Parte 3: El echinacósido aislado de Cistanche Tubulosa supuestamente estimula la secreción de hormona de crecimiento a través de la activación del receptor de grelina

El echinacósido aislado de Cistanche tubulosa supuestamente estimula la secreción de hormona de crecimiento a través de la activación del receptor de grelina

Chieh-Ju Wu 1, Mei-Yin Chien 2, Nan-Hei Lin 1, Yi-Chiao Lin 1, Wen-Ying Chen 3, Chao-Hsiang Chen 2,4* y Jason TC Tzen 1*

1 Instituto de Graduados en Biotecnología, Universidad Nacional Chung-Hsing, Taichung 402, Taiwán; baby159357520@gmail.com (C.-JW); CMNHEI@mohw.gov.tw (N.-HL); s9755702@gmail.com (Y.-CL)

2 Ko Da Pharmaceutical Co. Ltd., Taoyuan 324, Taiwán; rd1@koda.com.tw

3 Departamento de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Chung-Hsing, Taichung 402, Taiwán; wychen@dragon.nchu.edu.tw

4 Instituto de Graduados en Farmacognosia, Universidad Médica de Taipei, Taipei 110, Taiwán

* Correspondencia: gm@koda.com.tw (C.-HC); TCTZEN@dragon.nchu.edu.tw (JTCT); Tel.: más 886-4-22840328 (ext. 776) (JTCT); Fax: más 886-4-22853527 (JTCT)

Editora Académica: Pinarosa Avato

Recibido: 22 de enero de 2019; Aceptado: 14 de febrero de 2019; Publicado: 17 febrero 2019

Contacto:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Resumen:CistancheSe ha registrado que la especie, el ginseng del desierto, posee muchas actividades biológicas en la farmacopea tradicional china y se ha utilizado como medicina antienvejecimiento. Tres glucósidos feniletanoides:echinacósido, tubuloside A y acteoside—fueron detectados en el extracto acuoso deCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight y el componente principal,echinacósido, fue purificado aún más.equinacósidode una concentración superior a 10_6 M mostró una actividad significativa para estimular la secreción de la hormona del crecimiento de las células pituitarias de rata. Similar a la hormona liberadora de la hormona del crecimiento-6, un análogo sintético de la grelina, la estimulación de la secreción de la hormona del crecimiento por parte del equinacósido fue inhibida por [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-sustancia P , un agonista inverso del receptor de grelina. El modelado molecular mostró que los tres glucósidos feniletanoides interactuaban adecuadamente con el bolsillo de unión del receptor de grelina, y el equinacósido mostró una interacción ligeramente mejor con el receptor que el tubulósido A y el acteósido. Los resultados sugieren que los glucósidos feniletanoides, en particular el equinacósido, son componentes activos presuntamente responsables de los efectos antienvejecimiento de C. tubulosa y se puede considerar que se desarrollan como análogos no peptídicos de la grelina.

Palabras clave: cistanchetubulosa;echinacósido; grelina; secreción de hormona de crecimiento;feniletanoideglucósidos

echinacósidoencistanchetiene muchos efectos

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4. Materiales y Métodos

4.1. Productos químicos y materiales vegetales

Cistanchedeserticola YC Ma se obtuvo de un mercado local y autenticado por el Dr. Nan-Hei Lin.Cistanchetubulosa (Schenk) R. Wight se adquirió de Sinopharm Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., (Hangzhou, China). El acetonitrilo, el ácido fórmico y el metanol de grado HPLC se adquirieron de ECHO Chemical Co., Ltd, (Miaoli, Taiwán). El medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), el suero bovino fetal dializado (DFBS) y la tripsina-EDTA se compraron de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE. UU.). La ADNasa I se compró a Worthington Biochemical (Lakewood, NJ, EE. UU.). La hormona liberadora de la hormona del crecimiento-6 (GHRP-6) se obtuvo de Gen Way Biotech, Inc. (San Diego, CA, EE. UU.). La colagenasa tipo I y [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-sustancia P se compraron de Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EE. UU.). El kit ELISA de hormona de crecimiento de rata se adquirió de Sunred Biological Technology Corporation (Shanghai, China).

4.2. Análisis HPLC/UV y LC_MSn de la extracción de agua de Cistanche spp.

Tallo seco (25 g) deCistanchedeserticola YC Ma oCistanchetubulosa (Schenk) R se extrajo tres veces con 500 mL de agua destilada durante 60 min a 50 grados en un baño de agua. La solución se filtró a través de un filtro sirio de 13 mm con un filtro de membrana de PP de 0,45 um (Pall Corporation, Glen Cove, NY, EE. UU.) y se sometió a los siguientes análisis. Los componentes químicos de los extractos se analizaron

utilizando una columna Syncronis C18 (4,6 × 250 mm de diámetro interior, 5 um, Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) en el sistema HPLC junto con un detector de matriz de fotodiodos modelo 600E (Waters Corporation,

Milford, MA, EE. UU.). La fase móvil constaba de (A) agua que contenía {{0}},1 por ciento de ácido fórmico y (B) acetonitrilo. El gradiente de elución fue el siguiente: 0–60 min, gradiente lineal desde 14 por ciento de B; 0–3 min, 14 por ciento a 17 por ciento B; 3–4 min, 17 por ciento B; 4–15 min, 17 por ciento a 20 por ciento B; 15–20 min, 20 por ciento B; 20–50 min, 20 por ciento a 14 por ciento B; 50–60

min, 14 por ciento B. La longitud de onda de detección de absorbancia ultravioleta (UV) se fijó en 330 nm. Un espectrómetro de masas en tándem de cuadrupolo de trampa lineal (LTQ) (Thermo Electron, San José, CA, EE. UU.) equipado con una interfaz de ionización por electropulverización (ESI) se conectó a un sistema Surveyor LC (Thermo Electron)

con un loop de muestra de 5 uL. El gradiente de elución fue el siguiente: 0–90 min, gradiente lineal desde el 14 por ciento de B; 0–24 min, 14 por ciento a 17 por ciento B; 24–25 min, 17 por ciento B; 25–36 min, 17 por ciento a 20 por ciento B; 36–37 min, 20 por ciento B; 37–80 minutos,

20% to 14% B; 80–90 min, 14% B. The heated capillary temperature was set at 300℃ with a spray voltage of 4.5 kV. Negative ESI mode was firstly scanned ranging from m/z 400–1000. Data-dependent MSN was obtained using the high purity helium (>99,99 por ciento) como gas de colisión.

4.3. Aislamiento de equinacósido

El extracto acuoso del tallo seco (25 g) de C. tubulosa se concentró a presión reducida para dar un jarabe de color marrón oscuro. La extracción bruta se suspendió con agua destilada y se liofilizó en un liofilizador. El polvo de 100 mg se resolvió en 5 ml de agua destilada y se sometió a purificación usando la columna Sephadex LH-20 (100 ml; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Suecia) eluida con una solución acuosa de metanol al 10 % y monitoreada por HPLC. . Las fracciones que contenían equinacósido se detectaron leyendo la absorbancia a 245 nm y se recolectaron usando un muestreador automático.

4.4. animales

Los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Nacional Chung_Hsing con el número de aprobación de IACUC 106-079. Se compraron ratas macho Sprague_Dawley que pesaban 250_300 g de BioLASCO, Taiwan Co., Ltd. (Taipei, Taiwán). Dos animales por jaula se mantuvieron en un ambiente controlado de 23 o2, 60 o 10 por ciento de humedad y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Las ratas fueron alimentadas con una dieta estándar chow (calorías proporcionadas

por 28,7 por ciento de proteína, 13,4 por ciento de grasa y 57,9 por ciento de carbohidratos, 5001 Rodent LabDiet, St. Louis, MO, EE. UU.) y agua destilada ad libitum.

4.5. Cultivo de células pituitarias primarias

Las células pituitarias se aislaron de acuerdo con un método de dispersión enzimática modificado desarrollado por Yamazaki et al. [29]. Brevemente, se anestesiaron ratas macho Sprague Dawley con Zoletil 50 (40 mg/kg, IP; Virbac Laboratories, Carros, Francia), y se extirparon las glándulas pituitarias anteriores y se dispersaron para cultivar células pituitarias en suspensión, como se describió anteriormente [30].

4.6. Ensayo de secreción de hormona de crecimiento

Las células pituitarias anteriores primarias de 4 × 104 células/pocillo se cultivaron a 37 grados bajo 5 por ciento de CO2 durante 2 días antes del ensayo de secreción de hormona de crecimiento de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente [30].

Después de la eliminación del medio de cultivo, las células se privaron de suero en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) durante 90 minutos para estabilizar la secreción hormonal basal. El medio de inanición se reemplazó con DMEM fresco que contenía equinacósido (de 10_8 a 10_5 M) o GHRP-6 (un agonista de un receptor de grelina humano, GHSR, 10_7 M) como control positivo, y las células se incubaron durante 15 y 30 minutos a 37 grados bajo un 5 por ciento de CO2. Para la detección del efecto antagonista, las células se incubaron con un GHSR

agonista inverso, [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-sustancia P (0.5 uM), y luego se trató con DMEM que contenía equinacósido (10_5 M) o GHRP-6 (10_7 M) durante 30 min. El medio fue recolectado para

determinación de la secreción de la hormona del crecimiento mediante un kit ELISA de hormona del crecimiento de rata (Shanghai Sunred Biological Technology Corporation).

4.7. Análisis estadístico

Los datos se presentaron como valores medios o DE. Las diferencias se analizaron mediante T-Test. Los cálculos estadísticos se realizaron con GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE. UU.). Un nivel de p < 0.05="" se="" consideró="" estadísticamente="">

4.8. Modelado de homología y acoplamiento

El modelado de homología y el acoplamiento a un receptor de grelina humano, el receptor de secretagogo de la hormona del crecimiento (GHSR, número de acceso AAI13548), se estableció siguiendo nuestra construcción anterior [21,24]. Brevemente, las estructuras cristalinas de los receptores adrenérgicos 1 y 2 (PDB 2YCY y 3PDS) con ligandos unidos, cianopindolol y FAUC50 se usaron como moldes para construir la estructura GHSR [31,32]. Se seleccionó la estructura GHSR con la energía total de PDF más baja para un mayor acoplamiento con GHRP-6, echinacósido, tubulosido A y acteósido. Todos los procesos de modelado se realizaron utilizando la plataforma Discovery Studio 2.1 (http://accelrys.com/).

La estructura 3D de GHRP-6 se descargó de la base de datos de compuestos Pub-Chem en el sitio web de NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Las estructuras 3D de echinacoside, tubuloside A y acteoside se construyeron utilizando el programa Chem3D (http://www.cambridgesoft.com/). El sitio de unión del ligando de GHSR se definió como el espacio esférico con un radio de 14 Å desde el centro del bolsillo de unión en la simulación de acoplamiento. El acoplamiento de GHRP-6, echinacoside, tubuloside A o acteoside al sitio de unión de GHSR se realizó in silico empleando el módulo LibDock en el paquete Discover Studio 2.1 y se minimizó aún más mediante el algoritmo de minimización inteligente con el campo de fuerza CHARMm en el Descubra el paquete Studio 2.1 [33]. Para comparar las afinidades de unión relativas de echinacósido, tubulosido A y acteósido en GHSR, se usó el área del centro activo construida con GHRP-6 en GHSR para el acoplamiento, y GEMDOCK (Instituto de Bioinformática) calculó la energía de unión. , Universidad Nacional Chiao Tung, Taiwán).

Contribuciones de los autores: experimentos con animales, C.-JW, Y.-CL y W.-YC; Identificación y purificación: MY.C., N.-HL y C.-HC; Modelado molecular: C.-JW, Y.-CL y JTCT; Diseño y redacción de proyectos: C.-HC y JTCT

Financiamiento: El trabajo fue apoyado en parte por una subvención a Jason TC Tzen de la Universidad Nacional Chung-Hsing (NCHU-102D604).

Agradecimientos: Los autores agradecen a Tian-Shun Weng por compartir su experiencia profesional en el uso de especies de Cistanche.

Conflictos de interés: Todos los autores declaran no tener conflictos de interés.

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