PARTE 1 Una fracción de Cistanches Herba/𝛽-sitosterol provoca una inducción sensible a redox del desacoplamiento mitocondrial y la activación de la proteína quinasa dependiente del monofosfato de adenosina/receptor activado por proliferador de peroxisoma 𝛾 coactivador-1 en miotubos C2C12: un posible mecanismo subyacente al peso Efecto de reducción

Hoi Shan Wong, Jihang Chen, Pou Kuan Leong, Hoi Yan Leung, Wing Man Chan y Kam Ming Ko

División de Ciencias de la Vida, Universidad de Ciencia y Tecnología de Hong Kong, Kowloon, Hong Kong

Correspondence should be addressed to Kam Ming Ko; bcrko@ust.hk

Recibido el 29 de agosto de 2014; Aceptado el 14 de enero de 2015 Editor académico: Man Li Copyright © 2015

Hoi Shan Wong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso, la distribución y la reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se cite correctamente el trabajo original. Estudios previos han demostrado que HCF1, una fracción semipurificada deCistanches Herba, causa reducción de peso en ratones alimentados con una dieta normal y con una dieta alta en grasas. La reducción de peso se asoció con la inducción del desacoplamiento mitocondrial y cambios en las actividades de las enzimas metabólicas en el músculo esquelético de ratón. Para investigar más a fondo el mecanismo bioquímico subyacente a la reducción de peso inducida por HCF1-, se examinó el efecto de HCF1 y su componente activo, 𝛽-sitosterol (BSS), en los miotubos C2C12. La incubación con HCF1/BSS provocó un aumento transitorio del potencial de membrana mitocondrial (MMP), posiblemente al fluidificar la membrana interna mitocondrial. El aumento de MMP fue paralelo a un aumento en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) mitocondriales. Las ROS mitocondriales, a su vez, desencadenaron una inducción sensible a redox del desacoplamiento mitocondrial mediante el desacoplamiento de la proteína 3 (UCP3). El análisis bioquímico indicó que HCF1 era capaz de activar una proteína quinasa dependiente de adenosina monofosfato/coactivador del receptor activado por proliferador de peroxisomas 𝛾-1 y, por lo tanto, aumentó la expresión de citocromo c oxidasa y UCP3. Los estudios en animales que utilizaron el acoplador mitocondrial también confirmaron el papel del desacoplamiento mitocondrial en la reducción de peso inducida por HCF1-. En conclusión, un HCF1/BSS provoca la inducción sensible a redox del desacoplamiento mitocondrial y la activación de AMPK/PGC-1 en los miotubos C2C12, con reducciones resultantes en el peso corporal y la adiposidad por un mayor consumo de energía.

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1. Introducción

La obesidad, que se define como una acumulación anormal de grasa corporal, se ha convertido en una amenaza para la salud pública. Independientemente de las condiciones metabólicamente sanas o metabólicamente deterioradas, se ha encontrado que la obesidad está asociada con un mayor riesgo de comorbilidades y mortalidad [1]. La obesidad central, las anomalías en los perfiles de colesterol y las elevaciones en los niveles de triglicéridos en plasma, todas las cuales son características comunes de las personas obesas, contribuyen a la alta incidencia de diabetes tipo 2, enfermedades cardiovasculares, muerte no cardiovascular y cánceres relacionados con la obesidad en las personas obesas. 2]. Por lo tanto, la reducción del peso corporal y la adiposidad se ha considerado clave para la prevención de las consecuencias para la salud relacionadas con la obesidad. El manejo de la obesidad enfatiza principalmente el establecimiento de un balance energético óptimo aumentando el gasto de energía y/o reduciendo la ingesta de energía. Las modificaciones del estilo de vida, incluido un aumento de la actividad física y el desarrollo de patrones de alimentación saludables, generalmente se consideran enfoques seguros para inducir la pérdida de peso. Sin embargo, en general se ha encontrado que tales enfoques son ineficientes. Medicina alternativa para aumentar el gasto de energía o reducir la ingesta de energía [3]. Por lo tanto, actualmente se están investigando activamente estrategias basadas en el uso de agentes farmacológicos. En este sentido, nuestro hallazgo anterior ha demostrado que HCF1, una fracción semipurificada deCistanchesHerba(una planta entera seca deCistanche deserticaYC Ma, caracterizada como una hierba tónica "vigorizante de Yang" en la medicina tradicional china, demostró ser eficaz en la prevención de la obesidad inducida por la dieta y sus anomalías metabólicas asociadas [4]. La administración oral de HCF1 produjo una reducción de peso en ratones alimentados con dieta normal (ND-) y dieta alta en grasas (HFD-), posiblemente por la inducción del desacoplamiento mitocondrial en el músculo esquelético, con un aumento resultante en el gasto de energía [4 ]. Sin embargo, el mecanismo subyacente a tal desacoplamiento mitocondrial inducido por HCF1-(y, por lo tanto, a la reducción de peso) sigue sin estar claro. El desacoplamiento mitocondrial disipa los gradientes de protones mediante la introducción de una vía alternativa de conductancia de protones a través de la membrana mitocondrial interna (IMM), con una disminución resultante en el potencial de la membrana mitocondrial y la generación de ATP mitocondrial. Este ciclo fútil de transporte de protones consume una alta proporción de energía metabólica en varios tejidos y es responsable de una parte importante del gasto energético diario, con el consiguiente aumento en el uso de moléculas de combustible (como los ácidos grasos), lo que provoca pérdida de peso y reducción de la adiposidad [5, 6]. Para confirmar el efecto de desacoplamiento mitocondrial producido por HCF1, se examinaron los efectos de HCF1 sobre la expresión de MMP y UCP3 en miotubos C2C12, que son células musculares diferenciadas derivadas del músculo del muslo de ratones C3H. Nuestro objetivo era investigar el mecanismo bioquímico subyacente a la reducción de peso proporcionada por HCF1. También se estudió el 𝛽-sitosterol (BSS), un componente activo de HCF1, para comparar. La posible implicación del desacoplamiento mitocondrial en la reducción de peso inducida por HCF1-en ratones obesos alimentados con HFD se investigó más a fondo mediante la coadministración de HCF1 con un acoplador químico, 6-cetocolestanol (kCh). La proteína quinasa dependiente de monofosfato de adenosina (AMPK), una serina/treonina-proteína quinasa expresada de manera ubicua, constituye un centro importante para el control del metabolismo energético celular. Tras la activación, AMPK integra señales intra/extracelulares y provoca respuestas celulares a través de la intermediación de varias cascadas de señalización celular [7, 8]. AMPK es capaz de modular el metabolismo celular mediante la regulación de las actividades de las enzimas metabólicas a través de la fosforilación directa. La AMPK también produce efectos a largo plazo a nivel transcripcional a través de su fosforilación del receptor activado por proliferador de peroxisomas 𝛾coactivador-1 (PGC-1), que conduce a cambios adaptativos en la expresión génica relacionados con el metabolismo energético y la función mitocondrial [9, 10]. En este sentido, también examinamos el efecto de HCF1/BSS en la vía de señalización AMPK/PGC-1 en miotubos C2C12.

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2. Materiales y métodos

2.1. Extracción de hierbas.

Cistanches Herba, la planta entera seca deCistanche deserticaYC Ma (Orobanchaceae), se compró a un comerciante de hierbas local (Lee Hoong Kee). La hierba fue autenticada por el proveedor y se depositó un espécimen de comprobante (HKUST00301) en la División de Ciencias de la Vida, la Universidad de Ciencia y Tecnología de Hong Kong (HKUST). ACistanchesEl extracto de Herba se obtuvo por extracción con etanol de material herbario molido calentando a reflujo a 78∘ C durante 2 h, como se describió anteriormente [11], con un rendimiento del 14 por ciento (p/p). El extracto se fraccionó aún más mediante cromatografía en gel de sílice [12]. Se obtuvo HCF1 con un rendimiento del 1,14 por ciento (p/p). El extracto se secó evaporando el solvente a presión reducida a 50∘ C, y el extracto seco se almacenó a -20∘ C antes de su uso.

2.2. quimicos

El anticuerpo anti-𝛽-actina, BSS (CAS 83-46- 5), el cóctel de inhibidores de proteasa y el cóctel de inhibidores de fosfatasa 3 se adquirieron de Sigma (St Louis, MO). Anticuerpo anti-AMPK𝛼1/2, anticuerpo anti-p-AMPK𝛼1/2, anticuerpo anti-PGC-1 (H-300), anticuerpo anti-UCP3 (E-18), {{16} }[4- (2-piperidina-1-il-etoxi)-fenil)]-3-piridin-4-il-pirrazolo[1,5-a ]-pirimidina (CC) y 6-cetocolestanol (kCh) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE. UU.). El anticuerpo anti-COX se adquirió de Cell Signaling (Danvers, MA). Se adquirió un anticuerpo anti-lamin B1 de Abcam (Cambridge, MA). El reactivo de ensayo Bio-Rad se adquirió de Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA, EE. UU.). Todos los demás productos químicos se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.).

2.3. Cultivo de células.

C2C12, un cultivo de mioblastos derivado del músculo esquelético de ratón C3H [13] de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), fue proporcionado amablemente por el profesor Zhenguo Wu (División de Ciencias de la Vida, HKUST). La línea celular se cultivó en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco BRL Life Technologies, Grand Island, NY), suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 por ciento (v/v), 100 UI/mL de penicilina y 100 μg /ml de estreptomicina y NaHCO3 17 mM. La diferenciación de mioblastos C2C12 a miotubos C2C12 se indujo sustituyendo un medio de cultivo completo con un medio de diferenciación que contenía suero de caballo (HS) al 2 por ciento (v/v) en lugar de FBS al 10 por ciento (v/v). Las células se cultivaron en una atmósfera de 5 por ciento (v/v) de CO2 en aire a 37 C.

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2.4. Análisis bioquímicos en miotubos C2C12

2.4.1. MMP.

El potencial de la membrana mitocondrial se midió usando un colorante catiónico fluorescente, yoduro de 5,5,6,6 -tetracloro- 1,1,3,3 -tetraetilbencimidazolil-carbocianina (JC- 1) [14]. Las células se cultivaron a una densidad de 1.0 × 104 células en placas de microtitulación de 96-pocillos. Después de una unión estable, las células se preteñeron con 20 𝜇M JC-1 (disuelto en medio de cultivo) a 37∘ C durante 10 min. Después de la pretinción, las células se lavaron dos veces con solución salina equilibrada de Hank (HBSS), complementada con albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1 por ciento. La medición de MMP se inició mediante la adición de un medio que contenía HCF1/BSS. La cantidad de agregado J de moléculas JC-1, que se forma en la membrana interna de las mitocondrias de alto potencial de membrana, se determinó mediante el control de la fluorescencia roja JC-1 (Ex 485 nm/Em 580 nm) Evidencia -Base de Medicina Complementaria y Alternativa 3 a 37∘ C durante 1 h. La MMP se estimó restando las intensidades de fluorescencia de las muestras en blanco (es decir, que contenían medio únicamente) de las intensidades de fluorescencia de las muestras analizadas. Los valores de MMP de células incubadas con HCF1/BSS se normalizaron con los respectivos valores de control incubados sin HCF1/BSS y se expresaron como porcentaje de control.

2.4.2. Activación de la proteína quinasa dependiente de monofosfato de adenosina (AMPK).

Se sembraron miotubos C2C12 (1,5 × 105 células) en placas de microtitulación de 6-pocillos. Después de la unión estable, las células se preincubaron con medio que contenía HCF1/BSS durante 8 h. Luego, las células preincubadas se lisaron con 300 𝜇L de tampón de lisis de dodecilsulfato de sodio (SDS-) (Tris-Cl 20 mM, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 2 mM, ácido tetraacético de etilenglicol (EGTA) 3 mM), 1 por ciento (p/ v) Triton X- 100, glicerol al 10 por ciento (p/v), SDS al 5 por ciento, ditiotreitol (DTT) 1 mM, cóctel inhibidor de proteasa y cóctel inhibidor de fosfatasa 3, pH 7,5). El lisado se centrifugó adicionalmente a 12000 ×ga 4∘ C durante 10 min para eliminar los restos celulares. El alcance de la activación de AMPK se evaluó a partir de la proporción relativa de fósforo-AMPK𝛼 (p-AMPK) y AMPK𝛼 mediante análisis de transferencia Western utilizando anticuerpos anti-p-AMPK𝛼1/2 y anticuerpos anti-AMPK𝛼1/2 después del análisis SDS-PAGE, con un gel separador de acrilamida al 10 por ciento (v/v). Se cargó lisado celular (20 μg) y se usó β-actina como marcador de referencia. Las bandas de proteína inmunoteñidas se analizaron mediante densitometría (Quantiscan, Biosoft) y las cantidades (unidades arbitrarias) de p-AMPK𝛼 y AMPK𝛼 se normalizaron con referencia al nivel de 𝛽-actina (unidades arbitrarias) en la muestra.

2.4.3. PGC-1 Translocación nuclear.

Los miotubos C2C12 se cultivaron a una densidad de 2,0x106 células en placas de cultivo de 100 mm. Después de 8 h de preincubación con HCF1/BSS, las células se tripsinizaron y se incubaron con 1 ml de tampón hipotónico helado (HEPES 10 mM, KCl 1,5 mM y MgCl2 1,5 mM, pH 7,9) a 4 °C durante 10 min. Después de la incubación, las células se recogieron por centrifugación a 500 ×ga 4∘ C durante 10 min. Las células recolectadas se resuspendieron en 300 𝜇L de tampón hipotónico, complementado con 0,5 mM de DTT, 0,1 por ciento (p/v) de nonilfenoxi-polietoxiletanol (NP-40) y cóctel de inhibidores de proteasa, para facilitar la extracción de proteínas citosólicas solubles. . El lisado resultante se centrifugó a 12000 ×ga 4∘ C durante 1 min para producir fracciones citosólicas (sobrenadante) y nucleares (pellet). El aislamiento de las proteínas nucleares se logró incubando el precipitado con 25 𝜇L de tampón hipertónico helado (HEPES 20 mM, glicerol al 25 % (p/v), NaCl 400 mM, MgCl2 1,5 mM, EDTA 0,2 mM, DTT 0,5 mM y cóctel inhibidor de proteasa, pH 7,9) a 4∘ C durante 30 min seguido de centrifugación a 12000 ×ga 4∘ C durante 5 min. La extensión de la translocación nuclear de PGC-1 se estimó a partir de la proporción relativa del nivel de PGC-1 en fracciones citosólicas y nucleares usando análisis de transferencia Western siguiendo el análisis SDS-PAGE, como se describe anteriormente. Se cargaron las fracciones citosólica y nuclear (20 𝜇g), usándose 𝛽-actina y lamina B1 como marcadores de referencia citosólica y nuclear, respectivamente. Las cantidades (unidades arbitrarias) de PGC-1 se normalizaron con referencia a los niveles de 𝛽-actina y lamina B1, respectivamente, (unidades arbitrarias) en la muestra.

2.4.4. Expresión de la proteína 3 de desacoplamiento mitocondrial (UCP3) y la citocromo c oxidasa (COX).

Se sembraron miotubos C2C12 (2.0 × 106 células) en placas de cultivo de 100 mm. Después de la unión estable, las células se preincubaron con medio que contenía HCF1/BSS a 37 °C durante 48 h. Después de eliminar el medio que contenía HCF1/BSS, las células se tripsinizaron y lisaron mediante la adición de 300 ml de tampón de lisis SDS. El lisado celular se centrifugó a 12000 ×ga 4∘ C durante 10 min para eliminar los restos celulares. Los niveles de UCP3 y COX en el sobrenadante se determinaron mediante análisis de transferencia Western usando anticuerpo anti-UCP3 (E- 18) y anticuerpo anti-COX siguiendo el análisis SDS-PAGE como se describe anteriormente. Se cargó lisado celular (50 𝜇g) y se usó 𝛽-actina como marcador de referencia. Las cantidades (unidades arbitrarias) de UCP3 y COX se normalizaron con referencia al nivel de 𝛽-actina (unidades arbitrarias) en la muestra.

2.5. Cuidado animal.

Ratones ICR (8 semanas; 30 a 35 g para machos y 25 a 30 g para hembras) se mantuvieron bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h en un ambiente de aire/humedad controlado a aproximadamente 22∘ C y se les permitió comida y agua ad libitum en las Instalaciones de Cuidado de Animales y Plantas (APCF) en la Universidad de Ciencia y Tecnología de Hong Kong (HKUST). Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Prácticas de Investigación (HKUST) (número de aprobación del protocolo animal 2013049; fecha de aprobación: 25 de septiembre de 2013; duración del experimento: 3 años).

2.6. Protocolo de tratamiento.

Para examinar el efecto del 6-cetocolestanol (kCh) sobre la reducción de peso inducida por HCF1-en ratones alimentados con HFD, los animales se asignaron al azar a 6 grupos, con 10–15 ratones en cada uno: (1 ) control de dieta normal (ND, 13 por ciento de energía derivada de grasa, adquirida de LabDiet, número de producto 5010); (2) ND más kCh (a una dosis diaria de 9 mg/kg); (3) control HFD (60 por ciento de energía derivada de la grasa; adquirido de Research Diet Inc., número de producto D12492); (4) HFD más HCF1 (a una dosis diaria de 45 mg/kg); (5) HFD más kCh; y (6) HFD más HCF1 más kCh. Se demostró que HCF1, en una dosis diaria de 45 mg/kg, produce una reducción de peso significativa en ratones macho [4], mientras que se descubrió que kCh, en una dosis diaria de 9 mg/kg, anulaba el HCF1- efecto de desacoplamiento inducido en mitocondrias aisladas de músculo esquelético de ratón (datos no mostrados). A los animales se les administró kCh, HCF1 o HCF1/kCh por vía intragástrica, 5 días a la semana, durante 8 semanas (es decir, para un total de 40 dosis). Los ratones de control recibieron únicamente el vehículo (aceite de oliva). Los pesos corporales y el consumo de alimentos de los ratones se controlaron semanalmente durante el transcurso del experimento. Los cambios en el peso corporal se cuantificaron calculando el área bajo la curva (AUC) de un gráfico que trazaba el porcentaje de peso corporal inicial frente al tiempo (semana 1 a 8) y se expresó en unidades arbitrarias. Los ratones se sacrificaron por dislocación cervical 24 h después de la última dosis (con kCh, HCF1 o HCF1/kCh) después de una noche de ayuno. Se extirparon muestras de músculo gastrocnemio para medir la respiración mitocondrial. Las almohadillas de grasa (grasa gonadal, retroperitoneal y mesentérica) se diseccionaron y pesaron. Se estimó la relación entre el peso de una almohadilla de grasa particular y el peso corporal y se expresó como "índice de almohadilla de grasa".

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2.7. Análisis bioquímicos en ratones

2.7.1. Preparaciones de muestras.

Los tejidos del músculo gastrocnemio picados se mezclaron con 10 ml de solución de colagenasa (00,075 por ciento (p/v)) en tampón (KCl 100 mM, MOPS 50 mM, pH 7,2), y las mezclas se incubado a 4∘ C durante 20 min. Las mezclas de tejidos digeridos se centrifugaron a 600 ×ga 4∘ C durante 20 min. Se eliminó el sobrenadante; los tejidos digeridos se mezclaron con 20 ml de tampón de homogeneización enfriado con hielo (sacarosa 50 mM, manitol 200 mM, KH2PO4 5 mM, EGTA 1 mM y MOPS 5 mM, pH 7,2) y se homogeneizaron en hielo con un homogeneizador de vidrio de teflón. a 4000 rpm durante 25 a 30 carreras completas. Luego, los homogeneizados se centrifugaron a 600 ×ga 4∘ C durante 10 min, lo que produjo una fracción sin núcleo (sobrenadante). Los sedimentos mitocondriales se prepararon a partir de homogeneizados musculares mediante centrifugación a 9200 ×ga 4∘ C durante 30 min. Las fracciones mitocondriales se obtuvieron suspendiendo los gránulos en un tampón que contenía KCl 125 mM, Tris-Base 10 mM, KH2PO4 2 mM, EGTA 0,5 mM y MOPS 20 mM, pH 7,5 [15].

2.7.2. Respiración mitocondrial.

Las tasas de respiración en las mitocondrias aisladas del músculo esquelético de ratón se determinaron como se describe por Wong y Ko [12]. En resumen, la respiración mitocondrial se midió polarográficamente utilizando un electrodo tipo Clark (Hansatech Instruments, Norfolk) a 30 C. Las fracciones mitocondriales (1 mg de proteína/mL) se incubaron en el tampón de respiración (3{{17} } KCl mM, MgCl2 6 mM, sacarosa 75 mM, EDTA 1 mM y KH2PO4 20 mM, pH 7,0). Se añadió solución de sustrato que contenía piruvato de sodio 15 mM y malato de sodio 5 mM. Después del equilibrio, se inició la respiración del estado 3 mediante la adición de ADP (concentración final 0,6 mM). Cuando todo el ADP añadido se agotó para la generación de ATP, se añadió oligomicina para inducir la respiración del estado 4. La relación de control respiratorio (RCR) se estimó calculando la relación entre las tasas de respiración del estado 3 y el estado 4 [16].

2.7.3. Expresión mitocondrial de UCP3 en músculo esquelético de ratón.

Los niveles mitocondriales de UCP3 se estimaron mediante análisis de transferencia Western utilizando anticuerpos anti-UCP3 (E-18) siguiendo el análisis SDS PAGE de la fracción mitocondrial, utilizando un gel de separación de acrilamida al 10 por ciento. Se aplicaron fracciones mitocondriales aisladas de músculo esquelético de ratón (∼60 𝜇g) al gel y se usó citocromo c oxidasa (COX) como marcador de referencia. Las bandas de proteína inmunoteñidas se analizaron por densitometría y las cantidades (unidades arbitrarias) de UCP3 se normalizaron con referencia al nivel de COX (unidades arbitrarias) en la muestra.

2.8. Ensayo de proteínas.

Las concentraciones de proteínas se determinaron usando un kit de ensayo de proteínas Bio-Rad. Una alícuota (10 𝜇L) de muestra de lisado celular/mitocondrial se diluyó con 40 𝜇L de agua. Luego se añadió una alícuota (10 𝜇L) de muestra diluida a un pocillo de una placa de microtitulación de 96-pocillos, seguido de la adición de 200 𝜇L de reactivo de ensayo Bio-Rad diluido (5-veces de dilución). La mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego se midió la absorbancia de la mezcla de reacción a 570 nm. La concentración de proteína se determinó a partir de una curva de calibración usando albúmina de suero bovino (BSA) como estándar.

2.9. Análisis estadístico.

Todos los datos se expresaron como media ± error estándar de la media (SEM), a menos que se especifique lo contrario. Los datos se analizaron mediante análisis de varianza de una vía (ANOVA de una vía), a menos que se especifique lo contrario, y las diferencias entre grupos se detectaron mediante la prueba de rango de Tukey, con 𝑃<>

Cistanchedeserticola tienemuchos efectos

3. Resultados

3.1. Efectos de HCF1/BSS sobre MMP en miotubos C2C12.

La incubación del desacoplador químico, cianuro de carbonilo {{0}} (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP), a una concentración de 1 𝜇M, provocó una reducción dependiente del tiempo en MMP, con un grado de reducción del 29 por ciento en el final de la medición (Figuras 1 y 2). Por el contrario, HCF1 y BSS, en concentraciones de 30 ng/mL y 10 𝜇M, aumentaron la MMP en un 5 y un 4 %, respectivamente, en los primeros 10 min de incubación de HCF1/BSS (Figuras 1 y 2) . Los aumentos iniciales inducidos por HCF1/BSS fueron seguidos por disminuciones graduales en MMP al 95 y 93 por ciento, respectivamente, del valor inicial respectivo al final de la medición (60 min de incubación con HCF1/BSS) (Figuras 1 y 2). Los cambios inducidos por HCF1/BSS en MMP se caracterizaron por el uso de inhibidores específicos. La rotenona (0,1 nM), un inhibidor del complejo mitocondrial I, y el colesterol (0,3 𝜇M), un potenciador de la rigidez de la membrana, suprimieron los cambios inducidos por HCF1/BSS en MMP a lo largo de la medición (Figuras 1 y 2). Por otro lado, la coincubación con un inhibidor específico de las UCP, GDP, un acoplador químico, 6-cetocolestanol (kCh), o un antioxidante, dimetiltiourea (DMTU), disminuyó la reducción inducida por HCF1-en MMP en el momento posterior de la incubación de HCF1 (Figura 1). GDP, kCh y DMTU también disminuyeron la reducción de MMP inducida por BSS en el momento posterior de la incubación de BSS, con un valor de MMP del 110 por ciento, en comparación con el control de tiempo correspondiente (Figura 2)

3.2. Efecto de HCF1/BSS sobre la activación de AMPK en miotubos C2C12.

El efecto de HCF1 en AMPK se examinó midiendo la proporción de AMPK𝛼 fosforilada (p-AMPK𝛼) a AMPK𝛼 total (AMPK𝛼), lo que indica el grado de activación de AMPK. La incubación con HCF1, a concentraciones de 30 y 100 ng/mL, produjo aumentos dependientes del tiempo en la activación de AMPK, con un alcance de estos aumentos de 32 y 43 por ciento a las 8 h de incubación de HCF1, respectivamente, en comparación con el tiempo respectivo. control emparejado (Figura 3). Paralelamente a HCF1, la preincubación con BSS (10 𝜇M) aumentó significativamente el grado de activación de AMPK en un 25 por ciento, en comparación con el control no preincubado (Figura 5). La activación de AMPK inducida por HCF1/BSS en miotubos C2C12 se anuló por completo mediante la coincubación con kCh (un desacoplador) o DMTU (Figuras 4 y 5, Tablas 1 y 2 del material complementario disponible en línea

3.3. Efecto de HCF1/BSS sobre la translocación nuclear PGC-1 en miotubos C2C12.

La activación de PGC-1 puede medirse indirectamente por la extensión de la translocación nuclear de PGC-1. La preincubación con HCF1 y BSS aumentó significativamente la translocación nuclear de PGC-1 en un 25 y un 28 por ciento, respectivamente, como lo demuestran las proporciones elevadas de PGC-1 en el núcleo al citoplasma (Figuras 6 y 7). Un inhibidor específico de AMPK, 6-[4-(2-piperidina-1-il-etoxi)-fenil)]-3-piridina-4-ilpirrazolo[ La 1,5-a]-pirimidina (CC), a una concentración de 10 𝜇M inhibió el aumento inducido por HCF1/BSS en la translocación nuclear de PGC-1 en 156 y 235 por ciento, respectivamente, en miotubos C2C12 ( tablas 1 y 2). La translocación nuclear inducida por HCF1/BSS de PGC-1 también se evitó mediante la coincubación con kCh o DMTU (Figuras 6 y 7, Tablas 1 y 2 del Material complementario).

3.4. Efecto de HCF1/BSS sobre la expresión mitocondrial de UCP3 y citocromo c oxidasa (COX) en miotubos C2C12.

Para determinar la importancia de la activación inducida por HCF1/BSS en la vía AMPK/PGC-1, los efectos de HCF1/BSS en el desacoplamiento mitocondrial y la biogénesis, según lo evaluado por los niveles de UCP3 y COX (un indicador confiable de la masa mitocondrial en las células), respectivamente, fueron investigados. La preincubación con HCF1/BSS aumentó significativamente los niveles mitocondriales de UCP3 y COX, con un alcance de estos aumentos de 37 y 23 por ciento (en miotubos incubados con HCF1-) (Figura 8) y 52 y 24 por ciento (en miotubos incubados con BSS). ) (Figura 9), respectivamente, en comparación con el respectivo control no preincubado. Las elevaciones inducidas por HCF1/BSS en los niveles de UCP3 y COX se evitaron por completo mediante la coincubación de HCF1 con kCh, DMTU o

CC (Tablas 1 y 2 del Material Suplementario). Cabe señalar que las concentraciones de kCh y CC utilizadas en este experimento se ajustaron a 20 y 1 𝜇M, respectivamente, para evitar los efectos citotóxicos de kCh y CC en los miotubos C2C12 (observación no publicada).

3.5. El papel del desacoplamiento mitocondrial en la reducción de peso inducida por HCF1-en ratones obesos inducidos por HFD.

El posible papel del desacoplamiento mitocondrial en la reducción de peso inducida por HCF1-se examinó más a fondo mediante el uso del acoplador químico, kCh (Tabla 3 del material complementario). HCF1 indujo el desacoplamiento mitocondrial en el músculo esquelético del ratón, como lo demuestra la reducción en la relación de control respiratorio mitocondrial (RCR) y el aumento en la expresión mitocondrial de UCP3, tanto en ratones alimentados con ND como con HFD. kCh per se (en una dosis diaria de 9 mg/kg) aumentó significativamente el RCR mitocondrial en un 23 por ciento en ratones alimentados con ND (pero no en ratones alimentados con HFD). El desacoplamiento mitocondrial inducido por HCF1-en ratones alimentados con HFD fue completamente inhibido por el cotratamiento con kCh. HCF1 produjo reducción de peso en ratones alimentados con ND y HFD. Este efecto se asoció con la supresión del aumento inducido por HFD en el índice de grasa visceral. A diferencia de HCF1, kCh no produjo ningún efecto detectable sobre el aumento de peso en animales ND y HFD durante el transcurso de 8- semanas del experimento. La coadministración de kCh con HCF1 eliminó los efectos supresores inducidos por HCF1-sobre el aumento inducido por HFD en el peso corporal y el índice de grasa visceral en ratones (Tabla 3 del material complementario).