Parte 1: la homoarginina mejora la nefropatía diabética independientemente de la óxido nítrico sintasa-3

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Resumen

Recientemente demostramos que la suplementación con homoarginina confiere protección renal en modelos de ratones diabéticos. En este estudio, probamos si el efecto protector de la homoarginina es independiente de la sintasa de óxido nítrico-3 (NOS3) en la nefropatía diabética (DN). Los experimentos se llevaron a cabo en ratones deficientes en NOS3 (NOS3-7) y su compañero de camada de tipo salvaje utilizando múltiples dosis bajas de vehículo o estreptozotocina y tratados con homoarginina a través del agua potable durante 24 semanas. La suplementación con homoarginina durante 24 semanas en ratones diabéticos NOS3-/ atenuó significativamente la albuminuria, aumentó el nitrógeno ureico en sangre, los cambios histopatológicos y la fibrosis renal, los marcadores fibróticos renales y el reclutamiento de macrófagos renales en comparación con los diabéticos NOS tratados con vehículo3- / ratones. Además, la suplementación con homoarginina restauró la función mitocondrial renal después de la diabetes. Es importante destacar que no hubo cambios significativos en la expresión del ARNm de NOS1 o NOS2 de riñón entre todos los grupos. Además, la suplementación con homoarginina mejoró la función cardíaca y redujo la fibrosis cardíaca después de la diabetes. Estos datos demuestran que el efecto protector de la homoarginina es independiente de NOS3, lo que finalmente cambiará nuestra comprensión de los mecanismos por los cuales la homoarginina induce la protección renal y cardíaca en la ND. El efecto protector de la homoarginina en la DN podría estar mediado por la mejora de la función mitocondrial.

Palabras clave: función cardíaca, nefropatía diabética, homoarginina, NOS3

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1. INTRODUCCIÓN

Diabeteses una causa grave y cada vez más frecuente de morbilidad y mortalidad en los Estados Unidos, con un 12-14 por ciento estimado de adultos diabéticos, con tasas aún más altas entre las minorías étnicas (Gao et al, 2016; Menke et al, 2015) . Las pérdidas económicas y de productividad debidas a complicaciones diabéticas superan los $245 mil millones y provocan efectos fisiológicos y psicológicos, incluidos efectos sistémicos.inflamación, disfunción renal y cardiaca, depresión y ansiedad social (Jha et al.,2018; Menke et al., 2015; Moreno et al.,2018; Tao et al.2015; Vanstone et al., 2015). La nefropatía diabética (ND) es un trastorno crónico progresivo que conduce a un rápido deterioro y a una insuficiencia renal terminal. Durante la última década, la incidencia de insuficiencia renal por diabetes se ha duplicado. Las terapias tradicionales, que incluyen el control de la presión arterial y la glucosa y otros cambios en el estilo de vida, solo han tenido un éxito modesto en retrasar la progresión de la insuficiencia renal. Por lo tanto, es importante identificar los mecanismos involucrados en el desarrollo y progresión de la diabetes.enfermedad del riñon. Cistanche deserticapertenece a la medicina tradicional china y es un fármaco tonificante renal. Se usa principalmente para la deficiencia de yang de riñón, como dolor de espalda, dolor de espalda, impotencia, etc. Sin embargo, la mayoría de los pacientes diabéticos tienen deficiencia de yin, y si tienen deficiencia de yang, pueden tomarlo adecuadamente. Sin embargo, debe usarse con precaución en las manifestaciones de calor negativo como miedo al calor y sudores nocturnos y sequedad de boca. Consulte a un médico primero, de todos modos.

La homoarginina, un análogo endógeno de la arginina, que no participa en la síntesis de proteínas, se ha convertido en un nuevo actor en la salud y la enfermedad (Pilz et al., 2015). La homoarginina es sintetizada por la arginina mitocondrial: glicina amidinotransferasa (AGAT) en riñones usando L-arginina y L-lisina como sustratos (Choe et al., 2013; Ryan & Wells, 1964), y catabolizada usando alanina: glioxilato aminotransferasa 2 (AGXT2) (Rodionov et al.2016). Las concentraciones plasmáticas de homoarginina están inversamente correlacionadas con el riesgo de enfermedad cardiovascular y mortalidad general (Jud et al., 2018; Marz et al., 2010), mayor riesgo de accidentes cerebrovasculares fatales (Haghikia et al., 2017), insuficiencia cardíaca congestiva y hipertrofia ventricular izquierda(Atzler et al.,2013,2017; Bahls et al., 2018; Pilz, Edelmann, et al.,2014), envejecimiento(Atzler, Schwedhelm, et al.,2014; Marz et al., 2010) , tabaquismo (Atzler, Gore, et al, 2014; Sobczaket al.,2014; Vogler al,2015; Zwan et al.,2013), índice de masa corporal (Atzler, Gore, et al.,2014; Marz et al.2010) ; Pilz, Teerlink, et al., 2014) y embarazo (Valtonen et al, 2008). Los niveles bajos de homoarginina actúan como un indicador de disfunción cardíaca, con niveles altos asociados de dimetilarginina asimétrica (ADMA) (Atzler, Schwedhelm, et al., 2014; Jud et al., 2018; Kayacelebiet al., 2014; Pilzet al., 2015) ; Vogler al, 2015). Los efectos de niveles bajos de homoarginina sobre la producción/acción del óxido nítrico (NO) se han relacionado con un mayor riesgo de accidente cerebrovascular y aterosclerosis (Haghikia et al, 2017). La sintasa de óxido nítrico endotelial (NOS3) se expresa constitutivamente en las células endoteliales y funciona para ajustar los niveles intracelulares de NO en respuesta a los niveles de calcio (Zanchi et al., 2000). La homoarginina puede contribuir a la síntesis de NO sirviendo como sustrato para la NOS porque la homoarginina, incluso con su afinidad más débil por la NOS en comparación con la arginina, puede metabolizarse a NO y homocitrulina (Drechsler et al., 2011). En el riñón, niveles bajos de homoarginina es un fuerte factor de riesgo de muerte súbita cardíaca y muerte por insuficiencia cardíaca en pacientes en hemodiálisis (Drechsler et al., 2011). Además, los niveles bajos de homoarginina se asocian con un mayor riesgo cardiovascular en pacientes con trasplante renal (Kayacelebi et al., 2017). Tanto en animales (Banchaabouchi et al., 2001; Tofuku et al., 1985) como en humanos (Drechsler et al. 2013) con lesiones renales crónicas, los niveles de homoarginina se reducen y los niveles bajos de homoarginina en plasma se relacionaron significativamente con la reducción de la tasa de filtración glomerular (TFG) y la proteinuria (Ravani et al., 2013). Aunque los datos epidemiológicos mostraron que los niveles reducidos de homoarginina se asociaron con una mayor mortalidad en enfermedades renales y cardiovasculares (Drechsler et al., 2015; Jud et al., 2018; Marz et al., 2010; Ravani et al., 2013), la Los mecanismos fisiológicos directos de la homoarginina siguen sin estar claros. Anteriormente demostramos que la homoarginina es un tratamiento eficaz para la ND (Wetzel et al., 2019). Sin embargo, se desconoce el mecanismo de acción de la homoarginina en la disfunción renal y cardíaca.

En el estudio actual, probamos la hipótesis de que el efecto protector de la homoarginina en las funciones renal y cardíaca en la diabetes es independiente de NOS3. Nuestros resultados indican que la homoarginina interviene en la protección renal y cardíaca en ratones diabéticos NOS3-一, lo que en última instancia cambiará nuestra comprensión de los mecanismos por los cuales la homoarginina mejora la lesión renal diabética. El efecto protector de la homoarginina en la DN podría estar mediado por la mejora de la función mitocondrial.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 modelo de ratón diabético

Todos los experimentos con animales se realizaron en ratones macho de 6-semanas de edad (The Jackson Laboratory, Bar C57BL/6J o NOS3-1-Harbor, ME). Los ratones se mantuvieron a 23 grados C y en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 con libre acceso a comida estándar y agua. La diabetes se indujo mediante inyección intraperitoneal de 50 mg/kg de estreptozotocina (STZ) o control de solución salina después de un ayuno de 6- h durante 5 días consecutivos. Todos los procedimientos se realizaron por la mañana durante todo el estudio. Los niveles de glucosa en sangre se midieron en ratones que no estaban en ayunas utilizando un glucómetro Contour Next EZ con tiras Contour Next de la vena de la cola de los ratones, y los ratones diabéticos se definieron como aquellos que tenían un nivel de glucosa en sangre superior a 350 mg/dl.L-Homoarginina (Sigma, St. Louis MO, Cat. #: H1007) se complementó en el agua potable a una concentración de 50 mg/L como se describió anteriormente (Wetzel et al., 2019) y se reemplazó cada 4 días. Al final del estudio (24 semanas), se recogieron muestras de orina de 24- h, los ratones se sacrificaron mediante una inyección intraperitoneal de un cóctel de ketamina/xilazina; se obtuvo plasma por punción cardíaca, y se extirparon riñones y corazones para estudios posteriores. Para la recolección de orina, los ratones se colocaron individualmente en jaulas metabólicas durante 16 h con libre acceso a agua potable, y la orina se recolectó en tubos colectores que contenían 200 ul de aceite mineral que evita la evaporación de la orina. La sangre se recogió mediante punción cardíaca y se centrifugó a 3000 g durante 3 min a 4 grados para separar el plasma. Después de la recolección, todas las muestras se almacenaron a -80 grados C hasta su análisis. El número de ratones por grupo se proporciona en la Tabla 1. Las muestras derivadas de ratones Ins2Aita se obtuvieron como se describió anteriormente (You et al., 2015). Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de San Antonio.

2.2 Inmunohistoquímica

Se fijaron tejidos de riñón de ratón en formalina al 10 por ciento y se incluyeron en parafina, y se cortaron secciones de 3-μm. La inmunohistoquímica se realizó en secciones incluidas en parafina con anticuerpo anti-ratón Mac-2 (clon M3/38; Cedarlane, Burlington, NC) como se describió anteriormente (Youet al., 2013, 2014). Las imágenes se tomaron con un microscopio Olympus BX60 y una cámara digital Olympus Q-Color3 utilizando el software de imagen Q-capture Pro 7. El número de macrófagos glomerulares se contó en 20 glomérulos/sección (número de macrófagos en los glomérulos dividido por el número de glomérulos) de forma ciega con un aumento de 40x y se promedió como se describió anteriormente (Morris et al., 2011; Wetzel et al., 2019; You et al., 2013, 2014).

2.3 Histopatología renal y cardiaca

Los riñones y los corazones se fijaron en paraformaldehído al 4 por ciento, se incluyeron en parafina y se cortaron secciones de 5-μum. Las secciones se tiñeron con tricrómico de Masson o tinción con ácido peryódico de Schiff (PAS), se examinaron a ciegas y se promediaron las puntuaciones. Para determinar el porcentaje de área de fibrosis, se obtuvieron imágenes tricrómicas de Masson a 10x y se analizaron en ImageJ para medir el porcentaje de área de fibrosis. Se tomaron imágenes representativas con un microscopio Olympus BX60 y una cámara digital Olympus Q-Color3 utilizando el software de imagen Q-capture Pro 7. Las características glomerulares se midieron utilizando el software Bioquant Osteo (Bioquant Image Analysis Corporation, Nashville, TN), y el porcentaje de índice de lesión se calculó como se describió anteriormente (Mohan et al., 2008). Para cada riñón, obtuvimos 12 imágenes y analizamos un glomérulo para cada campo para promediar para cada animal para el análisis estadístico.

2.4 Metodología analítica

La concentración de albúmina en orina se midió mediante ELISA utilizando un kit Albuwell M (Excell, Filadelfia, PA) como se describió anteriormente (Awad, You, Gao, Gvritishvili, et al., 2015). La creatinina en orina se midió mediante el ensayo de creatinina Diazyme (Diazyme Laboratories, Poway, CA) (Awad et al, 2011; Awad, You, Gao, Cooper, et al., 2015). El nitrógeno ureico en sangre (BUN) se determinó utilizando un kit de ensayo de urea QuantiChrom (BioAssay Systems, Hayward, CA) como se describió anteriormente (You et al., 2017). Las presiones sistólicas de los ratones se midieron con el sistema de presión arterial no invasiva CODA (Kent Scientific Corporation, Torrington CT) como se describió anteriormente (Awad, You, Gao, Gvritishvili, et al., 2015). Los ratones se aclimataron durante 10 minutos a 26 grados antes de que comenzaran las lecturas. Las lecturas se tomaron a la misma hora del día para todos los grupos para evitar cualquier variación diurna.

2.5 Mediciones de la función cardíaca

La ecocardiografía en modo B y modo M en serie se realizó con una plataforma de imágenes Vevo 2100 (VisualSonics, Toronto, Canadá) con un transductor lineal de 30- MHz para monitorear con precisión los parámetros hemodinámicos cardíacos y evaluar la estructura del corazón de los ratones después de 22 semanas. del tratamiento con homoarginina. La fracción de eyección del ventrículo izquierdo (EF) y la contracción fraccional (FS) del ventrículo izquierdo se cuantificaron utilizando el modo M como se describió anteriormente (lorga et al., 2016, 2018).

2.6 Aislamiento de ARN y PCR en tiempo real

El ARN se aisló mediante extracción con Trizol de secciones de riñón completo y se transcribió inversamente a ADNc utilizando el kit de síntesis de ADN script Bio-Rad (Hercules, CA). La PCR en tiempo real se realizó en un sistema en tiempo real CFX384 (Bio-Rad, Hercules, CA) utilizando cebadores Tagman para MCU de ratón (Mm0116873_m1), fibronectina (Mm01256744_m1), crecimiento tumoral (TGF, Mm01178820_m1), NOS1(Mm00435175_m1), NOS2(Mm00440502_m1) y Rn18S (Mm03928990_gl)(Thermo Fisher, Waltham, MA). Los valores de Ct se normalizaron a 18S y se compararon con muestras NOS3. Cebadores para actina de músculo liso (FW:5'-CTGCCGTTTTCCCCCTTCCTG-3', RV:5'-TTGCTTCCTCCTCCTTTG-3'), E-cadherina (FW: 5'-TGAGTGTGTGGGTGCTGA-3',RV:5'-CGGTTTC AATGGCTTACCTTTTCC-3') y -actina (FW:5'-GC TGGTTGTGTAAGGTAAGGTGTGC-3',RV: 5'-GAGG GGGTTGAGGTGTTGAGG-3) de Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Las muestras de cDNA se analizaron utilizando SYBR Green Master Mix (Thermo Scientific, Rockford IL), como se describió anteriormente (Morris et al., 2011), y se normalizaron a -actina para comparación con NOS3-/- muestras.

2.7 Transferencia de Western

El tejido renal se homogeneizó en tampón RIPA que contenía {{0}},1 por ciento de Triton X-100 suplementado con inhibidores de la proteasa (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) y se aclaró mediante centrifugación a 10,{{4} } g durante 10 min a 4 grados y se recogió el sobrenadante. La concentración de proteína se determinó mediante ensayo de ácido bicinchónico (BCA) (Thermo Scientific, Waltham, MA). Se separó una muestra de 50 ug de lisado de riñón en 4-12 por ciento de gel Bis-Tris (Life Technologies, Carlsbad, CA) y se transfirió a membranas de PVDF antes de bloquear con leche en polvo al 5 por ciento. Se realizaron transferencias Western utilizando los siguientes anticuerpos: anticuerpos MiCU1 (0,4 ug/ml; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) y actina (1:1000; Cell Signaling, Danvers, MA). Las transferencias de Western se cuantificaron usando el software ImageJ (NIH, Bethesda, MD) y se normalizaron a la expresión de la proteína actina.

2.8 Análisis estadístico

Las comparaciones entre todos los grupos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism (versión 7.04, San Diego, CA). Los resultados se expresan como media ± SEM. Se usó ANOVA unidireccional seguido de la prueba de diferencia mínima significativa de Fisher para comparar la importancia entre los grupos. Un valor de p<0.05 represented="" a="" significant="">