Parte Ⅱ: La AKT1 mitocondrial tubular se activa durante la lesión por reperfusión por isquemia y tiene un papel crítico en la predisposición a la enfermedad renal crónica.
Apr 04, 2023
Aumento de AKT1 mitocondrial del túbulo renal protegido contra AKI y posterior ERC
Dado que la inhibición de AKT1 en las células epiteliales renales exacerba la función renal y la supervivencia de los animales después de la IRI, a continuación investigamos si la señalización de AKT1 mitocondrial tubular mejorada podría proteger al riñón de la IRI. Con este fin, generamos una línea de ratón de dos genes con la expresión específica de células tubulares de AKT1 (mcaAKT) (ratones KMCAKT) inducido por tam inducido por mitocondrias constitutivamente activo (ratones KMCAKT) mediante la misma estrategia que desarrollamos para ratones KMDAKT. Los resultados de la transferencia Western mostraron que en las mitocondrias de los ratones TAM-KMCAKT, AKT1 constitutivamente activo se expresaba específicamente en el riñón, mientras que estaba ausente y era específico del riñón en los ratones de control. Como antes, para verificar que el mutante AKT1 se localiza en las mitocondrias en los túbulos, la tinción de inmunofluorescencia mostró la colocalización del mutante AKT1 y las mitocondrias. No se detectó AKT1 mutante fuera de los túbulos. Para evaluar la actividad de mcaAKT, comparamos la actividad de la enzima AKT1 en mitocondrias aisladas de ratones tratados con TAM y aceite de maíz. Como era de esperar, la actividad de AKT1 mitocondrial renal aumentó significativamente en ratones TAM-KMCAKT.
Investigar si la mejora de AKT1 mitocondrial tubular podría mejorar el resultado de IRI en ratones TAM-KMCAKT y aceite de maíz-KMCAKT usando IRI unilateral mientras que Nx contralateral inducía AKI. BUN sérico fue elevado en aceite de maíz-KMCAKTratones en los días 7 y 45 después de IRI en comparación con ratones TAM-KMCAKT (p=0.03). La Cr fue significativamente más baja en los ratones TAM-KMCAKT los días 2, 7 y 45 después de la IRI. Estos resultados sugieren que la mejora de la AKT mitocondrial en los túbulos renales atenuó la LRA inducida por IRI y mejoró el deterioro de la función renal y el posterior desarrollo de la ERC. La histología de estos ratones mostró que la lesión renal fue más grave en los ratones inyectados con aceite de maíz. En comparación con los riñones TAM KMCAKT, la lesión tubular tenía puntuaciones de Jablonski más altas, pérdida del borde en cepillo tubular, lisis tubular y más residuos luminales intratubulares (p=0.038). La tinción con tricrómico de Masson mostró un área fibrótica reducida (porcentaje) en ratones TAM-KMCAKT después de IRI (p<0,001). hubo menos lesión tubular y menor expresión de KIM-1 en los riñones TAM-KMCAKT. El ensayo TUNEL mostró un aumento de las células apoptóticas en el aceite de maízKMCAKTriñones después de IRI. En riñones TAM-KMCAKT, la apoptosis tubular se redujo en un 52 por ciento y la apoptosis glomerular en un 46 por ciento (p=0.0064 y p=0.0021). la activación de Caspasa 3 y 9 fue inhibida correspondientemente por la activación de AKT1 mitocondrial en los túbulos. La gravedad de la glomeruloesclerosis evaluada mediante la tinción con PAS se redujo en un 38 % (p=00,001) en ratones TAM-KMCAKT en comparación con el aceite de maízKMCAKTratones 45 días después de IRI. Por lo tanto, la mejora de la AKT1 mitocondrial tubular renal protege al riñón de la apoptosis tubular inducida por IRI, previene la acumulación de desechos en los túbulos y atenúa el daño glomerular después de la lesión tubular.
Se utilizó el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier para evaluar si las alteraciones histológicas y funcionales renales mencionadas anteriormente podían inferir supervivencia. De hecho, la tasa de supervivencia de los ratones TAMKMCAKT después de la IRI fue mucho mayor que la de los ratones KMCAKT con aceite de maíz (76,9 por ciento frente a 20,8 por ciento, p<0,001). Esto sugiere quela manipulación de la señalización de AKT1 mitocondrial tubular podría considerarse un objetivo potencial para desarrollar nuevos enfoques terapéuticos para mejorar los resultados.
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AKT1 mitocondrial moduló la respiración mitocondrial y la producción de ATP en los túbulos renales
Para investigar el papel directo de AKT1 mitocondrial en las células epiteliales tubulares renales, aislamos células epiteliales tubulares renales primarias (RTE) de ratones KMDAKT. El análisis de preparaciones celulares con un anticuerpo contra el marcador de células epiteliales tubulares proximales acuaporina 1 (aquaporin1) mostró que el 97 por ciento de las células RTE expresaron este marcador (mediante recuento celular directo bajo el microscopio). 72 horas después del tratamiento con 4-OH TAM o vector, las células RTE primero se tiñeron con trazador mitótico rojo y luego se inmunotiñeron con anticuerpo anti-his-tag (verde). No hubo señal de His-Tag en las células tratadas con vector, en consonancia con la esperada ausencia de expresión de mdnAKT. Por el contrario, His-Tag se ha detectado en células tratadas con 4-OH TAM y se co-localizó con Mitotracker Red.
Para analizar cómo la señalización AKT1 mitocondrial regula la bioenergética de las células RTE, utilizamos un analizador extracelular del hipocampo para evaluar la función mitocondrial. OCR indica el valor medido de la respiración oxidativa. La respiración basal general de las células KMDAKT RTE tratadas con 4-OH TAM fue significativamente mayor que la del control (p<0.001). el perfil de respiración alternativo de las células KMDAKT RTE cultivadas con 4-OH TAM también fue mayor que el control (p={{0}}.00076). el perfil de respiración dependiente de ATP de las células KMDAKT RTE cultivadas con 4-OH TAM fue significativamente mayor que el control (p<0,001). una mayor fuga de protones en células KMDAKT RTE tratadas con 4-OH TAM indicó respiración desacoplada (p<0,001). redujo la producción de ATP en células RTE derivadas de KMDAKT después de la inducción de 4-OH TAM. La peroxidación de lípidos celulares inducida por tam fue significativamente mayor, lo que indica un nivel elevado de ROS. Las alteraciones en la fosforilación oxidativa no fueron causadas por cambios en el contenido mitocondrial de estas células. Sin embargo, en riñones TAM-KMDAKT, observamos niveles más altos de Drp1, un marcador de fisión mitocondrial, lo que sugiere que la dinámica mitocondrial está regulada. Estos resultados sugieren que la inhibición de la señalización de AKT1 mitocondrial conduce a una disfunción mitocondrial desacoplada respiratoria que, junto con una producción reducida de ATP, exacerba la apoptosis en los riñones KMDAKT bajo IRI.
También investigamos cómo la activación de AKT1 mitocondrial regula la fosforilación oxidativa en células RTE aisladas de KMCAKT. Los resultados mostraron el efecto opuesto de AKT1 mitocondrial en comparación con las células KMDAKT RTE. La respiración basal, la respiración alterna, la respiración dependiente de ATP, la fuga de protones y el potencial glucolítico fueron menores en las células cultivadas con 4OH-TAM. Estos hallazgos sugieren que la activación de AKT1 mitocondrial aumenta la eficiencia de la fosforilación oxidativa y reduce el desacoplamiento respiratorio. El análisis de drp1 mostró una tinción de drp1 más baja en los riñones TAM-KMCAKT, lo que confirma aún más la drp1 más alta en los riñones TAM-KMDAKT y la participación de AKT1 mitocondrial en la regulación de la dinámica mitocondrial.
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Discusión
El presente estudio muestra que IRI induce la activación aguda y la translocación de AKT1 en las mitocondrias de las células epiteliales tubulares proximales. La activación de AKT1 mitocondrial en el túbulo proximal en respuesta a IRI parece representar un mecanismo de autoprotección durante la isquemia-reperfusión. Esto se debe a que la inhibición de AKT1 mitocondrial tubular exacerba la AKI y promueve el desarrollo posterior de CKD después de IRI. Por el contrario, la señalización tubular mitocondrial mejorada de AKT1 protegió al riñón de la IRI y atenuó el desarrollo de la ERC. Estos datos identifican un papel novedoso para la vía de señalización AKT1 mitocondrial tubular durante la evolución de la insuficiencia renal después de la isquemia-reperfusión renal.
El papel de las mitocondrias en el túbulo renal AKI
La mayor parte de las mitocondrias renales se encuentran en los túbulos proximales. Las mitocondrias sirven como el principal orgánulo que metaboliza la producción de ATP de nutrientes. La AKT1 mitocondrial regula la fosforilación oxidativa celular, la producción de ROS y la supervivencia celular Como se muestra en este estudio, la señalización alterada de la AKT1 mitocondrial produce una respiración desacoplada y reduce la producción de ATP. Aunque la apoptosis tubular renal es un hallazgo común en varios modelos de AKI, las vías de señalización aguas arriba de las mitocondrias siguen sin comprenderse por completo. Se cree que la muerte es un factor clave en el desarrollo de AKI. Además, se cree que la reparación y regeneración tubular son los principales eventos en la recuperación de AKI. Aunque la lesión subletal puede ser reversible, la muerte de las células tubulares conduce a la pérdida inevitable de la función tubular Se han caracterizado modelos in vitro e in vivo, activación de vías apoptóticas dotadas en AKI, incluida la familia de proteínas Bcl-2 y mecanismos apoptóticos mitocondriales . Se cree que la ausencia de gradientes electroquímicos transmembrana mitocondriales es un punto de control clave para desencadenar la apoptosis. La fuga de protones mitocondriales, regulada por AKT1 mitocondrial, combinada con una síntesis reducida de ATP en este órgano demandante de energía puede contribuir al equilibrio general de señalización a favor de la apoptosis. .
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La diafonía entre los túbulos renales y los glomérulos
Desde el punto de vista anatómico, la lesión intersticial tubular puede provocar el estrechamiento de la unión glomerular-tubular y la eventual formación de glomérulos tubulares, es decir, disfunción de las células epiteliales tubulares glomerulares sin una conexión obvia con los túbulos, compresión y obstrucción de los túbulos adyacentes por la matriz intersticial. , y la transformación de las células epiteliales murales en células similares a fibroblastos son mecanismos potenciales de formación de glomérulos tubulares. La reparación incompleta del RTE puede ocurrir en el RTE proximal, especialmente en la región S1, que es sensible a la lesión isquémica en la lesión renal, lo que conduce a atrofia tubular y fibrosis intersticial.
La lesión tubular puede afectar la función de filtración glomerular a través de la retroalimentación túbulo-glomerular. La retroalimentación tubular es un mecanismo fisiológico de diafonía entre los túbulos y el glomérulo. Poco se sabe sobre la secuencia de eventos que siguen a la LRA y la relación entre la tasa de filtración glomerular y los cambios tubulares. En un estudio clínico, la formación extensa de glomérulos tubulares en pacientes con estenosis grave de la arteria renal sugirió que la isquemia crónica puede provocar daño estructural y desintegración de los túbulos renales. Por otro lado, existe amplia evidencia de que la disfunción tubular renal puede conducir a la pérdida de la polaridad de las células tubulares, la pérdida de uniones comunicantes, la muerte de las células tubulares, la obstrucción tubular subsiguiente y la lesión glomerular retrógrada.
Nuestros hallazgos brindan nuevos conocimientos sobre cómo las mitocondrias están involucradas en la defensa contra la lesión renal inducida por IRI. la inhibición de AKT1 mitocondrial durante IRI conduce a la activación de caspasas y muerte de células tubulares, lo que puede desencadenar apoptosis glomerular retrógrada, glomeruloesclerosis y fibrosis renal. La activación de AKT1 mitocondrial puede desempeñar un papel importante en la transición de AKI a CKD, ya que la inhibición de AKT1 mitocondrial durante la IRI afecta significativamente el BUN/Cr 45 días después de la IRI inicial.
La transición de AKI a CKD
El mecanismo exacto de la transición de AKI a CKD no está claro. Histológicamente, tanto la LRA como la ERC se asocian con lesión tubular renal. Durante muchos años se ha sabido que la patología intersticial tubular renal es una característica de muchos tipos de ERC. Se cree que la interrupción de la señalización intracelular en los túbulos renales desempeña un papel en el inicio y la progresión de AKI a CKD.
En la ERC, la vía de señalización del factor de crecimiento transformante (TGF) se activa y promueve la glomeruloesclerosis y la fibrosis tubulointersticial al inducir la producción de proteínas de la matriz extracelular profibrótica. Sin embargo, el papel de la señalización del TGF en la LRA es inconsistente entre los modelos experimentales. aumento de la expresión de TGF-. La hipoxia activa el factor inducible por hipoxia (HIF) para regular la transcripción de genes en AKI, y la expresión general de HIF en varios sistemas experimentales ejerce un efecto renoprotector, pero otros estudios no han podido confirmar el papel renoprotector de HIF-1.
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La evidencia actual sugiere que las mitocondrias pueden ser reguladores clave en la transición de AKI a CKD. La ablación de BAK y BAX proapoptóticos mejora la LRA isquémica e inducida por cisplatino. Se ha demostrado que la inhibición de la fragmentación mitocondrial atenúa la gravedad de la LRA isquémica en ratones diabéticos en un modelo de LRA isquémica y nefrotóxica asociada con una alta activación de la apoptosis mitocondrial. recuperación de AKI. En la ERC, la disfunción mitocondrial renal también ocurre durante el inicio y la progresión de la ERC. En la ERC, la glucosa alta y la sobrecarga de albúmina inducen la señalización mitocondrial apoptótica en las células renales. En la ERC experimental inducida por diabetes, la fragmentación mitocondrial es el resultado de alteraciones patológicas en la fusión y fisión mitocondrial.
La identificación de la histopatología intersticial del túbulo renal en la patogenia de la ERC cambia el paradigma de lesión renal del glomérulo central a un nuevo enfoque sobre el papel fisiopatológico del túbulo proximal en la LRA y su patogenia hacia la ERC. Nuestros hallazgos sugieren que la AKT1 mitocondrial puede prevenir indirectamente el desarrollo de la glomeruloesclerosis al mantener la integridad estructural y funcional de los túbulos renales. Los datos proporcionados en este estudio ayudan a llenar un vacío importante en el conocimiento sobre el papel de las mitocondrias tubulares renales proximales en AKI y su posterior transición a CKD mediante la activación y translocación de AKT1 en las mitocondrias. Los estudios futuros deberían confirmar el papel de AKT1 mitocondrial en la lesión renal humana y explorar objetivos potenciales en la vía de señalización de AKT1 mitocondrial que podrían usarse para mejorar el resultado de la insuficiencia renal.
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