muestras: Los autores no proporcionan muestras de los compuestos.