Parte Ⅰ El quelante de hierro, PBT434, modula el tráfico de hierro transcelular en las células endoteliales microvasculares del cerebro

Abstracto

El hierro y otros metales de transición, como el cobre y el manganeso, son esenciales para apoyar la función cerebral, pero la acumulación excesiva es citotóxica. Esta acumulación excesiva de metales, particularmente de hierro, es común a varios trastornos neurológicos; estos incluyen la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la ataxia de Friedrich y otros trastornos que se presentan con neurodegeneración y acumulación de hierro cerebral asociada. La gestión del flujo de hierro por la barrera hematoencefálica proporciona la primera línea de defensa contra la acumulación excesiva de hierro en la fisiología normal y estas condiciones patológicas. En este estudio, determinamos que el quelante de hierro PBT434, que actualmente se está desarrollando para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson y la atrofia multisistémica, modula la captación de hierro por parte de las células endoteliales microvasculares del cerebro humano (hBMVEC) mediante la quelación del Fe extracelular.^{2 más}. El tratamiento de hBMVEC con PBT434 da como resultado un aumento en la abundancia de las transcripciones para el receptor de transferrina (TfR) y la ceruloplasmina (Cp). Los análisis de Western blot y ELISA también revelan un aumento correspondiente en las proteínas. Dentro de la célula, PBT434 aumenta el nivel detectable de Fe caritativo y lábil^{2 más}; Los datos indican que este Fe^{2 más}se libera de la ferritina. Además, PBT434 potencia la salida de hierro probablemente debido al aumento del hierro ferroso citosólico, el sustrato del exportador de hierro, la ferroportina. PBT434 se equilibra rápida y bidireccionalmente a través de una barrera hematoencefálica hBMVEC. Estos resultados indican que el complejo de hierro PBT434-no es un sustrato para la captación de hBMVEC y, por lo tanto, respaldan un modelo en el que PBT434 quelaría el hierro intersticial e inhibiría la recaptación de hierro por parte de las células endoteliales de la barrera hematoencefálica, como así como inhibir su captación por las demás células de la unidad neurovascular. En general, esto presenta un mecanismo novedoso y prometedor para la quelación terapéutica del hierro.

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Introducción

La terapia de quelación de metales (MCT) se ha utilizado durante mucho tiempo como tratamiento para el envenenamiento por metales de transición y para los trastornos genéticos en el metabolismo de un ion metálico esencial que conduce a la sobreacumulación del metal [1–3]. Dos ejemplos de esto último son la hiperacumulación de cobre en la enfermedad de Wilson [4] y de hierro en la hemocromatosis hereditaria [5]. Tanto el cobre como el hierro son catalizadores del estrés oxidativo y, por lo tanto, son citotóxicos en concentraciones que superan la capacidad de la célula y el organismo para "acompañar" a estos metales de transición redox activos [6, 7]. La acumulación de hierro, en particular, es ampliamente idiopática; de hecho, un aumento en el hierro es un sello distintivo de un cerebro que envejece [8-10]. Patológicamente, esta acumulación de hierro en el cerebro es una característica de mutaciones en genes no relacionados con el metabolismo del hierro [11–15], así como una variedad de otras enfermedades neurodegenerativas, algunas de las cuales carecen de un vínculo genético específico, como el envejecimiento [16], la enfermedad de Alzheimer [ 17], Ataxia de Friedreich [18] y Enfermedad de Parkinson [19]. Como grupo, estos trastornos pueden considerarse como neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro (NBIA, por sus siglas en inglés), aunque este acrónimo comúnmente se ha restringido a aquellos para los que se ha identificado un vínculo genético [11, 13, 14].

En el caso de sobrecarga de hierro, el objetivo es 'limpiar' el cuerpo del exceso de hierro debido a un defecto en la absorción o salida de hierro celular. Aquí el objetivo es superar a los quelantes de hierro fisiológicos con el fármaco; el fármaco diana es un compuesto que tiene una buena farmacocinética y una gran afinidad por el hierro ferroso. Dado que el cuerpo está repleto del metal esencial, hay poca preocupación por inducir una deficiencia en el curso del tratamiento. El tratamiento de la enfermedad cerebral con terapia de quelación de hierro requiere una estrategia diferente. Este no es un problema de sobrecarga sistémica de hierro, sino de acumulación de hierro en áreas de patología con secuelas dañinas aguas abajo. La acumulación de hierro asociada con la edad en la enfermedad de Parkinson (EP), por ejemplo, contribuye potencialmente al daño celular relacionado con el estrés oxidativo [20]. El exceso de hierro lábil promueve el mal plegamiento de la -sinucleína en las neuronas de la sustancia negra. El uso de un quelante de alta afinidad puede conducir a cierta reducción en la carga de hierro en el cerebro, pero seguramente inducirá una deficiencia de hierro que, al menos en la población anciana, está contraindicada dada la deficiencia sistémica de hierro común a ese grupo de edad [21] . Un quelante con una afinidad óptima tiene el potencial de reducir la acumulación de hierro, así como el estrés oxidativo concomitante debido al exceso de hierro lábil y los procesos patológicos subyacentes.

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Un quelante aprobado para su uso en el tratamiento de la sobrecarga de hierro inducida por transfusiones en pacientes con talasemia es la deferiprona (DFP, nombre comercial Ferriprox) [5, 22]. La DFP también se ha utilizado para tratar la ataxia de Friedreich [23] y la enfermedad de Parkinson [24, 25]. En un metanálisis, se demostró que la DFP proporciona reducciones significativas en el contenido de hierro miocárdico, así como una mayor protección cardíaca en pacientes con talasemia que la deferoxamina, el agente quelante de hierro clásico [5]. Por otro lado, la DFP se metaboliza rápidamente en el hígado [26] y trabajos más recientes han demostrado que quela Fe2 plus en el sitio activo de las histonas lisina desmetilasas dependientes de hierro, una actividad que se correlaciona con una citotoxicidad previamente no reconocida [27]. Este hallazgo subraya una limitación clave en el uso de la terapia de quelación de hierro, a saber, la competencia del fármaco por el hierro fisiológicamente esencial, ya sea en una reserva de hierro o en una proteína que alberga una especie protésica de hierro. No obstante, DFP, por ejemplo, ha demostrado su eficacia en un ensayo de Fase 2 del tratamiento de la enfermedad de Parkinson como lo indican los índices analíticos (reducción de la carga de hierro en el cerebro mediante resonancia magnética ponderada T2-) y conductuales (función cognitiva y de las neuronas motoras) [ 24, 25].

Sin embargo, la afinidad de DFP por Fe3 plus sigue siendo motivo de preocupación. La especie de hierro DFP estable es el complejo tris, [Fe(DFP)3] 0 [28]. Si bien la neutralidad de este complejo es ideal para movilizar el hierro fuera de la célula, la constante de estabilidad para él, ~1037, hace que DFP sea un verdadero eliminador de hierro; en este contexto, su inhibición de una enzima de hierro como la lisina desmetilasa es predecible [27]. Esta preocupación refleja la necesidad de desarrollar quelantes de hierro que tengan la permeabilidad de membrana de DFP pero una afinidad significativamente más débil tanto para Fe2 plus como para Fe3 plus. Esta última característica limita la eliminación del fármaco del metal protésico y el potencial termodinámico del agente quelante para catalizar la autooxidación del hierro ferroso que da como resultado la producción de especies reactivas de oxígeno. En esencia, los fuertes quelantes de hierro férrico catalizan la propiedad prooxidante de Fe2 plus [29]. En este estudio, informamos cómo un quelante de hierro con afinidades moderadas de hierro férrico y ferroso modula el flujo de hierro en las células endoteliales microvasculares del cerebro que forman la barrera hematoencefálica (BBB).

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Este fármaco, PBT434 [5,7-dicloro-2-((metilamino)metil)-8-hidroxi-3-metilquinazolina-4 (3H)-ona, figura 1A] , forma un complejo de bis-hierro con constantes logarítmicas de estabilidad de ~11 y ~15 para Fe^{2 más}y fe^{3 más}, respectivamente [30]. PBT434 evitó la pérdida de neuronas de la sustancia negra pars compacta (SNpc), redujo la acumulación de nigral-sinucleína, redujo el contenido de hierro relacionado con el modelo de la enfermedad de EP en el mesencéfalo y rescató el rendimiento motor en dos modelos de ratón con la enfermedad de Parkinson sin ningún agotamiento aparente de las reservas sistémicas de hierro [30]. PBT434 también es eficaz en modelos murinos de atrofia multisistémica (MSA) [30, 31], un trastorno motor similar en presentación al Parkinson pero que se caracteriza por un plegamiento incorrecto de la sinucleína y la posterior acumulación que causa la formación de inclusiones citoplásmicas gliales que son el sello distintivo patología de la enfermedad [32]. De manera significativa, PBT434 redujo los marcadores de estrés oxidativo en modelos de enfermedad de Parkinson en ratones [30], lo que indica que 1) PBT434 se dirigía a las reservas de hierro que, de otro modo, estaban preparadas para funcionar como prooxidantes y 2) PBT434 no potenciaba esta citotoxicidad incipiente basada en la oxidación. PBT434 ha completado satisfactoriamente un estudio de Fase 1 [33].

El trabajo presentado aquí fue diseñado para interrogar el impacto que tiene PBT434 en el tráfico de hierro en las células de barrera del cerebro, las células endoteliales microvasculares que, junto con la glía subyacente, forman la barrera hematoencefálica. Estos estudios han utilizado una línea celular endotelial inmortalizada bien validada en formatos de cultivo en monocapa y transwell [34–37]. El objetivo principal de estos estudios fue determinar la cinética de captación y salida de hierro de estas células y su modulación por PBT434. El modelo transwell BBB también se utilizó para demostrar el flujo transcelular bidireccional de PBT434 a través de la barrera de células endoteliales. El modelo demostró en términos moleculares que PBT434 inhibe la absorción de hierro por quelación mientras estimula la salida de hierro. Los estudios de imágenes celulares indican que PBT434 accede al mismo grupo de hierro lábil sondeado por un Fe clásico^{2 más}agente quelante, 2,2'-bipiridina o bipiridilo, y una sonda fluorescente para hierro ferroso. Los resultados sugieren un posible mecanismo de acción para PBT434 que incluye la inhibición de la captación de hierro sistémico en la BBB y el posterior secuestro de hierro cerebral en el espacio intersticial.

Resultados

1. PBT434 no tiene efectos citotóxicos en las células endoteliales microvasculares del cerebro

Para determinar un rango apropiado de concentraciones de trabajo para PBT434 en nuestro cultivo celular in vitro, utilizamos el ensayo MTT para monitorear la función mitocondrial de hBMVEC en respuesta a PBT434. Según informes anteriores [30], se trataron con un rango de concentraciones de PBT434 de hasta 100 μM durante 24 horas. No observamos cambios significativos en la viabilidad de hBMVEC con ninguna concentración probada (Fig. 2).

2. PBT434 se absorbe rápidamente y se trafica a través de la barrera hBMVEC

PBT434 es un fármaco biodisponible por vía oral que puede penetrar fácilmente en la BBB, como se ha visto en estudios realizados en ratones y humanos [30, 38, 39]. Supervisamos la acumulación de PBT434 en hBMVEC cultivadas en monocapas usando PBT434 marcado con 14C como radiotrazador. Los datos indicaron que en la primera fase, 14C-PBT434 se equilibró rápidamente entre el medio de captación y la célula. Esta captación inicial fue seguida por una acumulación lenta adicional durante 3 h que exhibió una tasa de 30,1 ± 9,8 pmol/mg/h (Fig. 3A). En el protocolo de captación, la captación se extingue y las células se lavan a 4 °C antes de procesarlas para la acumulación de 14C-PBT434 (Métodos). En un experimento separado, examinamos la salida de 14C-PBT434 de hBMVEC después de un período de carga de 30 min. En el protocolo de eflujo, las células se lavan a 25 °C. Los datos de la figura 3B indican que en el lavado a 25 °C, se perdió aproximadamente el 92 % del 14C-PBT434 acumulado en las células (cf. 550 pmol de 14C-PBT434/mg de proteína en 3A a los 30 min a 43 pmol de 14C-PBT434/mg proteína en t=0 en 3B). Hubo una pérdida lenta adicional del 14C-PBT434 restante (Fig. 3B). Los datos sugieren dos aspectos de la acumulación y salida de PBT434 por hBMVEC. El flujo a través de la membrana plasmática alcanza rápidamente lo que parece ser un equilibrio, ya sea durante la captación o el eflujo. Sin embargo, en ambos procesos aparece otro proceso más lento. Esto sugiere que dentro de la célula, alguna fracción de la célula PBT434 está en un lugar/estado que está en una relación cinética de estado estacionario con la fracción en equilibrio con el medio extracelular. El análisis cinético observado en la figura 3B estimó que este conjunto de PBT434 estaba representado por 27 ± 4 pmol/mg de proteína en el lisado celular cuando las células se trataron con reactivo 20 μM.

Para examinar el flujo transcelular de PBT434, empleamos un modelo BBB in vitro bien validado usando crecimiento en el lado apical de una membrana transwell [35, 36, 40, 41]. Las propiedades de barrera de estos cultivos transwell se verificaron mediante la cuantificación de su resistencia eléctrica transendotelial (TEER) y su impermeabilidad al dextrano marcado con FITC (Fig. S1). Comparamos la captación de 14C-PBT434 en la membrana luminal (o apical, del lado sanguíneo) (Fig. 4A) con la captación en la membrana abluminal (o basolateral, del lado del cerebro) (Fig. 4C). En el mismo experimento, se cuantificó el eflujo correspondiente (flujo transcelular) por la aparición de 14C-PBT434 en la cámara de eflujo (figura 4, paneles B y D). Las tasas de estos procesos se proporcionan en la Tabla 1. Los datos de masa ilustrados en la Fig. 4 (paneles B y D) muestran que el flujo neto de PBT434 a través de este modelo de barrera hematoencefálica fue el mismo en las dos direcciones. Había 976±185 pmol de 14C-PBT434 acumulados en la cámara basal (Fig. 4B) y 1033±210 pmol cuantificados en la cámara basal (Fig. 4D). Esta casi equivalencia se reflejó también en las tasas muy similares de salida de PBT434 en las dos membranas de barrera (Tabla 1). Sin embargo, hubo una captación significativamente mayor de PBT434 en la membrana basolateral en este modelo de barrera, como lo ilustra la pérdida de compuesto de la cámara basal ~50 % mayor (Fig. 4C) que correspondía a una tasa de captación celular aparente ~40 % mayor (Tabla 1). Se pronostica que una absorción más robusta daría como resultado una mayor acumulación. El análisis de las células a las 3 h mostró que retenían ~6 μM de PBT434 independientemente de la dirección del flujo. Los valores fueron 8,1 ± 1,3 μM (apical a basal) y 4,7 ± 1,2 μM (basal a apical). Como se indicó anteriormente, este análisis sigue al lavado de las células antes de la lisis y la cuantificación de la proteína celular total y 14C-PBT434. Además, el medio en la cámara apical contenía RPMI más 10 por ciento de FBS y 10 por ciento de NuSerum, mientras que la cámara basal del "cerebro" contenía solo RPMI (Métodos). Una inferencia razonable fue que la mayor "captación" en la membrana basal reflejaba una adsorción de PBT434 en la superficie celular que estaba limitada en la cámara apical por la presencia de componentes proteicos en el suero. Al lavar las células para la acumulación de PBT434, se eliminó este material adsorbido (que se registró como "captación"). La repetición de este experimento de flujo pero con suero en la cámara basal demostró que, de hecho, el suero suprimió esta probable adsorción de PBT434 en la superficie celular (Fig. S2).

3. PBT434, a diferencia del bipiridilo, no limita la disponibilidad intracelular de hierro lábil

Dado que PBT434 tiene una afinidad más moderada por el hierro en comparación con los quelantes de hierro clásicos, como la deferiprona o el bipiridilo, examinamos cómo se reflejaba esa diferencia en el efecto de PBT434 en la reserva de hierro lábil celular (LIP) de hBMVEC. Para ello, aprovechamos el permeable, Fe^{2 más}-Tinte fluorescente específico FerroOrange, que reacciona con el hierro citoplasmático benéfico. Vimos una ablación significativa de la fluorescencia en las células cuando se trataron con bipiridilo, consistente con la quelación del LIP por este quelante de hierro ferroso de alta afinidad y, por lo tanto, bloqueando la acción del indicador de hierro fluorescente (Fig. 5A). Por el contrario, PBT434 no compitió con FerroOrange por Fe^{2 más}, un comportamiento consistente con su afinidad más moderada [30]. Los resultados mostraron que PBT434, pero no el derivado inactivo de PBT434-met, indujo un aumento del 34 ± 9 por ciento en Fe accesible con FerroOrange.^{2 más}lo que sugiere que este agente quelante movilizó el hierro dentro de la célula sin toxicidad concurrente. Los datos presentados a continuación sugieren que este hierro proviene de la ferritina.

Se demostró previamente que PBT434 restaura la expresión de la proteína ferroportina empobrecida en ratones tratados con MPTP a un nivel similar al de los ratones no lesionados [30]. Este resultado, junto con el aumento de la tinción de hierro ferroso intracelular en respuesta a PBT434, sugirió un efecto potencial en el sistema de respuesta de hierro celular y la función de las proteínas relacionadas con el hierro aguas abajo. Para evaluar esto, primero realizamos un análisis de PCR cuantitativo (qPCR) del efecto PBT434 sobre la abundancia de las transcripciones para varias proteínas que manejan el hierro (Fig. 6). Si bien las transcripciones de la proteína de salida de hierro, ferroportina (Fpn), y las dos chaperonas de hierro citoplasmáticas, PCBP1 y 2, no se vieron afectadas, la abundancia de los ARNm para el receptor de transferrina (TfR) y la ferroxidasa, ceruloplasmina (Cp), sí lo hicieron. cambiar. Las transcripciones de TfR y Cp aumentaron 2,8 y 3,6-veces, respectivamente. La expresión del receptor de transferrina (TfR) está vinculada al sistema del elemento sensible al hierro (IRE)/proteína reguladora del hierro (IRP) [42–44]. El aumento en el ARNm de TfR sugiere que PBT434 compite con la entrega de hierro dependiente de PCBP1-para el ensamblaje del grupo Fe, S que convierte la IREBP reguladora de una proteína de unión a ARN en aconitasa citosólica [45]. Por lo tanto, PBT434 cambia esta modulación reguladora hacia la unión al ARN y la correspondiente inhibición de la degradación del ARNm de TfR. En la deficiencia de hierro celular, la expresión de Cp está, en parte, regulada por HIF-1 [46]. Un aumento en la función HIF-1 se deriva de la eliminación de su hidroxilación por la actividad de prolil hidroxilasa en una reacción dependiente de hierro [47]. Como en el caso de IREBP, PBT434 parece disminuir la reserva de hierro que sirve como cofactor en la hidroxilación y degradación de HIF-1. En este modelo, el aumento en el nivel de estado estacionario de este activador transcripcional aumenta la transcripción de Cp.

Utilizando una combinación de análisis ELISA y transferencia Western, probamos la expresión de proteínas de manejo de hierro en PBT434 o PBT434-met tratado con hBMVEC; En la Fig. 7A se dan ejemplos de los análisis de WB. Los datos mostraron que la abundancia de monómero y dímero de TfR aumentó significativamente a las 24 horas, al igual que Cp (Fig. 7B y 7C). Ambos aumentos fueron paralelos al aumento dependiente de PBT434-en las respectivas transcripciones (Fig. 6). Por el contrario, la expresión de la proteína de salida de hierro, Fpn, fue insensible al tratamiento con PBT434 (Fig. 7D).

Usamos ELISA como un método adicional para cuantificar los cambios de pliegue indicados por los datos de Western blot. Por lo tanto, hBMVEC se trató con PBT434 durante 24 h y los lisados ​​celulares se analizaron mediante ELISA para TfR (Fig. 8A). El aumento de veces en TfR en respuesta al tratamiento con PBT434 cuantificado por ELISA fue equivalente al proporcionado por el análisis de las transferencias Western (Fig. 7B). También se usó ELISA para evaluar la abundancia de proteína Cp secretada y ligada a GPI, usando células HepG2 como control positivo. Con respecto a la Cp secretada en los medios de crecimiento, este enfoque estaba limitado porque la abundancia de sCp tanto en los medios acondicionados con HepG2 como con hBMVEC estaba en el límite inferior de sensibilidad de este ensayo o por debajo de este (Fig. S3). Sin embargo, permitió la evaluación de la abundancia de GPI-Cp. En este método, las células se trataron con fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (PI-PLC), que escinde el anclaje GPI; los medios así acondicionados se concentraron y analizaron por Cp-ELISA. Si bien este enfoque demostró que PBT434 aumentó la cantidad de GPI-Cp en las células HepG2, nuevamente falló en detectar cualquier Cp liberado por el PI-PLC (Fig. 8B). ELISA también proporcionó un método directo para la cuantificación de ferritina. Para ello, se cargaron hBMVEC con citrato de Fe 1 uM durante 24 h, seguido de tratamiento en ausencia o presencia de PBT434 durante 1 h adicional. Los lisados ​​celulares resultantes se sometieron a análisis ELISA para ferritina (Fig. 8C). En contraste con el aumento de TfR, el tratamiento con PBT434 eliminó la proteína ferritina (Ft) en ~18 por ciento. De hecho, esta pérdida de proteína Ft fue evidente después de solo 1 h de tratamiento con el reactivo. La naturaleza temporal de este resultado se puede correlacionar con el aumento de Fe2 caritativo más señalado anteriormente después de un tratamiento de 30 minutos con PBT434. Como se comenta más adelante, se ha demostrado la eliminación de la ferritina después del tratamiento con otros agentes quelantes Fe2 más permeables a las células [48].

4. ⁵⁵Fe^{2 más}la captación se inhibe por complejación con PBT434

Dado el rápido equilibrio de PBT434 en hBMVEC en 30 minutos, en comparación con la absorción bifásica lenta y el equilibrio de Fe2 plus durante 24 horas [49], planteamos la hipótesis de que PBT434 y Fe2 plus no compartían el mismo mecanismo de absorción. Para probar esto, las monocapas se incubaron con 55Fe2 plus radiomarcado en ausencia o presencia de PBT434 o PBT434-met, y se controló la absorción de 55Fe2 plus durante 3 h (Fig. 9A). PBT434 disminuyó significativamente la tasa de absorción de 55Fe2 plus, así como también disminuyó la acumulación general de 55Fe2 plus en los lisados ​​celulares (Fig. 9C). Este efecto no se observó con PBT434-met. La comparación de las tasas de absorción de PBT434 con 55Fe indica que PBT434 y Fe2 plus son absorbidos por rutas de transporte separadas. Además, la inhibición de la captación de 55Fe en presencia de PBT434 pero no de PBT434-met sugiere que un complejo extracelular de hierro PBT434-no es un ligando para los transportadores de hierro ferroso en hBMVEC, concretamente ZIP8, y ZIP14.

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Para examinar más a fondo el papel de PBT434 en la acumulación de hierro, probamos el efecto que tuvo su exposición previa en la absorción de 55Fe2 plus. Las células pretratadas con PBT434 que, después del lavado, se expusieron a 55Fe2 plus mostraron un aumento en la tasa de captación y acumulación de 55Fe2 plus después de 3 h (Fig. 9, paneles B y D). Esta mayor acumulación se mantuvo durante al menos 24 horas. Estos datos sugieren que la exposición previa de las células a PBT434 potencia transitoriamente la absorción de hierro. Inesperadamente, el pretratamiento con PBT434-met también mostró un aumento tanto en la captación como en la acumulación (Fig. 9B), pero este efecto no fue tan significativo ni persistente como el que mostró PBT434.

Hemos demostrado que la absorción de hierro de la 59Fe-transferrina está respaldada por ferri-reducción y ferro-permeación en la membrana plasmática de have [50, 51]. Un resultado experimental que respalda este modelo de captación de hierro TBI fue la eliminación de esta captación mediante la inhibición de la actividad de la ferrirreductasa extracitoplasmática; otro resultado fue una inhibición del 60 por ciento de la absorción de hierro TBI por parte de la ferrozina, un fuerte agente quelante del hierro ferroso [50]. Esta última estrategia se utilizó para demostrar que PBT434, pero no PBT434-met, también inhibía la captación de hierro TBI (Fig. 10).

5. PBT434 estimula la salida de 55Fe2 más dependiente de Fpn

PBT434 tiene aproximadamente el 20 por ciento de la capacidad de la deferiprona para producir una estimulación aparente de Fe2 más la salida de las células neuronales [30]. Evaluamos la salida de 55Fe2 plus de hBMVEC en ausencia o presencia de PBT434 en células de control o células tratadas con una mini-hepcidina, PR73. La hepcidina es una hormona peptídica que se encuentra tanto sistémicamente como en el intersticio cerebral que se une a Fpn y se dirige al transportador para su degradación. Los efectos de la hepcidina sobre la función de exportación de hierro de Fpn se han estudiado ampliamente [52-54]. Anteriormente hemos demostrado que el flujo de salida de Fe2 plus de hBMVEC depende de Fpn [35, 49]. PR73 tiene una EC50 de ~4 nM para la degradación de Fpn en un ensayo de indicador GFP [55]. Se cargaron hBMVEC en monocapas con 55Fe2 plus durante 24 h en ausencia o presencia de PR73. Luego se cuantificó el flujo de salida de 55Fe durante un período de 5 horas en ausencia o presencia continua de PR73 en combinación con la ausencia y presencia de PBT434 (Fig. 11). Mientras que PR73 eliminó la salida de 55Fe tanto de los cultivos de control como de los tratados con PBT434-, PBT434 suprimió parcialmente la inhibición debida a la minihepcidina. En ausencia de PBT434, la salida de hierro de los cultivos tratados con PR73-se eliminó en ~75 por ciento, mientras que la eliminación en los cultivos tratados con PBT434-fue solo de ~50 por ciento (Fig. 11 y Tabla 2). Dos inferencias se pueden sacar de estos resultados. En primer lugar, la caída de Fpn por PR73 regula a la baja el flujo de salida de 55Fe tanto en presencia como en ausencia de PBT434. En segundo lugar, en cualquier condición, PBT434 soporta una estimulación significativa, aunque pequeña, de la salida de hierro.

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Danielle K. BaileyID, Whitney Clark, Daniel J. Kosman

Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina y Ciencias Biomédicas Jacobs, Universidad Estatal de Nueva York en Buffalo, Buffalo, NY, Estados Unidos de América