Parte 2: Ceramida-1-fosfato como regulador potencial de la segunda bomba de sodio de los túbulos proximales del riñón mediante la activación de distintas vías de proteína quinasa de forma jerárquica

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4. Discusión

El transporte de fluidos a través del epitelio tubular es uno de los eventos clave directamente correlacionados con la mayoría de los distintosfunciones renales[49]. Entre los diferentes solutos que se manejan en elriñón, Nat es especialmente importante. Debido a su abundancia en el líquido extracelular, es imperativo comprender los mecanismos por los cuales Nat es reabsorbido o excretado en la orina porque las alteraciones en las concentraciones intersticiales e intravasculares de Na+ conducen a cambios en el volumen y pueden causar alteraciones en la presión arterial[50]. . La regulación de los niveles de Nat en los compartimentos líquidos del cuerpo está impulsada principalmente por transportadores activos primarios con la Nat clásica más la Kt-ATPasa [51] involucrada en el transporte de masa, mientras que la "segunda" bomba de Nat o Nat-ATPasa está involucrada en el transporte fino. regulación ajustada de la reabsorción de Nat [52,53] Hay muchos informes en la literatura sobre la regulación de Nat más K más -ATPasa por hormonas y autacoides [50,54] así como el papel de la fosforilación reguladora [50,55]. Por el contrario, menos grupos citan la regulación de Na más -ATPasa, ya que todavía existe cierta controversia con respecto a su identidad, a pesar de que los informes mostraban una actividad de Nat-ATPasa sensible a la furosemida desde mamíferos [41,56,57] hasta protozoos [58,59]. ] así como la clonación de la bomba a partir de diferentes organismos [60-63]. A partir de los resultados presentados aquí, nuestro grupo demostró que no solo las hormonas y los autacoides son capaces de desencadenar vías de señalización celular que modulan la Nat-ATPasa, sino que el efecto de la ClP añadida exógenamente a las fracciones de BLM apunta a una posible interacción del lípido bioactivo con los dominios hidrofóbicos de los reguladores, o la propia bomba; o bien, debe haber un tipo de receptor C1P en el BLM, aún no identificado [20,22,23]. La Figura 6 muestra una propuesta de esquema para resumir estas posibles formas de acción de ClP. La capacidad de las ceramidas para desencadenar quinasas y provocar una respuesta fisiológica diferente se informó en células hepáticas [24]. Los autores no solo demostraron la capacidad de modulación dependiente de ceramida de la regulación de Nat/K más -ATPasa y quinasa, sino que también informaron respuestas bifásicas considerando la estimulación dependiente del tiempo de esas líneas celulares, lo que ilustra que debe haber una diafonía compleja entre ceramida -señalización dependiente y otros sistemas de señalización presentes en las membranas celulares. membranas (Figura 2). Además, los resultados presentados aquí en combinación con resultados previos de nuestro grupo muestran claramente que Cer [33] y ClP modulan la PKA y la PKC asociadas a BLM, que parecen mediar los efectos provocados por las ceramidas en la Nat-ATPasa cuando las fracciones de BLM se tratados con C1P 100 nM, la inhibición de la bomba no se pudo atribuir a PKA (Figura 4) ya que la preincubación con PKAi no afectó la acción inhibidora de C1P. Por otro lado, la inhibición significativa de la actividad Nat-ATPasa tras el tratamiento con ClP se previene completamente con calfostina C (Figura 3). Informes anteriores han demostrado que la PKA estimula la actividad de la Nat-ATPasa renal en una vía que vincula los receptores acoplados a Gs con la actividad de la bomba [41]. Los sistemas de señalización incluidos aquí en nuestro manuscrito (PKA y PKC) han sido bien estudiados, por lo que hay mucha información en la literatura que muestra las concentraciones para los controles positivos como se usan aquí (AMPc y ácido miristato de forbol PMA, respectivamente). Como nuestro enfoque no era un estudio dosis-respuesta con activadores o inhibidores clásicos para los diferentes sistemas de señalización, solo utilizamos las concentraciones de activadores o inhibidores que ya se habían utilizado de manera efectiva en otros estudios de nuestro grupo o de otros.

Figura6. Mecanismo propuesto para la acción de ClP sobre la actividad Na plus -ATPasa de BLM. (1) C1P (lípido rojo) inhibe la PKC a través de un receptor acoplado a proteína G aún desconocido, lo que da como resultado la inhibición de Na más -ATPasa (proteína azul). La misma ruta podría activar BLM PKA (flecha roja) sin efecto en la bomba. (2) CIP podría unirse directamente a los efectores presentes en el BLM, como el PKC, lo que lleva a la acción inhibitoria sobre la actividad Na más -ATPasa descrita. Nuestros resultados mostraron que aunque la PKA está presente en el BLM y lista para modular la bomba por cAMP (círculos verdes y flecha verde), su activación por CIP no afectó a la bomba (flecha roja discontinua). (3) CIP se une directamente a la Nat-ATPasa o se enriquece en el microambiente de la membrana lipídica que rodea a la Nat-ATPasa, modulándola así. A partir de los resultados presentados aquí, no pudimos detectar ninguna acción moduladora de ClP en Nat/K más -ATPasa (proteína púrpura) presente en las fracciones de BLM.

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La detección de una jerarquía en la fosforilación de la Nat-ATPasa se sugirió cuando estimulamos la BLM con Cer [33] y observamos que el bloqueo de la BLM-PKCZ, atenuó la acción inhibitoria de Cer sobre la bomba y permitió que el cAMP- PKA activada para estimularla. A pesar de un número creciente de informes que muestran diferentes roles para las quinasas activadas por Cer [44,64-66], este es el primer informe de la acción fisiológica de C1P en las quinasas residentes en BLM, que ciertamente juega un papel en la regulación de Nat manipulación en el riñón. No podemos afirmar definitivamente que la Nat-ATPasa sea fosforilada directamente por las quinasas estudiadas, ya que no existen herramientas experimentales disponibles para ello, principalmente porque aún no se ha identificado la estructura completa de la segunda bomba de sodio. Sin embargo, es bien sabido que la Nat-ATPasa es una ATPasa de tipo P, y este hecho nos permite postular que puede ser directamente modulada por fosforilación en supuestos sitios reguladores [46,55]. No podemos descartar que la activación de las respectivas quinasas conducirían a la fosforilación de otra proteína en esta red reguladora, que sería la responsable de la inhibición de la ATPasa.

Entre los diferentes esfingolípidos bioactivos, C1P está menos documentado en los diferentes sistemas fisiológicos. Por otro lado, la esfingosina-1-fosfato, que puede ser el lípido bioactivo más importante, está muy bien estudiada en la fisiología y fisiopatología renal [2,6,7,67]. Como los miembros de S1P y ClP son un tipo de familia de moléculas de señalización con precursores comunes y que comparten pasos de interconversión mutuos, es posible imaginar que ClP también estaría presente a lo largo de toda la nefrona. El trabajo de Sugiura et al., 2002[11], un hito en el campo, mostró que CerK se expresa en gran medida en los riñones. A pesar de los datos sólidos en la literatura que muestran el papel de ClP en los podocitos y la enfermedad glomerular [68,69], no ha habido un trabajo que muestre individualmente la expresión de CerK y la acción de ClP en ninguno de los segmentos de la nefrona. De lo contrario, es probable que ClP esté presente en todas las células renales, ya sea por la presencia de esfingomielina, que permitiría la ruta de rescate para la síntesis de ClP, o por el hecho de que el torrente sanguíneo puede proporcionar ClP al tejido renal. Estas son formas muy plausibles de pensar que este lípido de señalización desempeñaría diferentes funciones en los otros segmentos de la nefrona, aunque no lo exploramos aquí.

Se demostró sustancialmente que los niveles de Cer estaban significativamente elevados durantelesión renaldebido a un aumento ya informado en la actividad de la esfingomielinasa estimulada por Ca2t después de que se interrumpe la homeostasis celular de Ca2t [2,4,24,70]. Esta observación nos permite postular que la modulación de la actividad Nat-ATPasa de BLM mediada por quinasas por Cer y C1P podría ser especialmente relevante en el tejido renal lesionado, lo que podría abrir un nuevo papel para las ceramidas en el establecimiento y progresión de las nefropatías. En presencia de C1P, las BLMquinasas estudiadas se modularon diferencialmente (Figura 5). Mientras que ClP inhibió la PKC, lo que condujo a una inhibición significativa de la actividad Nat-ATPasa, la activación de PKA dependiente de C1P no afectó la actividad Nat-ATPasa. Esto nos permite postular que existe una jerarquía que involucra a diferentes quinasas, lo que da como resultado un cambio complejo de activación/desactivación de la Nat-ATPasa. Este cambio puede involucrar diferentes isoformas de PKC y PKA, o debe haber una interferencia con la conversión potencial de C1P a Cer y otros lípidos bioactivos que desencadenan otras vías de señalización albergadas en el BLM, que ya se ha descrito en células hepáticas [24].

El equilibrio entre Cer y ClP podría ser una nueva diana prometedora para el desarrollo de nuevas clases de fármacos con acción más eficiente para intentar frenar el avance deinsuficiencia renal, o al menos, elevar la calidad de vida de los pacientes renales.

5. Conclusiones

A partir de los resultados presentados aquí, una cascada de señalización que comienza con la producción de Cer y la posterior fosforilación a ClP es una vía eficiente para inhibir la Nat-ATPasa encélulas de los túbulos proximales renalesa través de PKA y PKC asociadas a BLM como efectores[17]. Estas observaciones revelan la importancia de las proteínas quinasas en el control fino de los flujos de Nat en un segmento de nefrona donde se reabsorben más de dos tercios del ultrafiltrado glomerular, el túbulo proximal. Hasta donde sabemos, el presente trabajo muestra por primera vez que ClP puede modular la BLM-Nat-ATPasa de las células del túbulo proximal del riñón al activar las quinasas asociadas a la membrana (PKA y PKC). Por lo tanto, los resultados anteriores prueban la opinión de que Cer y ClP participan en la red reguladora de esfingolípidos y glicerolípidos bioactivos residentes en este segmento de nefrona, lo que debería ser cierto para la nefrona en general. Esta hipótesis puede ser apoyada por la opinión de que Cer es un lípido presente virtualmente en todos los segmentos de la nefrona y que la disponibilidad de Cer permitiría la formación de C1P.