Parte Ⅰ: la AKT1 mitocondrial tubular se activa durante la lesión por reperfusión por isquemia y tiene un papel crítico en la predisposición a la enfermedad renal crónica.
Apr 03, 2023
Abstracto
La disfunción tubular renal puede conducir a una lesión renal aguda y la transformación en una enfermedad renal crónica. Aunque las mitocondrias tubulares están asociadas con la fisiopatología de la insuficiencia renal, el mecanismo no está claro. Aquí, demostramos que la lesión por isquemia-reperfusión induce la translocación aguda y la activación de la proteína quinasa B mitocondrial (también conocida como AKT1) en los túbulos renales. Presumimos que la señalización de AKT1 mitocondrial podría prevenir el desarrollo de lesión renal aguda y la posterior enfermedad renal crónica. Para probar esta predicción, utilizamos la estrategia Cre-Lox para generar dos nuevas cepas de ratones transgénicos específicos de túbulos renales que indujeron la expresión de AKT1 negativo dominante dirigido a mitocondrias o AKT1 constitutivamente activo. en ratones AKT1-negativos dominantes dirigidos a las mitocondrias, la inhibición de la AKT1 mitocondrial exacerbó la azotemia, la lesión tubular, la fibrosis renal, la glomeruloesclerosis y la supervivencia después de la lesión por isquemia-reperfusión negativamente. Por el contrario, en ratones AKT1 constitutivamente activos dirigidos a las mitocondrias, la señalización tubular mitocondrial mejorada de AKT1 atenuó la lesión renal, protegió la función renal y mejoró significativamente la supervivencia después de la lesión por isquemia-reperfusión (76,9 por ciento frente a 20,8 por ciento, respectivamente). Cuando se inhibió la AKT1 mitocondrial, se encontró un aumento en la respiración mitocondrial desacoplada y el estrés oxidativo en los túbulos renales, lo que respalda el papel de la disfunción mitocondrial en la fisiopatología de la insuficiencia renal. Por lo tanto, nuestro estudio sugiere que la vía de señalización AKT1 mitocondrial tubular puede ser un objetivo novedoso para el desarrollo de nuevas estrategias para prevenir y tratar mejor la lesión renal.
Declaración de traducción
La lesión renal aguda (IRA) y el posterior desarrollo de la enfermedad renal crónica (ERC) son problemas de salud importantes. Desarrollamos un modelo de ratón transgénico y determinamos el papel de la activación de AKT de las mitocondrias tubulares renales proximales en AKI y CKD. Este mecanismo de rescate de protección renal puede ser un objetivo novedoso para desarrollar nuevas estrategias para prevenir y tratar mejor la LRA y la ERC. Los estudios futuros deberían confirmar la participación de la vía de señalización AKT mitocondrial en la lesión renal humana y explorar los objetivos farmacológicos de la vía AKT1 mitocondrial.
Palabras clave
Akt1 mitocondrial; lesión por refusión de isquemia; Lesión renal aguda; Enfermedad Renal Crónica;Extracto de Cistanche.
Haga clic aquí para obtenerCistanche beneficios para los riñones
Introducción
La lesión renal aguda (IRA) y el posterior desarrollo de la enfermedad renal crónica (ERC) son problemas de salud importantes. Actualmente, los tratamientos médicos específicos para estos estados de enfermedad son limitados, en parte debido a la falta de comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la lesión renal. El riñón es uno de los órganos del cuerpo que más energía demanda, y las mitocondrias, que son necesarias para facilitar el transporte activo, mantener gradientes electroquímicos adecuados y regular la homeostasis de líquidos, son la principal fuente de producción de ATP celular a través de la fosforilación oxidativa. las alteraciones en la producción de ATP y la disfunción mitocondrial pueden conducir a un aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que a su vez afecta la función de las células renales e induce la muerte celular. Aunque se ha informado daño y disfunción mitocondrial en pacientes con enfermedad renal y modelos animales de lesión renal aguda y crónica, el conocimiento del papel fisiopatológico de las mitocondrias en la lesión renal sigue siendo incompleto.
La función mitocondrial mejorada puede prevenir la lesión por isquemia-reperfusión (IRI). Durante la fase isquémica de IRI, el agotamiento de oxígeno inhibe la transferencia de electrones en la cadena respiratoria mitocondrial y reduce la producción de ATP. La entrada subsiguiente de iones de sodio y la salida de protones ayudan a restaurar el pH normal y pueden promover la supervivencia celular al restaurar el volumen intracelular. gradientes electroquímicos transmembrana mitocondriales y activación de vías apoptóticas Estos cambios intracelulares pueden ser perjudiciales para las células que sobreviven después de la lesión isquémica inicial.
La LRA es más común en pacientes hospitalizados y puede acelerar la aparición de una nueva ERC, exacerbar la ERC existente y conducir a la muerte renal. Los mecanismos que subyacen a la transición de la LRA a la ERC no están claros. Estudios recientes en animales sugieren que la disfunción tubular renal juega un papel importante en la progresión de AKI a CKD, reflejando la transición de AKI a CKD en humanos. Entender las vías de señalización que regulan la lesión renal nos permitirá identificar nuevas dianas terapéuticas para mitigar la lesión renal y prevenir la progresión de LRA a ERC.
Se desconoce en gran medida el vínculo entre las vías de señalización citoplasmática y la función mitocondrial durante la lesión renal. La función mitocondrial está estrechamente relacionada con la señalización citoplasmática, otros orgánulos y vías nucleares. Nuestro laboratorio ha identificado la activación y translocación de AKT1 a las mitocondrias como un paso clave para proteger a los cardiomiocitos de la lesión por IRI al regular los complejos de fosforilación oxidativa, aumentando la eficiencia de la fosforilación oxidativa y reducción de ROS. Sin embargo, se desconoce si IRI puede desencadenar la translocación de AKT1 activado desde el citoplasma a las mitocondrias en los túbulos renales. Si la AKT1 mitocondrial puede activarse en los túbulos renales en respuesta a la lesión renal, sería importante evaluar el papel fisiopatológico de la AKT1 mitocondrial en el desarrollo de la lesión renal aguda (IRA) y la enfermedad renal crónica (ERC). Aquí, utilizamos dos modelos de ratones transgénicos específicos de túbulos renales inducibles que modulan la señalización de AKT1 mitocondrial in vivo y demostramos el papel protector de la activación de AKT1 mitocondrial tubular renal durante IRI contra AKI y el desarrollo posterior de CKD.
suplementos de cistanche
Resultados
Activación de AKT1 mitocondrial en túbulos renales en IRI
Primero investigamos si IRI activa AKT1 en las mitocondrias renales. Para ello establecimos un modelo de IRI renal mediante ligadura de la arteria renal izquierda durante 30 min seguida de nefrectomía contralateral (Nx). Se revirtió la ligadura de la arteria renal izquierda para finalizar la fase isquémica, se realizó reperfusión y se cosechó el riñón izquierdo en el intervalo de tiempo indicado.
Se aisló la corteza renal enriquecida en túbulos renales y se prepararon las mitocondrias por subfraccionamiento. Tras la reperfusión, aumentó la abundancia de pAKT1 y AKT1 mitocondriales, lo que sugiere la translocación de AKT1 activado en las mitocondrias (Figura 1A). Esto es similar a lo que observamos en el miocardio en comparación con los controles de operación simulada o los controles de riñón resecado, donde la AKT1 mitocondrial se elevó significativamente 30-60 minutos después de la reperfusión (Figura 1A y B) (n= 11-15). El pAKT1 mitocondrial también aumentó. Estos resultados sugieren que la activación y translocación de AKT1 inducida por IRI a las mitocondrias renales. La tinción iHC confirmó la fosforilación de AKT1 en los túbulos renales después de IRI (Figura 1C). La tinción de fondo para pAKT1 fue mínima en los túbulos renales de los controles con operación simulada, mientras que pAKT1 se elevó drásticamente en los túbulos renales después de la IRI (Figuras 1C y 1D). No se observó pAKT1 en ninguna región renal excepto en los túbulos. para confirmar la localización subcelular de pAKT1 en los túbulos, se tiñó pAKT1 en combinación con marcadores mitocondriales. Se observó una colocalización significativa de pAKT1 y mitocondrias en células tubulares renales en IRI (Figura 1E). Juntos, estos resultados sugieren la translocación de IRI y la activación de AKT1 a las mitocondrias.
Figura 1. Translocación aguda inducida por reperfusión de isquemia y activación de AKT1 en mitocondrias renales.
Generación de ratones transgénicos con expresión inducible específica del túbulo renal de una AKT negativa dominante en mitocondrias
Para probar la hipótesis de que la activación de AKT1 mitocondrial tubular renal durante IRI protege el riñón de AKI y el posterior desarrollo de CKD, generamos un modelo de ratón transgénico que permite la expresión inducida por tamoxifeno (TAM) de la orientación mitocondrial específica tubular de AKT1 negativo dominante. Se agregaron secuencias de direccionamiento mitocondrial y AKT1 negativo dominante (mdnAKT) al extremo N. La expresión condicional de tamoxifeno de los transgenes AKT1 fue mediada usando pCALNL (ver Materiales y Métodos). Para excluir los efectos de confusión asociados con la integración aleatoria de matrices transgénicas dentro del genoma, se introdujo una única copia del transgén mediante recombinación homóloga en células ES con transgenes específicos en el locus Gt(ROSA) 26or en un cromosoma. Se obtuvieron ratones de dos genes (KMDAKT) cruzando ratones mdnAKT inducidos por tam con ratones hemicigotos KSP-CreERT2, donde la actividad Cre inducida por tam fue impulsada por los promotores de calmodulina 16 específicos de células tubulares renales. la inyección de tam indujo la actividad de Cre, las mitocondrias aisladas y las proteínas mitocondriales separadas por SDS-PAGE para la inmunotransferencia. Los resultados mostraron que TAM indujo con éxito la expresión de AKT1 mutante. La proteína mutante fue indetectable en ratones KMDAKT, ratones KSPCreERT2 y ratones de tipo salvaje (inyección de aceite de maíz).
Para verificar la expresión específica de riñón, se extrajeron proteínas mitocondriales de diferentes tejidos después de la inyección de TAM. El mutante AKT1 etiquetado con his se expresó solo en el riñón. Las secciones de riñón se tiñeron con anticuerpos anti-his-tag y Mitotracker mitocondrial para obtener imágenes de inmunofluorescencia. Los resultados mostraron que todos los mutantes AKT1 se tiñeron con anticuerpo de etiqueta His y se localizaron en las mitocondrias. No se detectaron mutaciones de AKT1 en los glomérulos. La actividad enzimática de AKT1 mitocondrial se analizó utilizando GSK3 recombinante para confirmar un papel negativo importante en las mitocondrias de los túbulos KMDAKT tratados con tam. Dado que el AKT1 mitocondrial del túbulo renal es activado por IRI, comparamos la actividad enzimática de AKT1 en mitocondrias aisladas de ratones tratados con tam y ratones tratados con aceite de maíz después de IRI. Los resultados mostraron que la actividad de AKT1 mitocondrial renal se inhibió significativamente en los ratones KMDAKT tratados con TAM. Por lo tanto, esta línea de ratones transgénicos es un buen modelo para estudiar el papel de AKT1 en las mitocondrias tubulares.
Beneficios de la cistanche
Inhibición del túbulo renal mitocondrial AKT agravado IRI in vivo
La IRI se indujo en la isquemia renal unilateral. En la última serie de experimentos, la AKT1 fosforilada era apenas detectable en las mitocondrias de los túbulos renales proximales. No se observaron diferencias significativas en la histología renal, nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina sérica (Cr) en ratones KMDAKT inyectados con aceite de maíz y tam, lo que sugiere que la señalización de AKT1 mitocondrial no tiene un papel significativo en la estructura y función renal al inicio antes de la inducción de IRI. Para investigar si el AKT1 mitocondrial desempeña un papel protector durante la IRI, se utilizó IRI unilateral para inducir AKI en ratones con aceite de maíz o ratones TAM-KMDAKT. no hubo diferencias en los niveles de BUN o Cr obtenidos inmediatamente después de la inducción de IRI, pero en los ratones TAM-KMDAKT, tanto los niveles de BUN como de Cr se elevaron significativamente después de 45 días. Estos resultados sugieren que la activación bloqueada de AKT1 mitocondrial en los túbulos renales durante la IRI exacerbó el desarrollo tardío de disfunción renal. El análisis histológico de secciones renales teñidas con H&E mostró que la lesión renal se exacerbó en ratones TAM-KMDAKT. La puntuación de lesión tubular renal de Jablonski fue más alta con pérdida del borde en cepillo tubular, lisis tubular y más residuos en la luz tubular (p=0.018). Para excluir el efecto de la recombinasa TAM o Cre, también analizamos ratones KSP/CreERT2 inyectados con TAM, y las puntuaciones de Jablonski fueron similares en ratones KMdakt con aceite de maíz y TAM-KSP/CreERT2 en el día 7 después de la IRI (Figura 3D) (p{{ 19}}.7613). Estos datos sugieren que nuestros hallazgos no fueron confundidos por los efectos de la recombinasa TAM o Cre. En ratones TAM-KMDAKT después de IRI, la tinción con tricrómico de Masson mostró un área fibrótica más alta (porcentaje) (p<0,001), acompañada de estructuras tubulares desordenadas con cilindros y restos intraluminales. la expresión de col1a aumentó, de acuerdo con la tinción tricrómica de Masson. La expresión de tGF no aumentó, lo que sugiere que la AKT1 mitocondrial no reguló la respuesta inflamatoria. Después de IRI, la expresión del marcador de lesión tubular-KIM -1 aumentó en el grupo TAM-KMDAKT, lo que confirma el aumento de la lesión renal en el grupo TAM-KMDAKT (p=0.002).
Se usó la tinción TUNEL para evaluar la apoptosis de las células renales. El número de células apoptóticas aumentó significativamente en los túbulos (p{{0}}.0054) y glomérulos (p<0,001) de los ratones TAM-KMDAKT en comparación con el grupo de control. Se sugiere que la inhibición de AKT1 mitocondrial tubular durante IRI exacerba la muerte de células tubulares y la lesión glomerular. De acuerdo con esto, la activación tanto de la caspasa 9 (promotor) como de la caspasa 3 (ejecutor) aumentó significativamente en las células epiteliales tubulares renales TAM-KMDAKT. Para explorar más a fondo los cambios glomerulares crónicos, se realizó un análisis de tinción con ácido periódico de Schiff (PAS) en secciones de riñón para cuantificar la glomeruloesclerosis. Aunque no se observaron diferencias en la glomeruloesclerosis a los 7 días posteriores a la IRI (p=00,2634), se encontró más glomeruloesclerosis en ratones TAM-KMDAKT a los 45 días posteriores a la IRI (p<0,001). Este hallazgo sugiere que la vía de señalización de AKT mitocondrial tubular renal puede regular la formación de cicatrices glomerulares durante el desarrollo de la ERC. El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier mostró el efecto de la inhibición de la AKT mitocondrial tubular en el resultado de IRI. La supervivencia se redujo después de IRI en ratones TAM-KMDAKT en comparación con los controles (p=0.0013).
La tasa de supervivencia de los ratones TAM-KMDAKT fue significativamente menor que la de los controles dentro de los 7 días posteriores a la IRI, pero los niveles de BUN/Cr de los ratones TAM- y aceite de maíz-KMDAKT fueron similares durante este período. Los cambios de BUN/Cr notificados en ratones tratados con TAM pueden haberse subestimado debido a la falta de disponibilidad de datos de BUN/Cr de ratones muertos. Además, la mayor mortalidad en ratones TAM-KMDAKT puede deberse a una disfunción de órganos distales (pulmón, corazón, cerebro) en lugar de solo cambios en BUN/Cr.
El papel de AKT1 mitocondrial tubular también se evaluó en ratones KMDAKT hembra. El BUN/Cr sérico y la histología renal fueron relativamente más altos en los ratones hembra TAM-KMDAKT 45 días después de la IRI. No se observó ningún efecto sexual significativo.
Cistanche a base de hierbas
REFERENCIAS
1. Yang JY, Deng W, Chen Y, et al. La translocación alterada y la activación de Akt1 mitocondrial mitigaron la actividad del Complejo V de fosforilación oxidativa mitocondrial en el miocardio diabético. J Mol Cell Cardiol. 2013;59:167–175.
2. Wang Z, Ying Z, Bosy-Westphal A, et al. Tasas metabólicas específicas de los principales órganos y tejidos a lo largo de la edad adulta: evaluación mediante el modelo mecanicista del gasto energético en reposo. Soy J Clin Nutr. 2010;92(6):1369–77.
3. Li SY, Susztak K. El papel del coactivador gamma del receptor activado por el proliferador de peroxisomas 1alfa (PGC-1alfa) en la enfermedad renal. Semin Nephrol. 2018;38(2):121–6.
4. Portilla D, Dai G, McClure T, et al. Alteraciones de PPARalfa y su coactivador PGC-1 en insuficiencia renal aguda inducida por cisplatino. Riñón Int. 2002;62(4):1208–18.
5. ForbesJM. ¿Jugadores de poder de las mitocondrias en la función renal? Tendencias Endocrinol Metab. 2016;27(7):441–4425.
6. Szeto HH, Liu S, Soong Y, et al. La mejora de la bioenergética mitocondrial en condiciones isquémicas aumenta la tolerancia a la isquemia caliente en el riñón. Soy J Physiol Physiol renal. 2015;308(1):F11–F21.6.
7. Kalogeris T, Baines CP, Krenz M, et al. Biología celular de la lesión por isquemia/reperfusión. Int Rev Cell Mol Biol. 2012;298:229–317.
8. Gracia-Sancho J, Casillas-Ramirez A, Peralta C. Vías moleculares en la protección del hígado contra la lesión por isquemia/reperfusión: una actualización de 2015. Clin Sci (Londres). 2015;129(4):345–62.
9. Ver EJ, Jayasinghe K, Glassford N, et al. Riesgo a largo plazo de resultados adversos después de una lesión renal aguda: una revisión sistemática y un metanálisis de estudios de cohortes que utilizan definiciones de exposición consensuadas. Riñón Int. 2019;95(1):160–72.
10. Szeto HH, Liu S, Soong Y, et al. La protección de las mitocondrias después de la isquemia aguda previene la regulación positiva prolongada de IL-1beta e IL-18 y detiene la ERC. J Am Soc Nephrol. 2017;28(5):1437–49.
11. Tran MT, Zsengeller ZK, Berg AH, et al. PGC1alpha impulsa la biosíntesis de NAD que vincula el metabolismo oxidativo con la protección renal. Naturaleza. 2016;531(7595):528–32.
12. Tait SW, Green DR. Mitocondrias y señalización celular. Ciencia celular J. 2012; 125 (parte 4): 807–815.
13. Deng W, Leu HB, Chen Y, et al. La proteína quinasa B (PKB/AKT1) formó complejos de señalización con proteínas mitocondriales y previno la disfunción de la energía glucolítica en cardiomiocitos cultivados durante la lesión por isquemia-reperfusión. Endocrinología. 2014;155(5):1618–28.
14. Kanegae Y, Lee G, Sato Y, et al. Activación génica eficiente en células de mamífero mediante el uso de adenovirus recombinantes que expresan la recombinasa Cre específica del sitio. Ácidos Nucleicos Res. 1995;23(19):3816–21.
15. Matsuda T, Cepko CL. Expresión controlada de transgenes introducidos por electroporación in vivo. Proc Natl Acad Sci US A. 2007 1 16;104(3):1027–32.
16. Lee SA, Cozzi M, Bush EL, et al. Disfunción de órganos distantes en la lesión renal aguda: una revisión. Am J enfermedad renal. 2018;72(6):846–856.
Hugo YH Lin1,2,3,4, Delicioso Chen1, Yu Han Chen1, Albert P. Ta1,2, Hsiao Chen Lee1,5, Subvención R. MacGregor6, Nosratola D.Vaziri1,2, Ping H Wang1,2,7
1. Centro de Diabetes de UC Irvine y Departamento de Medicina, Universidad de California, Irvine, California
2. Departamento de Fisiología y Biofísica, Universidad de California, Irvine, California
3. Departamento de Medicina, Universidad Médica de Kaohsiung, Kaohsiung, Taiwán
4. Departamento de Medicina Interna, Hospital Municipal Ta-Tung de Kaohsiung, Taiwán
5. Departamento de Cirugía Plástica, Universidad Médica de Kaohsiung, Kaohsiung, Taiwán
6. Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Universidad de California, Irvine, California
7. Departamento de Diabetes, Endocrinología y Metabolismo, Centro Médico Nacional City of Hope, Duarte, California
