Los estudios de la Parte 3 han demostrado que la autofagia juega un papel importante en la regulación de la deposición celular de LD

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RESUMEN

La evidencia emergente indica que la deposición y la peroxidación inesperadas de gotitas de lípidos (LD) pueden acelerar el estrés de los orgánulos y desempeñan un papel crucial en la patogénesis de las enfermedades neurodegenerativas (NDD). En nuestro estudio anterior, confirmamos que el kaempferol (Ka), una molécula pequeña de flavonoide natural, exhibió efectos neuroprotectores en ratones con enfermedad de Parkinson (EP) inducida por LPS. Además, estudios previos han demostrado que la autofagia juega un papel importante en la regulación de la deposición celular de LD. En el estudio actual, mostramos que Ka protegía contra TH más la pérdida neuronal y los déficits de comportamiento en ratones PD inducidos por MPTP/p, acompañados por un estrés oxidativo de lípidos reducido en la sustancia negra pars compacta (SNpc). En células neuronales cultivadas, Ka exhibió un rango de concentración relativamente seguro y suprimió significativamente la acumulación de LD y la apoptosis celular inducida por MPP plus. Estudios posteriores indicaron que el efecto protector de Ka dependía de la autofagia, específicamente de la lipofagia. Críticamente, Ka promovió la autofagia para mediar en la degradación de LD en los lisosomas, lo que luego alivió la deposición y peroxidación de lípidos y el daño mitocondrial resultante, reduciendo en consecuencia la muerte neuronal. Además, la eliminación de Atg5 mediada por AAV-shAtg5-eliminó los efectos neuroprotectores de Ka contra la oxidación de lípidos en ratones con EP.Cistanche para mejorar la memoriaEste trabajo demuestra que Ka previene la degeneración neuronal dopaminérgica en la EP a través de la inhibición del daño mitocondrial mediado por la peroxidación de lípidos al promover la autofagia de los labios y proporciona una nueva estrategia terapéutica potencial para la EP y los NDD relacionados.

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Introducción

La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa común (NDD) que se caracteriza patológicamente por la pérdida progresiva de neuronas dopaminérgicas (DA) en la sustancia negra pars compacta (SNpc) [1]. Aunque la etiología exacta y el curso natural de esta enfermedad aún no se han aclarado por completo, numerosos procesos y disfunciones a nivel del sistema, incluidas las funciones mitocondriales, la homeostasis de la dopamina, la neuroinflamación y la autofagia, se han implicado en la patogenia de la EP [1, 2]. Informes recientes revelaron que la lipotoxicidad relacionada con las gotas de lípidos (LD) podría participar en la patología de la EP [3,4]. Las LD son orgánulos altamente dinámicos que emergen de la membrana del retículo endoplásmico (RE) y normalmente sirven como sitios intracelulares de almacenamiento de lípidos neutros [5]. Recientemente se demostró que los ].LD desempeñan un papel mucho más amplio que el almacenamiento de ácidos grasos (FA) y participan en muchas enfermedades. (cistanche para que sirva) Por ejemplo, las células mieloides, incluidos los macrófagos, los leucocitos y los eosinófilos, forman LD en respuesta a la inflamación y el estrés,cistanche En chinoy los LD son sitios de producción y almacenamiento de citocinas inflamatorias y están además involucrados en la presentación de antígenos y la eliminación de patógenos [6]. Es importante destacar que, en la aterosclerosis, se ha demostrado que las células espumosas ricas en LD son perjudiciales en todas las etapas de la enfermedad [7].

Cistanche puede mejorar la inmunidad

Sin embargo, las LD no se han estudiado de forma exhaustiva en el sistema nervioso central (SNC), con pocos artículos que informen la presencia histológica de LD en el tejido cerebral humano [8,9]. Aun así, los LD pueden tener funciones importantes en el cerebro, ya que estudios recientes confirmaron que los LD agregados en la glía aceleraron la neurodegeneración en un modelo de Drosophila [10]. Recientemente se informó que en ratones, las células cargadas de lípidos Oil Red O-positivas, incluidas las neuronas, los astrocitos de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP)t y la molécula adaptadora de unión al calcio ionizado-1 (IBA{{7} })t microglia, están presentes en muchas regiones del cerebro y se ha demostrado que participan en procesos asociados con la edad [11]. Nuestro trabajo anterior también demostró una mayor acumulación de LD en el cerebro en un modelo de ratón con EP [12]. Tomados en conjunto, estos estudios sugieren que los LD pueden estar involucrados en la patogenia de la EP, así como otros NDD.

Normalmente, los LD intracelulares se degradan en los lisosomas y entregan AG a las mitocondrias para su consumo como fuente de energía alternativa durante los períodos de agotamiento de nutrientes [13]. Sin embargo, las neuronas tienen una baja capacidad de consumo mitocondrial de AG para la producción de energía [14]. Esta característica hace que las neuronas sean particularmente sensibles a la acumulación y peroxidación de LD. Además, la acumulación de LD aumenta la tasa de oxidación de FA e impone una presión persistente sobre la cadena de transporte de electrones mitocondrial, lo que aumenta la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) por los complejos de la cadena de transporte de electrones I y III [15] para amplificar el estrés oxidativo. La sobrecarga de lípidos también conduce a la producción de ROS por fuentes extramitocondriales como las oxidasas de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) y otras enzimas oxidativas. En combinación con la disminución de la expresión de enzimas antioxidantes y la baja capacidad de consumo de ácidos grasos en las neuronas, la acumulación de LD media el estrés oxidativo y puede provocar daño mitocondrial, disfunción lisosomal, autofagia defectuosa y activación de respuestas inflamatorias [16,17]. A menos que las LD acumuladas puedan inhibirse o eliminarse, las neuronas altamente activas sufren fisiopatología, lo que da lugar a la neurodegeneración [17]. (pene de cistanche) La evidencia indica que el proceso catabólico mediado por lisosomas llamado autofagia juega un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis celular de LD en múltiples tejidos [17,18]. En detalle,crecimiento del pene cistancheLas LD pueden secuestrarse selectivamente en autofagosomas y entregarse a los lisosomas para su degradación por lipasas ácidas lisosomales, un proceso conocido específicamente como lipofagia [19]. Por lo tanto, centrarse en las LD y su vía de eliminación autofágica podría representar un enfoque novedoso para controlar la neurodegeneración.

El estudio de productos naturales y agentes dietéticos como fuentes de posibles tratamientos y estrategias de NDD ha ganado un enorme interés en los últimos años [20]. Kaempferol (Ka) es una pequeña molécula polifenólica natural que se puede encontrar en varias hierbas medicinales chinas y fuentes dietéticas [21]. Se ha informado que Ka ejerce efectos antibacterianos, antienvejecimiento e inmunomoduladores, así como actividades antioxidantes y neuroprotectoras [20,22,23]. Anteriormente, se informó que Ka inhibía la inflamación en las células microgliales BV2 in vitro [24] y aumentaba la resistencia de las neuronas DA a la neuroinflamación in vivo [25]. Sin embargo, aún no se ha investigado el efecto de los LD de Kaon en la EP.

Dada la importancia de las LD y la íntima conexión entre las LD, las mitocondrias y la autofagia [16], que están todas involucradas en la EP, planteamos la hipótesis de que Ka inhibe la peroxidación de la LD y previene la neurodegeneración de la DA en la EP. En el presente estudio, demostramos que Ka protegió significativamente contra la neurodegeneración en un modelo murino de EP al inhibir la acumulación de LD. (polvo de cistanche) Un estudio adicional reveló que Ka desencadenó la autofagia y redujo la acumulación de LD oxidados para aliviar la disfunción mitocondrial y la producción de ROS mitocondrial (mtROS), evitando así la muerte apoptótica neuronal.cistanche propiedadesLos hallazgos obtenidos en este estudio pueden ayudar a dirigir las decisiones clínicas con respecto al uso de la molécula natural Ka en NDD como la EP.

2. Materiales y métodos

2.1. animales de experimentación

Se obtuvieron ratones C57BL/6J (macho, 4-mes de edad) de Nanjing Medical University Animal Core (Nanjing).beneficios de la cistanche tubulosaLos ratones se mantuvieron y criaron en el Centro de Recursos Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad Médica de Nanjing y en las instalaciones para animales del Hospital Drum Tower de Nanjing. Los ratones pueden acceder libremente a alimentos y agua en una habitación con una temperatura ambiente de 22 grados ± 2 grados y un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 h. Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las directrices de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud.

2.2.Reactivos

MPTP(M0896),3-MA(M9281),penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC>95%) for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol (HPLC>99,0 por ciento, 96,353) para experimentos in vitro se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). BODIPY 493/503 (D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861) y DHE (D11347) se adquirieron de Thermo Fisher Scientific. Para experimentos con animales, Ka se disolvió en una solución de 10 por ciento de DMSO en 16 por ciento de SBE- -CD en solución salina estéril. Para los experimentos con células, se preparó Ka en DMSO (Sigma-Aldrich) y PBS (la concentración final de DMSO es del 0,01 por ciento), pH 7,4.

2.3. Inducción y tratamiento de metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) - modelo de ratón con enfermedad de Parkinson inducida

Para evaluar los efectos de Ka en el modelo PD de toxicidad MPTP/p, los ratones (machos, de 4-5 meses de edad) se dividieron aleatoriamente en el grupo tratado con solución salina, el grupo tratado con MPTP, el grupo tratado con MPTP más Ka , y Ka solo grupo tratado. En el grupo tratado con MPTP, los ratones recibieron administración crónica de MPTP con un protocolo similar al descrito anteriormente [26]: MPTP se disolvió en solución salina y se inyectó por vía subcutánea a 25 mg/kg seguido de 250 mg/kg de probenecid (disuelto en dimetilsulfóxido) inyección intraperitoneal (ip) a intervalos de 1 h cada 3,5 días durante un período de 5 semanas. (raíz de cistanche) Los ratones de control recibieron una inyección de solución salina y probenecid. En el grupo tratado con MPTP más Ka, los ratones recibieron Ka (50 mg/kg, una sola inyección/día durante los experimentos, Jingzhu Biotechnology, Nanjing, China) por vía intraperitoneal (ip) diariamente 3 días antes del tratamiento con MPTP y durante los 5 días de MPTP. semanas de inyección. Una semana después de la última inyección de MPTP, los ratones se sometieron a pruebas de comportamiento sin grupos. Después, todos los ratones se anestesiaron con 40 mg/kg de pentobarbital sódico y se sacrificaron para la detección de proteínas cerebrales y el análisis inmunohistoquímico o qPCR.

2.4. Cirugía estereotáxica in vivo y tratamientos experimentales

La cirugía estereotáxica bajo anestesia con pentobarbital sódico (40 mg/kg, ip) se realizó como se describe [25]. Mouse Atg5 y shRNA de control se transfectaron con vectores de empaquetamiento (AAV-U6-CMV-she-NA-EGFP) para generar AAV. Para la microinyección, los ratones anestesiados se colocan en un aparato estereotáxico. Se les inyectó 1 μL AV con un electrodo de vidrio dirigido a DG (AP:-0.3mm; ML: ±0.13mm; DV:-0.45 mm） a una velocidad de 0,25 μL/min. Luego, la aguja se retuvo durante un 2-min adicional. 2 semanas después de la microinyección del virus, los ratones se sometieron a la conducción del modelo de EP inducida por MPTP y (o) al tratamiento con Ka.

El shRNA de Atg5 se obtuvo de Hanbio Biotechnology (Shanghai, China) Co., Ltd. Para el silencio de Atg5, los cebadores se muestran en la Tabla complementaria 1.

2.5. Análisis de comportamiento

Una semana después de la inyección final de MPTP o solución salina, se realizaron la prueba rotarod y la prueba del bastón como se describió anteriormente [27]. Para la prueba del rotarod, los ratones se aclimataron al rotarod en dos pruebas (6 min con una velocidad acelerada de 12-20 rpm) por día durante 2 días consecutivos antes del inicio del experimento. Luego, los ratones se probaron a 20 rpm durante 300 s durante otros 3 días consecutivos. La latencia de caída se registró mediante el sistema de análisis Rotarod (Jiliang, Shanghái, China). Para la prueba del poste, los ratones se colocaron cabeza arriba en la parte superior de un poste de madera vertical (superficie rugosa, altura 50 cm, diámetro 1 cm). Todos los ratones se acostumbraron al aparato 2 días antes de la prueba y luego se probaron tres veces el tercer día. Se registraron el tiempo total (T-total, hasta que el ratón llegó al suelo con sus cuatro patas) y el tiempo de giro (T-giro, para que el ratón gire completamente con la cabeza hacia abajo). El experimento se cegó a los grupos de ratones para cada prueba de comportamiento y la prueba se realizó tres veces.

2.6. Recolección de muestras de cerebro

Después de las pruebas de comportamiento finales, los ratones se anestesiaron con pentobarbital sódico (40 mg/kg, ip). Para el análisis de qPCR, transferencia Western y cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), se extrajeron rápidamente los cerebros completos de los animales y luego se diseccionaron rápidamente los tejidos del mesencéfalo y el estriado, precongelados con nitrógeno líquido. Todas las muestras se almacenaron a -80 grados hasta su análisis.

Para el análisis inmunohistoquímico, los ratones se perfundieron transcardialmente con paraformaldehído (PFA) al 4 por ciento. Los cerebros se extrajeron, se fijaron posteriormente, se deshidrataron, se incluyeron en OCT (Tissue-Tek) y se crioseccionaron secciones seriadas de los cerebros (30 μm por corte) a través de cada estrato completo y mesencéfalo utilizando un micrótomo de congelación (Leica CM1950, Nussloch, Alemania). ). Todas las secciones se recolectaron en seis series separadas y los cortes de cerebro se almacenaron en glicerina al 50 por ciento y se congelaron en -20 grados hasta el análisis.

Para TEM, los ratones se perfundieron con glutaraldehído al 2,5 por ciento y paraformaldehído al 2 por ciento como se describe 【12】. Una pequeña porción （<1 mm³）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4="" ℃.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">

2.6. Análisis inmunohistoquímico

Los cortes de cerebro se enjuagaron en PBS seguido de H2O2 al 3 % durante 10 min y luego se incubaron con 0,3 % Triton X-100 en PBS complementado con BSA al 5 % durante 1 h. Después de eso, los portaobjetos se incubaron con los anticuerpos primarios a 4 grados durante la noche en PBS que contenía 5 por ciento de BSA a 4 grados durante la noche, luego se lavaron e incubaron en anticuerpos secundarios durante 1 h a temperatura ambiente, seguido de incubación con diaminobencidina (DAB) o montaje en DAPI (Life Technologies, Cat P36931) como tinción inmunofluorescente durante 5 min. Para la tinción de Nissl, los portaobjetos se fusionaron en una solución de violeta de cresilo (CV) (0,1 g de violeta de cresilo, 99 ml de H2O y 1 ml de ácido acético al 1 por ciento) durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego se deshidrataron con alcohol y xileno. Se observaron imágenes y se capturaron fotografías bajo un microscopio Olympus BX52 (Olympus America Inc., Melville, NY, Estados Unidos). El número total de neuronas positivas para TH y positivas para Nissl en el SNpc se obtuvo serológicamente utilizando el método de fraccionamiento óptico con el software MicroBrightField Stereo-Investigator (MicroBrightField, Williston, VT, EE. UU.).

2.7.Análisis por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

Las muestras del cuerpo estriado de los ratones se homogeneizaron con ácido perclórico {{0}},1 M (1 mg de tejidos en 100μl de ácido perclórico) y EDTA 0,1 mM, tratados por ultrasonido y centrifugado a 20,000 rpm durante 30 min como se informó [27]. Luego se recogieron los líquidos sobrenadantes para medirlos. La fase móvil es una solución mixta que consta de fosfato de sodio monobásico 90 mM, ácido sulfónico de 1-octano 1,7 mM, citrato 50 mM, EDTA 50 uM, acetonitrilo al 10 por ciento con un caudal de 0,2 ml/min. Paralelamente, para el cálculo de la curva estándar cuantitativa, se prepararon soluciones estándar madre para dopamina y ácido dihidroxifenilacético (DOPAC) (Sigma-Aldrich, EE. UU.) en HClO4 0.1 M. Se inyectó una cantidad de 10 ul de sobrenadante preparado o solución estándar. en la fase móvil y se analizó con el detector electroquímico ESA Coulochem III (Coulochem III, Thermo Fisher Scientific). Se midieron las muestras y se cuantificaron los picos. Las concentraciones de monoaminas se cuantificaron comparándolas con el estándar usando el software ClarityChrom (Knauer, Alemania) y luego los contenidos en el estrato se convirtieron de acuerdo con la relación de dilución.La curva estándar de DA y DOPAC se mostró en las figuras complementarias 1a y b.

2.8. Cultivos celulares y tratamientos.

Los cultivos de neuronas primarias mesencefálicas se realizaron como se describió anteriormente [12]. En resumen, los tejidos mesencefálicos de ratones C57BL/6 en el día embrionario 14/15 (E14/15) se extrajeron cuidadosamente, se disociaron mecánicamente para eliminar las membranas y los vasos sanguíneos grandes. y luego disecado. A continuación, se digirieron con tripsina-EDTA (Amresco, Solon, OH, EE. UU.) y luego se filtraron a través de un filtro 100-um para obtener una suspensión unicelular. Posteriormente, las células se sembraron en placas de pocillos 12-/24- recubiertas previamente con poli-L-lisina a 2,5 × 10 grados de células/ml que contenían medio Neurobasal (Cat 21103049, GibcoTM , Thermo Fisher Scientific, Rockford, EE. UU.) complementado con B27 (2 % v:v, Cat 1750404, GibcoTM) y penicilina/estreptomicina (0,5 % v:v). Los cultivos se mantuvieron en una cámara humidificada (37 grados, incubadora con 5 por ciento de CO2). El medio de cultivo se cambió cada 3 días y las células se pueden usar a los 7-10 días.

Líneas celulares: las líneas celulares SH-SY5Y se cultivaron en 10 por ciento de FBS y 1 por ciento de penicilina/estreptomicina en una incubadora humidificada a 37 grados y 5 por ciento de CO2. En los experimentos, las células SH-SY5Y se trataron con MPP plus (200 μM) o diferentes dosis de Ka (0,3,30,60,100,300,600uM) durante 24 horas. Las células SY5Y se estimularon con MPPt (400 μM) durante 24 h Ka (30 μM, 3 h) con (o sin) 3-MA (3 mM, 1 h) o -tocoferol (50 μM, 1 h, Sigma-Aldrich, 47783) Las células cebadas SH-SH5Y se estimularon con MPPT (200 μM) durante 24 h.

2.9. Ensayo de viabilidad celular CCK8

La viabilidad celular modificada del tratamiento con Ka se detectó mediante el kit de recuento celular-8 (kit CCK-8, Selleck, Houston, TX, EE. UU.). En resumen, las células SHSY5Y se sembraron en un 96- placa de pocillos y luego tratada con diferentes concentraciones de Ka (3, 30, 60, 100, 300, 600, 600 uM) durante 24 h. Luego se agregaron 10 ul de reactivo CCK-8 a cada pocillo durante 4 h. Finalmente, la absorbancia fue detectada por el Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) a 450 nm.

2.10. ensayo ATP

Los niveles de ATP celular se detectaron mediante un kit de ensayo de bioluminiscencia de ATP (Beyotime Biotechnology Co., China) según las instrucciones del fabricante. Después del tratamiento, las células se lisaron y centrifugaron a 12, 000 rpm durante 5 min a 4 grados y se recogieron los sobrenadantes. Se añadió solución de trabajo (100 μL) a 20 μL de muestra en la placa de pocillos 96- y la luminiscencia se midió inmediatamente en un lector de microplacas automatizado. Las mediciones de todas las muestras se normalizaron a la concentración de proteína.

2.11.Ensayo de Na más -K más -ATPasa

Para la medición de Nat-K más -ATPasa (A070-2-2, Jiancheng, Nanjing, China), las células se sonicaron y centrifugaron a 600 rpm durante 10 min para adquirir el sobrenadante. Se añadieron soluciones de reacción de detección de Nat-Kt-ATPasa y se incubaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego se detectó la absorbancia a 660 nm. Las mediciones de todas las muestras se normalizaron a la concentración de proteína.

2.12. Análisis de transferencia Western

Las células o los tejidos cerebrales se lisaron en el tampón RIPA (Tris 50 mM (pH 7,4),cistanche คือNaCl 150 mM, NP-40 al 1 % (FNN0021, Thermo), desoxicolato de sodio al 0,5 % (D6750, Sigma), SDS al 0,1 % (74255, Sigma) complementado con proteasa e inhibidores de fosfatasa (Roche, Shanghai, China). Las concentraciones de proteína se determinaron con el Micro BCA Kit (Beyotime, Shanghái, China). Se separó un 30-ug de proteína de cada muestra mediante SDS-PAGE usando geles de poliacrilamida TGX (Bio-Rad, Hercules, California, EE. UU.) y luego se transfirió a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Bedford, MA). Después del bloqueo, las membranas de PVDF se incubaron con varios anticuerpos primarios específicos en TBST a 4 grados durante la noche, luego se lavaron e incubaron en los correspondientes anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron y detectaron mediante quimioluminiscencia mejorada (ECL) más reactivo de detección (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) y se analizaron con el sistema de imágenes ImageQuantTM LAS 4000 (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, EE. UU.).

2.13. PCR cuantitativa (Q) y de transcripción inversa (RT) en tiempo real

El ARN total se extrajo de tejidos cerebrales y células cultivadas utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). La transcripción inversa se llevó a cabo utilizando el kit de reactivos TAKARA PrimeScript RT (TaKaRa, Japón). La qPCR en tiempo real se llevó a cabo utilizando SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) en un instrumento StepOnePlus (Applied Bio-systems). Los cebadores fueron comprados y validados por el General (Shanghai, China). Los cebadores utilizados para qPCR se muestran en la Tabla complementaria 2.

Este artículo está extraído de Redox Biology 41 (2021) 101911