Parte Ⅰ Los efectos de los niveles de proteína y fibra en la dieta sobre el rendimiento del crecimiento, la aparición de gota, las comunidades microbianas intestinales y la inmunorregulación en el eje intestino-riñón de los pichones

Abstracto

El estudio actual evaluó los efectos de los niveles de proteína y fibra en la dieta sobre el rendimiento del crecimiento, la aparición de gota, las comunidades microbianas intestinales y la inmunorregulación en el eje intestino-riñón de los pichones. Se adoptó un diseño factorial completamente aleatorizado 2 £ 3 con 2 niveles de PC (180 [18PC] y 220 [22PC] g/kg) y 3 niveles de fibra cruda (FC) (30 [FC bajo], 50 [FC medio], y 70 [FC alta] g/kg). Las dietas altas en CP o bajas en CF predispusieron a los pichones a la gota. Las dietas ricas en proteínas empeoraron la función renal; las concentraciones séricas de UA y Cr, así como la actividad de XOD en pollitos de 9-días de edad alimentados con dietas con 22 por ciento de PC, aumentaron significativamente. Aunque los niveles de CF del 3 al 7 por ciento no afectaron directamente la salud renal, el aumento de los niveles de CF podría acelerar el aumento de probióticos en el ciego de los pichones y retener las bacterias maléficas, aliviando la disbiosis intestinal causada por las dietas ricas en proteínas. Un análisis de la microbiota cecal a través de la secuenciación del ARN 16Sr reveló que la abundancia de Enterococcus en el grupo 22CP fue mayor que la del grupo 18CP, pero disminuyó con el aumento de los niveles de CF en el día 9. La abundancia de Lactobacillus aumentó con el aumento de los niveles de CF. Además, las concentraciones séricas más altas de LPS y citoquinas proinflamatorias y los niveles de expresión de ARNm regulados al alza en los tejidos cecal, amígdala y renal indicaron que las dietas ricas en proteínas podrían activar la vía TLR4/MyD88/NFkB e inducir inflamación tanto intestinal como renal en pichones jóvenes. Se encontró que las concentraciones de LPS en suero en el día 9 disminuyeron con el aumento de CF, aunque la alteración de los niveles de CF en la dieta no afectó directamente los índices de inmunidad sérica de los pichones. En conclusión, la dieta alta en PC ejerció un efecto negativo sobre la aparición de gota, las comunidades microbianas y la inmunorregulación en el eje intestino-riñón de los pichones, mientras que los niveles de fibra dietética adecuadamente aumentados ayudaron a mantener el equilibrio intestinal y redujeron la concentración sérica de LPS. Proponemos una dieta con un 18 % de PB junto con un 5 % de FC como la combinación óptima para la alimentación de ansarones.

Palabras clave

fibra cruda, proteína, gota de ansarón, comunidades microbianas intestinales, eje intestino-riñón,Beneficios de la Cistanche.

Haga clic aquí para saber¿Cuáles son los efectos de Cistanche en el riñón?

Introducción

Los gansos, que son herbívoros, dependen de la fibra dietética para realizar sus actividades normales. Se sabe que los niveles moderados de fibra cruda (FC) en las dietas mejoran la resistencia a las enfermedades y promueven el crecimiento de las aves de corral al modular el equilibrio microecológico intestinal y mejorar las funciones inmunitarias (Jha y Mishra, 2021) Wils-Plotz et al. (2013). informaron que la inclusión de pectina en la dieta aumentaba la expresión de IL- 12 en la mucosa ileal y aumentaba la producción de interferón-g en las amígdalas cecales. Varios estudios han indicado que una dieta baja en CF reduce la diversidad microbiana, así como la abundancia relativa de microbiota beneficiosa en el ceca de gansos en el día 70, lo que afecta negativamente el rendimiento del crecimiento, la utilización de nutrientes y la inmunidad de la mucosa intestinal de estos gansos (Li et al., 2017; Li et al., 2018a). La CF dietética puede ayudar a mantener la función de la barrera intestinal al fortalecer la estructura y la función de la mucosa, así como al aumentar la población y la diversidad de bacterias comensales en el tracto gastrointestinal. Más importante aún, se informa que las aves jóvenes son más sensibles a los cambios en los nutrientes de la dieta y las comunidades microbianas intestinales que los adultos (Gao et al., 2017). Sin embargo, los estudios sobre el efecto de los niveles de CF en la dieta sobre la microbiota intestinal y la resistencia a enfermedades en pichones son escasos.

El desempeño del crecimiento en las aves es menos sensible a los cambios en los niveles de proteína que a los cambios en la energía dietética en el alimento para satisfacer su naturaleza volitiva original (Shi et al., 2006). Se ha informado que no se observaron diferencias significativas en el aumento de peso en gansos con niveles de proteína en la dieta que oscilaban entre el 16 y el 22 por ciento, lo que parece un alcance demasiado general (Summers et al., 1986). Por el contrario, las concentraciones de proteína en la dieta ejercen un fuerte efecto sobre el equilibrio de la flora intestinal y la resistencia a las enfermedades en las aves de corral (Lee et al., 2020). La gota visceral, que ocurre principalmente en aves, es una enfermedad metabólica causada por una función renal alterada, seguida de una acumulación de cristales de urato en varios órganos (Zhang et al., 2018). Un estudio anterior nuestro demostró que las dietas ricas en proteínas estaban implicadas en la lesión renal y la disbiosis de la microbiota intestinal asociada con la gota en pichones (Xi et al., 2020a). Los resultados de este estudio mostraron que, en comparación con los pichones alimentados con dietas con 16 y 18 % de proteína cruda (PC), los pichones alimentados con dietas con 22 % de PC sufrieron lesión de las células epiteliales intestinales y disbiosis de la microbiota cecal, lo que provocó lesión renal o incluso gota de pichones. La microbiota del tracto gastrointestinal y sus metabolitos parecen desempeñar un papel central en el fortalecimiento de la inmunidad del eje intestino-riñón en las aves de corral (De Cesare et al., 2019; Xi et al., 2020b). Por lo tanto, identificar un programa nutricional apropiado, que se centre en los efectos de los niveles dietéticos de CF y CP, puede ayudar a minimizar la incidencia de gota y mejorar la inmunidad al mantener el equilibrio microecológico intestinal y mejorar la regulación inmunitaria relativa en los pichones.

El microbioma intestinal ejerce un profundo efecto sobre la regulación inmunitaria intestinal, lo que afecta la inmunidad sistémica y contribuye al equilibrio inmunitario. Los cambios en la composición de la dieta, incluidos los niveles de PC y CF, afectan la composición y las actividades metabólicas de la microbiota que se adapta al entorno intestinal (Liu et al., 2014). En las aves de corral, cualquier alteración del microbioma puede inducir un desequilibrio en la inmunidad sistémica, lo que contribuye a una disminución de la resistencia a las enfermedades. En un estudio anterior nuestro, descubrimos que la disbiosis de la microbiota intestinal aumentaba el riesgo de gota visceral en pichones al aumentar la inflamación y la translocación de lipopolisacáridos (LPS) derivados del intestino en el eje intestino-riñón. En esta compleja cascada, la ligadura de LPS activa el factor nuclear, el potenciador de la cadena ligera kappa de la vía de las células B activadas (NF-kB) y la producción de citocinas proinflamatorias, como la interleucina 1b (IL1b) y el factor de necrosis tumoral. a (TNFa), promoviendo así el desarrollo de tolerancia inmunológica tanto en el intestino como en el riñón de los pichones (Xi et al., 2019). El presente estudio se centró en investigar las comunidades microbianas que habitan en el ciego de pichones alimentados con diferentes niveles de CP y CF en la dieta, y midió los cambios en la aparición de gota mediante el análisis de la inmunorregulación y las respuestas inflamatorias inducidas en el eje intestino-riñón.

Cistanche estandarizada

Materiales y métodos

1. Aprobación Ética

El estudio fue aprobado por el Comité de Investigación de la Academia de Ciencias Agrícolas de Jiangsu y se realizó de acuerdo con las Regulaciones de la Administración de Asuntos Relacionados con Animales Experimentales (Orden No. 63 de la Academia de Ciencias Agrícolas de Jiangsu el 8 de julio de 2014). Todos los experimentos se realizaron según las pautas ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments).

2. Diseño Experimental

Este estudio se llevó a cabo del 2 al 17 de noviembre de 2020, en el Centro de Animales Experimentales de la Academia de Ciencias Agrícolas de Jiangsu (Nanjing, China). Un total de 1,620 gansos de Taizhou (Anser domestica, 100 por ciento) de un día de edad, suministrados por Tianzhijiao Breeding Geese Limited Company (Chuzhou, China), se asignaron aleatoriamente a 6 grupos experimentales. Cada tratamiento tenía 6 repeticiones y cada repetición contenía 45 aves. Para el experimento se utilizó un diseño factorial completamente al azar 2 × 3. Se prepararon seis dietas con 2 niveles de PC y tres niveles de FC (Cuadro 1). Los 2 niveles de CP fueron 180 (18CP) y 220 (22CP) g/kg y los tres niveles de FC fueron 30 (FC bajo), 50 (FC medio) y 70 (FC alto). FC) g/kg. Todos los pichones se criaron en un galpón termostático con jaulas de acero inoxidable de idéntico tamaño (1,20 £ 1,00 £ 0,50 m3, 9 pichones por jaula, densidad de población: 7,5 aves/m2), que se colocaron a 0,50 m del suelo. Los pichones fueron alimentados bajo condiciones estándar de manejo con alimento granulado y agua ad libitum. El número de comederos colgantes y bebederos de niple en cada jaula fue suficiente durante todo el estudio. La temperatura ambiente se mantuvo a 30 grados desde el día 0 al 3, 29 grados desde el día 4 al 6, 28 grados desde el día 7 al 9 y 26 grados desde el día 10 hasta el final del experimento. La humedad relativa a lo largo del 21-d período experimental fue de aproximadamente el 60 por ciento. Las fuentes de luz (luz blanca, 400 −760 nm) se igualaron a una iluminancia de 15 § 0,3 lux al nivel de la cabeza del pájaro, con un horario de luz de 22 h de luz desde d 0 a 3, 18 h de luz desde d 4 a 14, y 16 h de luz desde d 15 a 21 en un ciclo de 24-h.

The basal diet was formulated to meet or exceed National Research Council (NRC, 1994) nutrient requirements for growing geese. The composition of experimental diets is presented (Table 1). Dietary samples (>1 por ciento de alimento fresco) adquiridos al azar de 5 lugares se mezclaron para el análisis. CP y CF se midieron de acuerdo con GB/T6432 (estándar nacional chino: determinación de proteína cruda en el alimento) y GB/T6434 (estándar nacional chino: determinación de fibra cruda en el alimento).

El ADFI y el BW (peso vivo) de los pichones se registraron usando una balanza electrónica (YP60001, Hengji, Shanghái, China) antes de alimentarlos durante la prueba y se calcularon el ADG y el índice de conversión alimenticia (FCR) al final del experimento. Además, la morbilidad acumulada de la gota de todas las réplicas (cada réplica contenía 45 aves) entre diferentes tratamientos se sumó después del período experimental. El estándar de selección para la gota se definió como un ansarón que presentaba lesiones renales macroscópicas y una concentración sérica de ácido úrico (AU) por encima del valor marginal de sobresaturación de urato (macho, 416 mmol/L y hembra, 357 mmol/L). Las lesiones macroscópicas predominantes típicas de los riñones son pálidas, moteadas e hinchadas, y los túbulos renales y los uréteres están distendidos con exceso de uratos (Xi et al., 2020a).

Herba Cistanche

3. Medición de metabolitos séricos

Treinta y seis pichones (n=6 pichones/tratamiento) se eligieron aleatoriamente para la extracción de sangre inmediata (5 ml/ pichon), después de la decapitación, a través de tubos de recogida de sangre sin anticoagulante en los días 9 y 18, respectivamente. Todas las muestras de sangre se incubaron a 37 grados durante 2 h después de la recolección y se centrifugaron a 1,5{{10}}0 £ g durante 15 min. Los sueros obtenidos se almacenaron en tubos Eppendorf de 0,6 mL a 80 grados hasta su posterior análisis. Los niveles séricos de AU se determinaron mediante colorimetría con ácido fosfotúngstico. Las concentraciones de creatinina (Cr) y nitrógeno ureico (UN), así como la actividad de xantina oxidasa (XOD) se determinaron mediante colorimetría enzimática utilizando un espectrofotómetro de microplacas (Promega Corporation, Madison, WI). Estos kits fueron suministrados por el Instituto de Bioingeniería de Jiancheng (Nanjing, China); los códigos eran C012 (UA), C011-2 (Cr), C013-2 (UN) y A002 (XOD). Las concentraciones séricas de IgM, IgA e IgG en los gansos experimentales se midieron utilizando kits ELISA de inmunoglobulina de ganso adquiridos de Shanghai J&I Biotechnology Co., Ltd (Shanghai, China). La concentración de inmunocomplejos circulantes en suero (CIC), IL-1b y TNF-a se determinó utilizando un kit ELISA de ganso comercial (Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China). La actividad de la diamino oxidasa (DAO) se midió mediante colorimetría enzimática utilizando un analizador bioquímico automático (Hitachi, Tokio, Japón). El LPS sérico se midió utilizando el ensayo Limulus tradicional (Limulus Assay Biotechnology Company Ltd., Xiamen, China). Los rangos de detección de LPS en el ensayo Limulus oscilaron entre 0,015 y 0,6 UE/mL. Todos los materiales utilizados para la extracción de sangre y la medición de endotoxinas estaban libres de pirógenos. Todos los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras de suero se analizaron por triplicado. Los coeficientes de variación intraensayo e interensayo para los ensayos fueron<10% and <15%, respectively.

4. observación histomorfológica

Los ciegos (longitud {{0}} cm) de 36 pichones (n=6 pichones/tratamiento) se recolectaron después de la recolección de muestras de sangre en los días 9 y 18 para el análisis histológico. Las muestras recolectadas de pichones se fijaron en paraformaldehído al 4 por ciento, se incluyeron en parafina y se seccionaron (grosor de rebanada: 3 mm; 4 rebanadas por pichona). Los cambios patológicos en el ciego (aproximadamente 7 cm distales al esfínter pilórico) se examinaron bajo un microscopio óptico (OLYMPUS, Tokio, Japón) después de la tinción con hematoxilina y eosina (HE). La altura de las vellosidades y la profundidad de las criptas del ciego se midieron utilizando el software ImageJ (versión 1.8.0; Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD). Se registraron ocho mediciones de diferentes vellosidades intactas por corte (8 mediciones en 3 campos de visión sucesivos). Los análisis estadísticos de las mediciones histológicas se realizaron en base a un promedio de 32 mediciones por pichones (4 cortes por pichones y 8 mediciones por corte). La densidad de células caliciformes se calculó como el recuento de células caliciformes dividido por la longitud de las vellosidades correspondiente, que luego se promedió y expresó como el número de células caliciformes por 100 mm de longitud de las vellosidades.

Cistanche tubulosa

5. 16S rRNA Secuenciación del contenido del ciego

El contenido del ciego de pichones (6 pichones/tratamiento £ 6 grupos £ muestreo dos veces=72 pichones) se recolectó el día 9 y el día 18 en viales criogénicos estériles de 2 ml con rosca interna y se almacenó inmediatamente en nitrógeno líquido para el análisis de ADNr 16S . El ADN de las muestras del contenido del ciego se extrajo con un kit de ADN genómico MicroElute (D3096-01, Omega Biotek Inc., Norcross, GA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se procesaron muestras en blanco que consistían en hisopos sin usar mediante extracción de ADN y se verificó que no produjeran amplicón 16S. El ADN total se eluyó en 50 ml de tampón de elución usando un procedimiento modificado descrito por el fabricante (QIAGEN, Dusseldorf, Alemania) y se almacenó a 80 grados.

Usando el ADN total de las muestras como plantilla y cebadores de ADNr 16S (343F - 50 - TACGGRAGGCAGCAG -30; 798R - 50 - AGGGTATCTAATCCT-30 ), amplificamos la región V3−V4 de bacterias ARNr 16S. Todas las reacciones se llevaron a cabo en una mezcla de 25 ml (volumen total) que contenía 25 ng de extracto de ADN genómico, 12,5 ml de PCR Premix, 2,5 ml de cada cebador y agua de grado PCR para ajustar el volumen. Los productos de PCR se normalizaron con un normalizador de PCR AxyPrep Mag (Axygen Biosciences, Union City, CA), que permitió omitir el paso de cuantificación, independientemente del volumen de PCR enviado para la secuenciación. Los grupos de amplicones se prepararon para la secuenciación utilizando perlas AMPure XT (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA; realizado por OebioTech Co., Ltd, Shanghái, China). El tamaño y la cantidad de la biblioteca de amplicones se evaluaron utilizando LabChip GX (Perkin Elmer, Waltham, MA) y un kit de cuantificación de biblioteca Kapa para Illumina (Kapa Biosciences, Woburn, MA), respectivamente. La biblioteca PhiX Control (v3) (Illumina) se combinó con la biblioteca de amplicón (se esperaba un 30 por ciento). La biblioteca se agrupó a una densidad de aproximadamente 570 K/mm2. Las bibliotecas se secuenciaron en ejecuciones 300PE MiSeq, donde una biblioteca se secuenció con ambos protocolos utilizando cebadores de secuenciación estándar de Illumina, eliminando así la necesidad de una tercera (o cuarta) lectura de índice. Las lecturas se filtraron utilizando información cuantitativa sobre la ecología microbiana (QIIME;) filtros de calidad. La tubería CDHIT se utilizó para seleccionar unidades taxonómicas operativas (OTU) mediante la preparación de una tabla OTU. Las secuencias con un 97 por ciento de similitud se asignaron a las OTU. Se eligieron secuencias representativas para cada OTU y luego se asignaron datos taxonómicos a cada secuencia representativa utilizando el clasificador Ribosomal Database Project (RDP). El número de acceso de GenBank de estas secuencias de nucleótidos de OTU es SAMN21014082. Para estimar la diversidad alfa, se enrareció la tabla OTU y se calcularon las siguientes 4 métricas: la métrica Chao1 para estimar la riqueza; la métrica de especies observadas como un recuento de OTU únicas encontradas en la muestra; el índice de Shannon; y el índice de Simpson.

6. PCR en tiempo real

ings (n {{0}} pichones/tratamiento) se recolectaron en los días 9 y 18 para el análisis de PCR en tiempo real (RT-PCR). El ARN total se extrajo de los tejidos con el reactivo TRIzol (Life Technologies, Grand Island, NY) y se transcribió de forma inversa con un kit Reverse Transcription Levels (TaKaRa, Dalian, China), según el protocolo del fabricante. Se usó b-actina como control invariable. Los cebadores se diseñaron utilizando el software Primer Premier 5.0 y sus secuencias se enumeran (Tabla 2). La RT-PCR se realizó utilizando SYBR Premix Ex Taq (Roche, Basilea, Suiza). Todas las RT-PCR se realizaron por triplicado. Los niveles de expresión relativos de los genes diana se determinaron utilizando los métodos 2 DDCt.

7. Análisis de datos

Los datos experimentales derivados de 6 réplicas por tratamiento se analizaron usando el programa IBM SPSS Statistics 16 (IBM Corporation, Somers, NY). Cada réplica se consideró como una unidad experimental y el procedimiento estadístico utilizado fue un análisis de varianza multivariado utilizando el procedimiento de modelo lineal general (GLM). Cuando se determinaron diferencias significativas, las medias de los tratamientos se separaron y compararon usando la prueba de rango múltiple de Duncan. Una prueba de dos colas se consideró estadísticamente significativa a un nivel de probabilidad de menos del 5 por ciento (P < 0.05).

Yumeng Xi*, Yuanpi Huang,y Yue Li*, Yunmao Huang#, Junshu Yan* y Zhendan Shi*.

* Laboratorio Clave para la Agricultura Integrada de Cultivos y Animales del Ministerio de Agricultura y Asuntos Rurales, Instituto de Cría de Animales, Academia de Ciencias Agrícolas de Jiangsu, Nanjing 210014, China;

# Facultad de Ciencias Animales, Universidad de Agricultura e Ingeniería de Zhongkai, Guangzhou 510000, China.