Primera parte Diferencias del proteoma urinario en la diabetes canina con y sin presencia de microalbuminuria

Resumen sencillo

La diabetes canina es una enfermedad grave que puede dar lugar a numerosas complicaciones. Hay datos limitados sobre la proteómica de la orina en perros y ninguno sobre el efecto de la diabetes mellitus en el proteoma de la orina. En este estudio, nuestro objetivo fue analizar la composición proteica de la orina recolectada de animales sanos y compararla con dos grupos de diabéticos (normoalbuminúrico y microalbuminúrico). Existen diferencias significativas entre estos tres grupos, y creemos que las proteínas identificadas son prometedoras como una herramienta de diagnóstico potencial, que puede usarse más adelante en la práctica clínica y para una mejor comprensión de la enfermedad.

Abstracto

En este estudio, nuestro objetivo fue analizar la composición proteica de la orina recolectada de animales sanos y compararla con los dos grupos de diabéticos (perros diabéticos normoalbuminúricos DM I; perros diabéticos DM II con microalbuminuria). Intentamos identificar posibles proteínas urinarias que podrían estar reguladas al alza o a la baja en pacientes diabéticos incluso antes de la aparición de la microalbuminuria. Métodos: Luego de la obtención de la orina, se realizó electroforesis bidimensional, seguida de análisis con software Delta2D, que permitió seleccionar e identificar con espectrometría MALDI-TOF, proteínas expresadas diferencialmente estadísticamente significativas. Nuestro estudio reveló 286 manchas de proteínas comunes en geles 2D del grupo diabético y de control. De estas proteínas, cinco fueron identificadas positivamente por MALDI-TOF MS. Para evaluar más a fondo las cinco proteínas diferenciadoras, se utilizó el programa Panther para asignarlas a los procesos biológicos apropiados. Conclusión: un número significativo de proteínas identificadas desempeñan un papel en la señalización intracelular: formación de vesículas, unión y transporte a través de las membranas. Esto puede sugerir que los primeros signos de deterioro celular de la diabetes renal pueden verse en la composición de la orina antes de que se presente cualquier signo clínico.

Palabras clave

lesión renal; nefropatía diabética; diabetes mellitus canina; marcadores de orina; proteómico.

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Introducción

La diabetes mellitus (DM) es una endocrinopatía relativamente común que ocurre principalmente en perros de mediana edad y mayores [1,2]. Puede dar lugar a numerosas complicaciones, como vasculopatía, hipertensión sistémica y nefropatía [1]. Debido a su corta vida útil, estas complicaciones ocurren con poca frecuencia en animales pequeños, pero son capaces de causar una enfermedad importante [3,4]. También hay escasez de información sobre la concentración de albúmina en orina en perros con DM espontánea. En un estudio anterior, se encontró que el 20 % de los perros diabéticos tenían proteinuria según una proporción de proteína en orina a creatinina (UPC) > 1 y el 46 % eran hipertensos [5]. Mazzi et al. informó una concentración elevada de albúmina en el 55 por ciento de los perros diabéticos, con más de la mitad de ellos con una elevación simultánea en la proporción de proteína en orina a creatinina (UPC) [6]. En otro estudio, la prevalencia de microalbuminuria en pacientes diabéticos estaba al mismo nivel; además, dos de los tres perros con microalbuminuria y UPC normal en la evaluación inicial desarrollaron un UPC elevado durante el estudio longitudinal [4].

Urinary proteins are a promising target for detecting kidney injury. Only a minimal amount of proteins is present in normal urine, due to the mechanical barrier of the glomerulus, and the reabsorption in the proximal tubules. Urinary total protein (UTP) contains proteins originating from filtered plasma, lower urinary tract, and kidney-derived proteins. High urinary protein concentration can be a result of nephron dysfunction, as a healthy glomerular filtration barrier excludes proteins larger than 69 kDa, the molecular weight of albumin. Also, it is worth noticing that positively charged proteins pass the glomerular barrier easier than negatively charged ones. In conditions of disease, the glomerular barrier gradually collapses, allowing large amounts of proteins of high, or intermediate weight to pass into the ultrafiltrate. Proteins of small molecular weight (>69 kDa) se filtran libremente en el glomérulo, pero luego se reabsorben en los túbulos proximales del riñón, por lo que tanto la disfunción tubular primaria como la secundaria pueden provocar proteinuria [7].

Los avances en el estudio proteómico y metabolómico han mejorado nuestra capacidad para identificar miles de proteínas y péptidos en la orina en un solo análisis, algunos de los cuales pueden servir como nuevos marcadores. Este estudio a gran escala de las proteínas se denomina proteómica, mientras que el estudio de los péptidos naturales generados por la actividad de la proteasa endógena se denomina peptidómica. El análisis proteómico también se ha convertido en una herramienta importante en la investigación veterinaria [8–12]. La caracterización del proteoma urinario canino en perros sanos ya ha sido investigada [13]. La proteómica y la peptidómica urinaria añaden diferentes dimensiones a la investigación de la biología subyacente [14]. Su aplicación en la orina tiene implicaciones clínicas importantes para la enfermedad renal diabética, dado que la orina se puede recolectar de forma no invasiva con relativa facilidad y es producida directamente por los riñones. Como tal, los cambios en la abundancia relativa de proteínas y péptidos urinarios pueden reflejar cambios en la expresión, el depósito o el recambio de proteínas en el riñón diabético [15]. A pesar de la investigación de medicina veterinaria bien desarrollada sobre perros diabéticos, los informes sobre estudios moleculares de la orina siguen siendo escasos [11,13,14,16,17].

Este estudio tuvo como objetivo identificar proteínas en la orina de animales sanos y compararla con los dos grupos de diabéticos (perros normoalbuminúricos y perros con microalbuminuria). Intentamos identificar posibles proteínas urinarias que podrían estar reguladas al alza o a la baja en pacientes diabéticos incluso antes de la aparición de la microalbuminuria.

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Materiales y métodos

Todos los perros de una población de pacientes ambulatorios se inscribieron consecutivamente durante los dos años de 2018 a 2020 en el Centro Innovador de Patología Animal y Terapia de la Facultad de Medicina Veterinaria en Lublin. Todas las muestras se obtuvieron durante los procedimientos estándar de diagnóstico veterinario; por lo tanto, de acuerdo con la ley polaca, no se requería la aprobación de la Comisión Local de Ética en Experimentos con Animales ya que no había tratamiento, incluidos diagnósticos médicos, invasivos o procedimientos que causaran molestias psicológicas o sociales a los participantes. Los experimentos se realizaron en base a la directiva de legislación de la Unión Europea 2010/63/EU. El estudio se llevó a cabo de conformidad con las directrices ARRIVE. Los dueños de los perros fueron informados sobre los métodos y el propósito del estudio y dieron su consentimiento informado por escrito. El estudio se realizó en tres grupos de perros: grupo DM I formado por 7 perros diabéticos normoalbuminúricos (4 machos, 3 hembras, edad media: 7); grupo DM II formado por 7 perros diabéticos con microalbuminuria (3 machos, 4 hembras, edad media: 8); El grupo H consta de 7 perros sanos (4 machos, 3 hembras, edad media: 7).

La DM se diagnosticó al encontrar hiperglucemia marcada persistente (glucosa plasmática > 200 mg/dL; 11 mmol/L) y glucosuria en perros con signos clínicos compatibles con la enfermedad (poliuria, polidipsia, pérdida de peso).

Además, los propietarios completaron un cuestionario estandarizado para documentar los cambios en el consumo de agua y alimentos, la frecuencia de micción y la actividad, en relación con lo normal para sus mascotas.

Como grupo de estudio, 14 del total de 30 perros mestizos diabéticos presentados por el propietario fueron elegibles para su inclusión. Los requisitos de inclusión fueron: (1) diagnóstico previo de diabetes mellitus; (2) tratamiento con insulina administrado durante al menos tres meses; (3) diabetes clínicamente estable. Los criterios de exclusión fueron: proteinuria (proporción de proteína en orina a creatinina> 0,5), sedimento urinario activo, pancreatitis, hiperactividad de la glándula suprarrenal, inflamación purulenta del útero e inflamaciones bacterianas del riñón o la vejiga urinaria. Como grupo control se incluyeron 7 perros sanos de diferentes razas. Se consideraron sanos según el examen físico, el hemograma completo, el perfil bioquímico del plasma y el análisis de orina. El grupo de control se eligió para ser emparejado por edad con el grupo de estudio.

Se realizó un examen clínico con medición de la presión arterial, análisis de sangre bioquímicos y hematológicos de rutina y análisis de orina para cada perro. Cada muestra de sangre se recogió utilizando un sistema de vacío cerrado en un tubo de ensayo que contenía EDTA y se sometió a análisis hematológico en un analizador Exigo Vet (Boule, Spånga, Suecia). El plasma obtenido tras centrifugar a 3000 rpm durante 15 min a 4 ◦C se analizó en un analizador bioquímico automático BS-130 (Mindray, Shenzhen, China). El panel químico incluyó alanina transferasa, aspartato aminotransferasa, bilirrubina total, urea, creatinina, fosfatasa alcalina, glucosa, albúmina, proteína total, amilasa, -glutamiltransferasa. También se determinó la concentración de cortisol sérico utilizando un ensayo quimioluminiscente amplificado con enzimas (analizador Immulite 1000). Para los perros diabéticos, el control glucémico se estimó utilizando la concentración de fructosamina sérica. Las muestras de orina del chorro medio se recogieron por la mañana y cada muestra se centrifugó el día de la recogida a 500 × g durante 10 min a 4 ◦C. Se eliminaron los sobrenadantes y se agregaron inhibidores de proteasa (Protease Inhibitor Cocktail, Sigma, P8340, Spruce Street, Saint Louis, MO, EE. }}). El UPC se calculó utilizando la siguiente fórmula: UPC=proteína en orina (mg/dL)/creatinina en orina (mg/dL). Se realizó un análisis de orina básico con análisis de sedimento microscópico en muestras de orina frescas. La gravedad específica de la orina (USG) se midió usando un refractómetro. La microalbuminuria se midió utilizando un kit de prueba ELISA disponible comercialmente (Canine Microalbuminuria Elisa Kit, My Biosource, San Diego, CA, EE. UU.). La prueba de microalbuminuria se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La albuminuria se evaluó mediante la relación albúmina-creatinina urinaria (UACR) en una muestra de orina fresca. El resto de la orina se congeló a −80 ◦C para su posterior análisis.

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Análisis Proteómico de la Orina

Para el análisis proteómico se recogieron 7 muestras de orina individuales del grupo I (DM I), 7 muestras de orina individuales del grupo II (DM II) y 7 muestras de orina individuales del grupo sano (H).

Cada muestra de orina se purificó, desalinizó y concentró mediante unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-0.{1}} kDa (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania). Las concentraciones de proteína se midieron con un espectrofotómetro de microvolúmenes (MaestroNano, Maestrogen, Xinzhu, Taiwán), y luego se prepararon las muestras de orina y se sometieron a electroforesis 2D. Después del análisis gráfico y estadístico, las proteínas de interés se cortaron del gel para su posterior identificación mediante espectrometría de masas con la técnica MALDI-TOF MS (ionización por desorción láser asistida por matriz: espectrometría de masas en tiempo de vuelo).

1. Electroforesis 2D

La electroforesis bidimensional fue la primera etapa de la investigación que da como resultado la separación de proteínas en la orina. Brevemente, se recibieron 200 µg de proteína por tira de 17 cm a través de un kit de precipitación (Kit de limpieza Ready-Prep™ 2-D, Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) . Los gránulos de proteína se disolvieron en tampón de rehidratación (ReadyPrep 2-D Rehydration/Sample Buffer 1, BioRad, Hercules, CA, EE. UU.), y las soluciones resultantes se aplicaron a una placa de rehidratación, cubierta con un gradiente de pH inmovilizado de 17 cm (IPG ) tiras lineales para enfoque isoeléctrico (ReadyStrip IPG Strips, pH 3–10, Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) y aceite mineral (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Después de 12 h de rehidratación, las tiras con proteínas empapadas se transfirieron al aparato IEF-100 Hoefer (Hoefer IEF100, Hoefer, Inc., Holliston, MA, EE. UU.) para realizar electroforesis en la primera dimensión (condiciones de proceso: 250 V /30 min; 10,000 V/3 h; 60 kV/hr., con un límite de corriente de 50 µA/tira). A continuación, las tiras se equilibraron secuencialmente en soluciones de urea/TRIS/SDS de 1,4-ditiotreitol y yodoacetamida. Cada paso de equilibrio duró 15 min. Luego, las tiras equilibradas se sometieron a la segunda dimensión de la electroforesis para separar las proteínas por sus masas moleculares en geles de poliacrilamida al 12,5 % con los siguientes parámetros de corriente: 600 V/30 mA/100 W en una cámara electroforética (PROTEAN® II xi, Bio-Rad , Hércules, CA, EE. UU.). Los geles obtenidos se sometieron a un procedimiento estándar de tinción con plata con nitrato de plata en presencia de formaldehído. Después de la tinción, los geles se escanearon con Image Scanner III (GE Healthcare, Chicago, IL, EE. UU.) y se procesaron con el software Delta2D (versión 4.7, DECODON, Greifswald, Alemania). El análisis estadístico se realizó después de excluir manualmente los puntos falsos positivos y falsos negativos. Las imágenes escaneadas fueron distorsionadas por la tecnología SmartVectors en el software Delta2D, lo que significa que los puntos de la misma proteína tenían la misma posición en todos los geles del proyecto. El uso de la deformación de imágenes de gel permitió eliminar las diferencias entre las imágenes de gel para alinearlas. A continuación, se utilizaron imágenes deformadas para crear imágenes fusionadas. Una imagen fusionada responde al mapa de proteoma que contiene cada mancha de proteína obtenida en todo el experimento. Se generaron las proporciones de expresión y se realizaron estadísticas sobre volúmenes normalizados mediante ANOVA unidireccional (valor de p menor o igual a 0,05) y una prueba de comparación de Tukey post hoc. Las manchas de proteína designadas se cortaron de los geles, se destiñeron, redujeron y alquilaron utilizando soluciones de ditiotreitol y yodoacetamida. Las piezas de gel que contenían proteínas se sometieron a digestión tríptica para obtener fragmentos peptídicos. La digestión con tripsina se produjo en tampón de bicarbonato de amonio 50 mM a 37 ◦C durante 12 h (Promega, Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade, Technical Bulletin). Posteriormente, los péptidos se eluyeron de las piezas de gel con una solución de agua/acetonitrilo/TFA (v:v 45:50:5) mediante extracción triple y los extractos recibidos se concentraron en condiciones de vacío (Labconco, Kansas City, MO, EE. UU.). Los sedimentos de péptido obtenidos se disolvieron en ácido trifluoroacético al 0,1 por ciento y se limpiaron con puntas de pipeta C18 Zip-TIP de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Merck Chemicals, Billerica, MA, EE. UU., PR 02358, Nota técnica) y se prepararon para análisis de espectrometría de masas.

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2. Espectrometría de masas

Se colocó un µl de soluciones de péptido preparadas en una placa Anchor Chip MALDI (Bruker, Bremen, Alemania). Cuando las muestras de proteínas se secaron, sus superficies se cubrieron con 1 µL de matriz de ácido -ciano-4-hidroxicinámico (HCCA, Bruker, Bremen, Alemania). La solución estándar de péptidos (Patrón de calibración de péptidos II, Bruker, Bremen, Alemania) también fue manchada y cubierta por la matriz en los puntos de calibración. Los espectros de masas se registraron en modo de reflector positivo activo dentro del rango de 700–4000 m/z utilizando un espectrómetro Ultraflextreme MALDI TOF/TOF (Bruker, Bremen, Alemania) y el software flexControl 3.3 (Bruker, Bremen, Alemania). Los espectros recogidos se suavizaron y se corrigió la línea base. Generada en el software flexAnalysis 3.0 (Bruker, Bremen, Alemania), la lista de picos para la relación señal/ruido de > 3 se transfirió a BioTools 3.2 (Bruker, Bremen, Alemania) y se comparó con el software Mascot 2.2 (Matrix Science, Boston, MA, EE. UU.) utilizando la base de datos Swiss-Prot restringida a la taxonomía de "mammalia" con un error máximo de 0,3 Da y la carbamidometilación de la cisteína como modificación obligatoria. Los resultados con una puntuación de Mascot superior a 61 se consideraron estadísticamente significativos (p menor o igual a 0,05); de lo contrario, los espectros de iones de fragmentos de los péptidos elegidos se obtuvieron utilizando el modo LIFT y se combinaron con el objetivo de la identificación MALDI TOF/TOF.

Referencias

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Dagmara Winiarczyk 1, Mateusz Winiarczyk 2 , Katarzyna Michalak 3 , Stanisław Winiarczyk 3 y Łukasz Adaszek 3

1 Departamento de Enfermedades Internas de Pequeños Animales, Universidad de Ciencias de la Vida de Lublin, 20-400 Lublin, Polonia

2 Department of Vitreoretinal Surgery, Medical University of Lublin, 20-059 Lublin, Poland; winiarm86@gmail.com

3 Departamento de Epizootiología, Universidad de Ciencias de la Vida de Lublin, 20-400 Lublin, Polonia; artica@wp.pl (KM); genp53@interia.pl (SO); ukaszek0@wp.pl (Ł.A.)