Parte 3: Un modelo de ratón único de ejercicio en la vida temprana permite la memoria del hipocampo y la plasticidad sináptica

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Materiales y métodos

animales Los ratones de tipo salvaje eran la progenie de las madres C57Bl6J, obtenidas originalmente de Jackson Laboratories y luego criadas en nuestras instalaciones para animales. Los ratones tenían libre acceso a comida y agua y las luces se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Tras el destete en un día postnatal (P) 21, los ratones se alojaron en jaulas con ropa de cama estándar o en jaulas equipadas con una rueda para correr. Se utilizaron ratones machos y hembras para todos los experimentos de ejercicio y comportamiento. Solo se usaron ratones machos para los estudios electrofisiológicos. Todas las pruebas de comportamiento se realizaron durante el ciclo de luz. Los experimentos se realizaron de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. para el cuidado y uso de animales y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, Irvine.

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Paradigma de la rueda de carrera. Tras el destete en P21, los ratones se alojaron en parejas en jaulas estándar sin rueda o se equiparon con una rueda móvil o estacionaria de acero inoxidable (diámetro 4,5 cm, 112 gramos, Starr Life Sciences). Los animales alojados con ruedas rodantes tenían libre acceso durante períodos predeterminados: una semana durante el período juvenil (P21–27; juv ELE), una semana durante la adolescencia (P35–41; Adol ELE) o tres semanas consecutivas de acceso (P21– 41; juv-adol ELE). Un grupo adicional de ratones se alojó con una rueda estacionaria durante P21–41 (sta) para controlar el enriquecimiento ambiental por la presencia de una rueda en la jaula. Cada rueda estaba equipada con una malla ligera de poliuretano para evitar que las pequeñas extremidades de los ratones recién destetados se deslizaran a través de los peldaños de las ruedas. La actividad de carrera se rastreó a través de sensores monitoreados digitalmente conectados a un puerto de datos y una computadora para la adquisición de datos en tiempo real (Vital View Sofware) a través de la detección magnética de las revoluciones de las ruedas. Cada rueda monitoreada digitalmente siguió la distancia de carrera de la jaula (dos ratones alojados por jaula, por lo tanto, la distancia recorrida por jaula representa la distancia total recorrida entre dos ratones). Las revoluciones se cuantificaron por minuto diario durante la duración de la carrera y se convirtieron en distancia recorrida por jaula (km).

Ubicación del objetomemoria(OLM) protocolo. La ubicación del objetomemoriaEl protocolo utilizado en este estudio ha sido adaptado y modificado de protocolos anteriores44. En un día postnatal 36, los ratones fueron llevados a una sala de pruebas con luz ambiental reducida. Los ratones se manipularon durante aproximadamente 2 min cada uno, durante un total de 5 días consecutivos antes de la sesión de entrenamiento OLM (dos veces al día durante los primeros 2 días seguidos de una vez al día durante los siguientes 3 días). Las sesiones de habituación duraron 5 min, dos veces al día durante 3 días (P38-P40) y ocurrieron dentro de cámaras que contenían cuatro señales espaciales únicas en cada pared de la cámara (líneas horizontales, X negra, franja vertical y pared en blanco) . La habituación se superpuso con los últimos 2 días de manejo. Durante la fase de entrenamiento (P41), los ratones se colocaron en las mismas cámaras con dos objetos idénticos y se expusieron a un período de entrenamiento subumbral (3 min) o umbral (10 min); un diseño de estudio basado en trabajos previos que demuestran que 3 minutos de entrenamiento suelen ser insuficientes para el largo plazomemoriaformación45. Para los ratones en jaulas de ejercicio, las ruedas para correr se bloquearon inmediatamente después del entrenamiento OLM para eliminar cualquier efecto agudo del ejercicio enmemoriaconsolidación. El día de la prueba (P42; 24 horas después del entrenamiento), uno de los objetos se movió a una nueva ubicación dentro de la cámara y luego se permitió a los ratones explorar los objetos durante 5 minutos. El tiempo dedicado a cada objeto se determinó a través de un análisis ciego mediante puntuación manual, y los valores obtenidos tanto en los días de entrenamiento como de prueba se convirtieron en un índice de discriminación (DI), basado en la nueva ubicación del objeto durante la prueba: [(tiempo dedicado explorar objeto nuevo – tiempo dedicado a explorar objeto familiar)/(tiempo total explorando ambos objetos) × 100 por ciento]. No hubo diferencias significativas enmemoriarendimiento entre animales sedentarios y aquellos alojados con una rueda estacionaria, por lo que estos grupos se combinaron y representaron como "sin ELE" en todos los análisis OLM. Los ensayos de habituación se analizaron para determinar la distancia recorrida en las sesiones utilizando el software de análisis de comportamiento ANY-maze (Stoelting Co). Se excluyeron del análisis los ratones con tiempos de exploración desiguales entre los dos objetos durante la fase de entrenamiento (DI > 20) o que no mostraron disminución en la distancia total recorrida en las sesiones de habituación.

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estudios de electrofisiología. Los experimentos de electrofisiología se realizaron como se describió anteriormente, y la fuente de estos métodos se ha publicado en otra parte66. Solo se usaron ratones machos para experimentos electrofisiológicos. En resumen, se sacrificaron ratones macho de todos los grupos ELE entre P42 y 51, y se recolectaron cortes del hipocampo rostral. Los cortes coronales se seccionaron (Leica VT1000 S) a 320 um de espesor y se colocaron en una cámara de registro de interfaz con líquido cefalorraquídeo artificial precalentado (31 ± 1 grado) (NaCl 124 mM, KCl 3 mM, KH2PO4 1,25 mM, MgSO4 1,5 mM, CaCl2 2,5 mM, NaHCO3 26 mM y d-glucosa 10 mM). Los cortes se perfundieron continuamente a una velocidad de 1,75 a 2 ml por minuto, mientras que la superficie de los cortes se expuso a 95 % de O2/5 % de CO2 tibios y humidificados. Los registros comenzaron después de al menos 2 h de incubación. Los potenciales postsinápticos excitadores de campo (fEPSP) se registraron a partir del estrato radiante CA1b utilizando una pipeta de vidrio individual (2–3 MΩ) llena de NaCl 2 M. Se administraron pulsos de estimulación (0,05 Hz) a las proyecciones colaterales-comisurales de Schafer utilizando un electrodo de estimulación bipolar (alambre de nicromo trenzado, 65 μm) colocado en CA1c. La intensidad de la corriente se ajustó para obtener el 50 por ciento de la respuesta máxima de fEPSP. Después de establecer una línea de base estable, se indujo LTP con un solo tren de cinco ráfagas theta, en el que cada ráfaga (cuatro pulsos a 100 Hz) se entregó con 200 ms de diferencia (es decir, a la frecuencia theta). La intensidad de la estimulación no aumentó durante el TBS. Los datos fueron recolectados y digitalizados por el Sistema de Adquisición de Neurodatos NAC 2.0 (Teta Burst). Los datos en la figura de LTP se normalizaron a los últimos 10 minutos de la línea de base y se presentaron como media ± SE. Las medidas de referencia en las curvas de E/S, la facilitación de pulsos emparejados y la LTP se analizaron mediante un ANOVA bidireccional y un análisis de regresión lineal (software Graphpad Prism 8).Cistanche puede ayudar a mejorar la memoria.

Análisis estadístico. Se utilizaron ANOVA de una vía para analizar el efecto del momento del ejercicio en la vida temprana en las DI de adquisición de OLM (Fig. 2d, g), las DI de prueba de OLM (Fig. 2e, h) y los tiempos totales de exploración de prueba de OLM (Fig. 2f , i) dentro de cada sexo. Se usaron comparaciones múltiples post-hoc de Dunnett para hacer comparaciones específicas con el grupo "sin ELE" (sedentario) cuando se observaron resultados significativos de ANOVA. Se usó ANOVA de dos vías para analizar el peso ganado por el ratón durante el período ELE (Fig. 1b, factores del grupo ELE y sexo). Se usaron ANOVA de medidas repetidas bidireccionales (RM) para analizar la distancia recorrida diaria (Fig. 1c-e, factores de día posnatal y sexo), sesiones de habituación (Fig. 2b, c) y para comparar DI de adquisición de OLM versus DI de prueba para cada ratón para las comparaciones dentro del grupo. Las pruebas post hoc de Sidak se usaron para hacer comparaciones específicas cuando se observaron interacciones significativas o efectos principales de un grupo de corredores o una sesión de OLM. Además, se realizó un ANOVA de tres vías para los DI de prueba OLM para determinar cualquier interacción significativa entre tres variables nominales (duración del entrenamiento OLM, grupo ELE y sexo). En casos excepcionales en los que no se registraron datos de carrera de 24 horas para un día en particular, los valores se imputaron en función de la distancia promedio de carrera de los tres días anteriores, para realizar análisis estadísticos. Se utilizaron pruebas t de Student no apareadas para analizar las distancias totales de carrera para cada grupo ELE (Fig. 1f-h), así como para comparar las DI de prueba OLM entre 3-min y 10-min ratones sedentarios entrenados. Las distancias de carrera acumuladas se expresan como Medias ± DE. Los principales efectos e interacciones de todos los ANOVA se describen en el texto y en las leyendas de las figuras, junto con el número específico de animales de cada sexo utilizado en cada experimento. Todos los análisis fueron de dos colas y requirieron un valor de 0.05 para la significancia. Las barras de error en todas las figuras representan SEM. Para todos los experimentos, los valores ±2 desviaciones estándar de la media del grupo se consideraron valores atípicos y se eliminaron de los análisis. Todas las estadísticas se realizaron con el software GraphPad Prism 8. Número total de ratones utilizados en experimentos de comportamiento=152.

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Recibido: 16 de enero de 2020; Aceptado: 13 de mayo de 2020;

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Expresiones de gratitud

Esta investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares de los Institutos Nacionales de Salud, con el número de premio K12NS098482 (otorgado a ASI) y el Departamento de Pediatría de la Facultad de Medicina de UC Irvine. También nos gustaría agradecer al Dr. Marcelo Wood por sus discusiones científicas y aportes críticos al proyecto.

Contribuciones de autor

ASI, TY, SP, FS y TV realizaron experimentos de ejercicio y comportamiento y analizaron datos; EK realizó todos los experimentos de electrofisiología, analizó los datos y editó el manuscrito; ASI diseñó el estudio, analizó los datos, interpretó los resultados y escribió el manuscrito.

conflicto de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Información Adicional

La correspondencia y las solicitudes de materiales deben dirigirse a ASI

La información sobre reimpresiones y permisos está disponible en www.nature.com/reprints.

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