La nicotina paterna mejora la memoria del miedo, reduce la administración de nicotina y altera la función genética y neuronal del hipocampo en la descendencia

Contacto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correo electrónico:audrey.hu@wecistanche.com

Lisa R. Goldberg1*|Dana Zeid1*|Munir Gunes Kutlu2|Roberto D. Cole3|Valeria Lallai4|Sebastian5|István Albert5|Christie D. Fowler4|Vinay Parikh6|Thomas J. Gould1

1Departamento de Salud Bioconductual, Universidad Penn State, University Park, Pensilvania

2Departamento de Farmacología, Facultad de Medicina de Vanderbilt, Nashville, Tennessee

3Facultad de Farmacia, Universidad de Kentucky, Lexington, Kentucky

4Departamento de Neurobiología y Comportamiento, Universidad de California Irvine, Irvine, California

5Bioinformática, Bioquímica y Biología Molecular, Penn State University, University Park, PA

6Departamento de Psicología, Universidad de Temple, Filadelfia, Pensilvania

Resumen

El consumo de nicotina sigue siendo muy prevalente con productos de tabaco y cigarrillos electrónicos que se consumen en todo el mundo. Sin embargo, la creciente evidencia de herencia epigenética transgeneracional sugiere que el uso de nicotina puede alterar el comportamiento y la neurobiología en las generaciones posteriores. Probamos los efectos de la exposición paterna crónica a la nicotina en ratones C57BL6/J sobre el condicionamiento del miedo en la descendencia F1 y F2, así como la extinción condicionada del miedo y la recuperación espontánea, la autoadministración de nicotina, el funcionamiento colinérgico del hipocampo, la expresión de ARN y la metilación del ADN en F1 descendencia. La exposición paterna a la nicotina se asoció con un mayor condicionamiento del miedo contextual y con claves y una recuperación espontánea de los recuerdos del miedo extinguidos. Además, el refuerzo de nicotina se redujo en ratones engendrados con nicotina, según lo evaluado en un paradigma de autoadministración. Estos fenotipos de comportamiento se combinaron con una respuesta alterada a la nicotina, unión del receptor de acetilcolina nicotínico del hipocampo sobrerregulado, corrientes colinérgicas evocadas del hipocampo reducidas y metilación alterada y expresión de genes del hipocampo relacionados con el desarrollo neuronal y la plasticidad. El análisis de la expresión génica sugiere efectos multigeneracionales en redes genéticas más amplias potencialmente involucradas en la neuroplasticidad y los trastornos mentales. De manera similar, los cambios en el condicionamiento del miedo sugieren fenotipos análogos a los trastornos de ansiedad similares al estrés postraumático.

PALABRAS CLAVE: colinérgico, hipocampo, aprendizaje, multigeneracional, nicotina, transgeneracional

efectos de la cistanche

1. INTRODUCCIÓN

La evidencia acumulada sugiere que el impacto de la exposición a las drogas de abuso se extiende más allá del individuo y afecta los fenotipos fisiológicos y conductuales en la descendencia no expuesta.1-3 La caracterización de los efectos de la nicotina entre generaciones es fundamental considerando la prevalencia del uso de productos de tabaco4 y el aumento dramático del uso de cigarrillos electrónicos.5 A través de sus efectos sobre los sistemas colinérgicos cerebrales, la exposición a la nicotina produce alteraciones marcadas en la función cerebral que pueden ser la base de la adicción a la nicotina y contribuir a un mayor riesgo de trastornos psiquiátricos, incluida la depresión6 y la ansiedad.7 Las modificaciones epigenéticas posteriores a la activación colinérgica pueden permiten efectos persistentes en la función celular y del circuito.8,9 Hasta hace poco, se creía que estas modificaciones epigenéticas se borraban con el establecimiento de la línea germinal y, por lo tanto, se secuestraban de las generaciones posteriores. Sin embargo, las modificaciones epigenéticas, incluida la metilación del ADN, las modificaciones postraduccionales de histonas y los ARN no codificantes, adquiridas en una generación pueden heredarse en la próxima generación.10,11 Estas modificaciones epigenéticas pueden mediar los efectos multigeneracionales y transgeneracionales de la exposición de los padres a la nicotina en el comportamiento y la neurobiología de la descendencia. .

Los estudios con roedores de múltiples laboratorios independientes han comenzado a identificar las consecuencias multigeneracionales y transgeneracionales de la exposición de los padres a la nicotina. Hasta ahora, este trabajo ha identificado los efectos de la exposición de los padres a la nicotina en los fenotipos depresivos y similares a la ansiedad,1 la flexibilidad cognitiva,2 los comportamientos similares al trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH)3 y la expresión génica.1,2 Las consecuencias multigeneracionales y transgeneracionales de la exposición a la nicotina puede afectar los endofenotipos involucrados en la adicción a la nicotina y la salud mental. Por ejemplo, hemos demostrado que la exposición a la nicotina modula el condicionamiento del miedo contextual, un modelo de aprendizaje del miedo dependiente del hipocampo que está relacionado con la vulnerabilidad a los trastornos de salud mental, como el trastorno de estrés postraumático (TEPT) y la adicción.12-14 La nicotina los efectos sobre el aprendizaje del miedo contextual son modulados por el hipocampo.15,16 Hemos encontrado que la exposición aguda a la nicotina mejora el aprendizaje del miedo dependiente del hipocampo,15,17 perjudica la extinción del miedo contextual,18,19 y aumenta la recuperación espontánea del miedo contextual después extinción.18 Sin embargo, no se han estudiado los efectos multigeneracionales y transgeneracionales de la exposición paterna a la nicotina en estos fenotipos. Además, ningún estudio previo ha caracterizado los efectos multigeneracionales de la nicotina sobre la función colinérgica. La herencia multigeneracional se refiere a los fenotipos que surgen en la generación que sigue inmediatamente a los individuos expuestos, mientras que la herencia transgeneracional consiste en la herencia de información epigenética mediada por la línea germinal entre generaciones en ausencia de influencias ambientales directas que conduzcan a la variación fenotípica. y los efectos transgeneracionales de la exposición paterna a la nicotina sobre el aprendizaje del miedo contextual y estimulado en la generación F1 y F2, así como sobre la autoadministración de nicotina, la unión del receptor de acetilcolina nicotínico del hipocampo (nAChR), el funcionamiento colinérgico del hipocampo, la expresión génica del hipocampo y la metilación del ADN del hipocampo en la generación F1. Presumimos que la exposición paterna a la nicotina afectará el condicionamiento del miedo, la expresión del gen del hipocampo y la función en la descendencia y la descendencia.

efectos del extracto de cistanche

2 MÉTODOS Y MATERIALES

2.1 Sujetos

Los sujetos eran ratones C57BL/6J machos y hembras (de 8 a 20 semanas de edad, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Con la excepción del alojamiento para la cría en harén, todos los animales fueron alojados en grupo con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y acceso ad libitum a comida y agua. Durante la autoadministración, a los sujetos se les restringieron los alimentos al 85 por ciento al 90 por ciento de su peso corporal de alimentación libre y se les suministró agua ad libitum. Todas las pruebas de comportamiento se realizaron entre las 9:00 AM y las 6:00 PM. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con la Guía NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por los comités IACUC de Penn State University, Temple University o University of California Irvine.

2.2 Exposición paterna a la nicotina

Los machos (8 semanas) recibieron 0,9 por ciento de solución salina estéril o sal de tartrato de hidrógeno de nicotina (12,6 mg/kg/día, peso base libre: Fisher Scientific, Waltham, MA o MP Biomedical, Santa Ana, CA) disueltos en 0.9 por ciento de solución salina estéril, administrada por vía subcutánea a través de minibombas osmóticas (Alzet, modelo 1004, Durect, Cupertino, CA) durante 28 días. Esta dosis produce niveles plasmáticos de nicotina y cotinina comparables con los observados en fumadores humanos moderados.20,21

2.3 Generación de ratones F1 y F2

La vida media de la nicotina en ratones es de aproximadamente 6 minutos.22 Se ha demostrado anteriormente que los impactos de la abstinencia de nicotina se disipan 4 días después de la eliminación de la nicotina.23-25 Por lo tanto, un retraso de 4 días entre el tratamiento con nicotina y se implementó la reproducción para asegurar la eliminación sistémica de la nicotina antes de la reproducción. Los ratones macho se colocaron en jaulas con dos hembras C57BL/6 J ingenuas (de 8 a 20 semanas de edad) durante 2 semanas para generar descendencia F1. Los ratones F2 se generaron apareando ratones F1 machos ingenuos con hembras ingenuas.

2.4 Condicionamiento del miedo

Los procedimientos de condicionamiento y extinción del miedo se han descrito en detalle anteriormente. 19 Brevemente, los ratones fueron entrenados y probados en cámaras de atenuación de ruido (18,8 × 20 × 18,3 cm, 65 dB de ruido de fondo; MED Associates, St. Albans, VERMONT). A los ratones F1 y F2 se les condicionó el miedo con dos estímulos condicionados (CS, 30 s, ruido blanco de 85 dB) y estímulos no condicionados (EE. UU., 2 s, descargas en los pies de 0,57 mA) emparejados separados por 120 segundos. Para examinar los efectos agudos de la nicotina sobre el condicionamiento del miedo en ratones F1 y F2, las crías recibieron nicotina aguda (0,09 mg/kg, peso base libre NIC, ip; sal de tartrato de hidrógeno de nicotina, Fisher Scientific) o solución salina (SAL) de 2 a 4 minutos antes a sesiones de entrenamiento y pruebas. Veinticuatro horas después del entrenamiento, los ratones se devolvieron al contexto de entrenamiento durante 5 minutos para evaluar la congelación contextual. Después de las pruebas contextuales, los ratones se colocaron en distintas cámaras para evaluar el aprendizaje del miedo con claves. Los experimentadores cegados a las condiciones evaluaron la congelación, definida como la ausencia de movimiento voluntario además de la respiración, a través de un método de muestreo de tiempo imparcial.19 Para examinar los posibles efectos máximos durante las pruebas con señales, una cohorte separada de ratones F1 recibió un entrenamiento idéntico con solo un CS-US También se examinaron el emparejamiento, la extinción del miedo contextual y la recuperación espontánea. La extinción del miedo ocurrió durante cinco sesiones consecutivas comenzando el día después de la prueba de miedo contextual y con claves. Después de la última sesión de extinción, se dejó a los ratones sin perturbar en sus jaulas durante 7 días y luego se volvieron a probar en el contexto de entrenamiento para la recuperación espontánea. Para determinar si las diferencias observadas en el condicionamiento del miedo se debieron a diferencias en la sensibilidad a las descargas, la ansiedad o a déficits de aprendizaje más amplios, se probaron adicionalmente animales machos y hembras NIC y SAL en un campo abierto, sensibilidad a las descargas, laberinto en cruz elevado ( EPM) y nuevos paradigmas de reconocimiento de objetos (consulte la Información de apoyo para conocer los métodos y resultados completos).

2.5 Alimentos y autoadministración de nicotina intravenosa

A separate cohort of adult SAL‐Sired and NIC‐Sired F1 mice were used for food and nicotine self‐administration studies. Beginning at 6 weeks of age, male F1 mice were weighed, mildly food‐restricted to 85% to 90% of their free‐feeding body weight, and then trained to press a lever in an operant chamber (Med Associates) for food chow pellets (20 mg; TestDiet, Richmond, IN) under a fixed‐ratio 5, time out 20 seconds (FR5TO20 sec) schedule of reinforcement (see Supporting Information for full methods). Once stable responding was achieved (>25 gránulos por sesión en tres sesiones subsiguientes), se cateterizó la vena yugular de los sujetos bajo isoflurano (1 por ciento -3 por ciento)/anestesia con vapor de oxígeno, como se describió previamente. para responder de nuevo por una recompensa de comida. El restablecimiento de la respuesta a los alimentos asegura que los ratones se hayan recuperado lo suficiente después de la cirugía intravenosa y muestren una respuesta operante normal luego de un retraso en el acceso a las cámaras operantes. A los ratones se les permitió autoadministrarse nicotina por vía intravenosa (IV) durante sesiones diarias de 1 hora, de 6 a 7 días a la semana (sal de tartrato de hidrógeno de nicotina disuelta en 0.9 por ciento de solución salina estéril, {{1{ {12}}}}.03 mg/kg/infusión, peso base libre; MP Biomedical, Santa Ana, CA). La nicotina intravenosa se administró mediante una bomba de jeringa Razel (Med Associates). Cada sesión tenía dos palancas retráctiles (una activa, una inactiva). La finalización de los criterios de respuesta en la palanca activa resultó en la administración de una infusión de nicotina IV (0.{{20}}volumen de infusión de 3 ml; programación de FR5TO20 seg). Las respuestas en la palanca inactiva se registraron pero no tuvieron consecuencias programadas. Después de ocho sesiones de adquisición a 0,03 mg/kg/infusión, la dosis de infusión cambió a 0,1 mg/kg/infusión durante seis sesiones. Para cada dosis, se utilizó la ingesta media de las últimas tres sesiones para los análisis estadísticos. Los catéteres se enjuagaron diariamente con solución salina estéril fisiológica (0,9 por ciento p/v) que contenía heparina (100 unidades USP/ml). La permeabilidad del catéter se verificó con Brevital (metohexital sódico, Eli Lilly, Indianapolis, IN) después de la fase de autoadministración de nicotina. Para evaluar el comportamiento relacionado con la recaída, se analizó la incubación del deseo en los ratones después de la sesión inmediatamente después de la última dosis de 0,1 mg/kg/infusión de autoadministración de nicotina IV; en este procedimiento, se permite que los ratones respondan a la palanca activa pero no reciben infusiones de nicotina. En la primera sesión de incubación de línea de base (día 1), los ratones se colocaron en cámaras operantes bajo el programa FR5TO20 seg con activación de luz de señal contingente. Posteriormente, los ratones se alojaron en jaulas caseras durante 20 días. En el día 21 de abstinencia, se examinó a los ratones para detectar la incubación del ansia, y se administró la luz indicadora de la palanca activa según el programa FR5TO20 seg. Los estudios fueron realizados por experimentadores cegados a las condiciones del grupo, y las respuestas conductuales fueron registradas automáticamente por el software MedAssociates.

2.6 Unión al receptor nicotínico de acetilcolina

Se realizó un ensayo de unión de radioligandos16 usando hipocampos de ratones NIC-Sired (5 M y 10F) y SAL-Sired (9 M y 6F) F1 de 8 semanas de edad. Las muestras se homogeneizaron utilizando tampón de lisis (Tris 5 mM más EDTA 5 mM más EGTA 5 mM), se centrifugaron a 100 000 g durante 30 minutos a 4 grados, se resuspendieron en tampón de lisis y se centrifugaron de nuevo. Los sedimentos se resuspendieron en tampón Tris/sacarosa al 10 % y se incubaron con [3 H] epibatidina ([3 H] EB) (~2 nM según 27,28) (actividad específica 54,1 Ci/mmol, PerkinElmer, Boston, MA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se eligió [3 H]EB para la unión de nAChR, ya que los resultados anteriores mostraron que los nAChR 4 2 heteroméricos del hipocampo median los efectos de la nicotina en el condicionamiento del miedo.17 La unión no específica se evaluó en presencia de nicotina 300 μM (sal de tartrato de hidrógeno de nicotina disuelto en tampón Tris, concentración de base libre). Los nAChR unidos a [3H]EB se filtraron (recolector de células de 24 pocillos, Brandel Co, Gaithersburg, MD) y un contador de centelleo líquido (Tri-Carb 2810 TR, Perkin Elmer, Boston, MA) midió la radiactividad del filtro. La unión específica expresada como fmol/mg de tejido se calculó como la diferencia entre la unión total y la inespecífica.16

2.7 Registros colinérgicos amperométricos in vivo

Se usó una cohorte separada de ratones F1 NIC-Sired y SAL-Sired ingenuos de 10 a 20 semanas de edad para evaluar las alteraciones en la transmisión colinérgica del hipocampo mediante amperometría. Los microelectrodos de base cerámica (Centro de Tecnología de Microelectrodos, Lexington, KY), con 4 sitios de registro de platino (15 × 333 μm) dispuestos en pares (superior e inferior), se recubrieron con colina oxidasa (Número EC 1.1.3.17; Sigma‐ Aldrich, St. Louis, MO), como se informó anteriormente.29 Los electrodos se electropolimerizaron con meta-fenilendiamina (m-PD; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) para mejorar la selectividad para detectar corrientes de colina. Se usaron microelectrodos con una sensibilidad mayor o igual a 3pA/μM y un límite de detección menor o igual a 400 nM para colina para proporcionar un índice sensible de liberación de acetilcolina (ACh).30 Los animales fueron anestesiados con uretano (1.2‐1.5 g/kg, ip), y los microelectrodos recubiertos con enzimas se bajaron estereotáxicamente en posición dorsal (A/P -1,7 mm, M/L ± 1,5 mm, D/V -2,3 mm) o ventral (A/P -3,1 mm, M /L ± 3,0 mm, D/V −4,3 mm) hipocampo. El hipocampo ventral y dorsal se evaluaron por separado, ya que contribuyen de manera diferente al condicionamiento del miedo contextual: el hipocampo ventral (vHPC) tiene un papel más destacado en la asociación y expresión del miedo, mientras que el hipocampo dorsal (DHCP) es fundamental para la memoria contextual.31 Ag/ Se implantaron electrodos de referencia de AgCl en la corteza rostral contralateral.

Los registros amperométricos se realizaron a 2 Hz aplicando un potencial fijo de más 0.7 V y los datos se digitalizaron (potenciostato FAST-16, Quainton, Nicholasville, KY). Las corrientes de fondo se estabilizaron durante 60 minutos, luego se aplicaron fármacos en el hipocampo utilizando un capilar de vidrio (diámetro de la punta: 15 μm) unido al electrodo. La liberación de ACh provocada por la despolarización se midió aplicando pulsos breves de potasio (KCl 70 mM; 100 NL) o NIC (base libre 1 mM, tartrato de nicotina; 100 NL) a 2 a 10 psi cada 2 minutos. Los registros se equilibraron para la región del hipocampo (dorsal o ventral) y el fármaco (potasio o NIC). Las amplitudes de la señal de colina se midieron por el cambio en la corriente en el canal recubierto con enzimas a partir de la corriente de referencia y se convirtieron en equivalentes de μM de colina según la calibración in vitro. Se adoptó la autorreferencia para eliminar los artefactos mediante la sustracción de las corrientes de los canales centinela.29 La colocación de los microelectrodos se verificó mediante la tinción de Nissl de las secciones coronales del hipocampo (Figura S1). Se usaron promedios de dos respuestas por manipulación de fármaco por animal para el análisis estadístico.

2.8 Análisis estadístico

Las comparaciones estadísticas se realizaron con SPSS (IBM, Armonk, NY) o GraphPad Prism (La Jolla, CA, EE. UU.). Los valores atípicos se determinaron por valores 2 desviaciones estándar por encima de la media. Si se detectó un valor atípico, la información se incluye en la sección de resultados. El criterio de significancia se fijó en=.05. Inicialmente se realizó un análisis estadístico que incluía el sexo como un factor para todos los experimentos que probaron descendencia tanto masculina como femenina. Los análisis colapsaron según el sexo cuando no se detectaron interacciones de tres o dos vías con el sexo (p > 0,05). Los datos se analizaron mediante la prueba t, ANOVA de 1 o 2 vías, según correspondiera. Los efectos principales o de interacción significativos fueron seguidos por comparaciones post hoc de LSD. Los ANOVA de medidas repetidas fueron seguidos por una comparación post hoc de Bonferroni con corrección para comparaciones múltiples. Si se detectaban varianzas desiguales, se utilizaba la prueba t de Welch para varianzas desiguales y los grados de libertad se redondeaban hacia abajo.

2.9 Aislamiento de ARN/ADN

Se sacrificaron ratones F1 adultos (8 semanas de edad; n=3 M y 3 F por grupo) mediante dislocación cervical. Los hipocampos se diseccionaron rápidamente en porciones ventral y dorsal (en una proporción de 1:1), se agruparon de los lados izquierdo y derecho y se congelaron instantáneamente en hielo seco. El ADN y el ARN se coaislaron y purificaron utilizando un AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). La concentración y calidad de ARN y ADN se evaluaron utilizando NanoDrop2000 (NanoDrop, Wilmington, DE) y Agilent Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA). Para las extracciones de ARN, el Número de integridad de ARN (RIN) mínimo fue 8,5.

2.10 Análisis del transcriptoma a través de

Las bibliotecas de secuenciación de ARN fueron preparadas por Huck Institutes of Life Sciences Genomics Core Facility (Penn State University) para lecturas de un solo extremo de 150 pb utilizando el Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina, San Diego, CA) y secuenciado en Illumina HiSeq 2500 en modo de ejecución rápida (tres ejecuciones consecutivas con aproximadamente 10 millones de lecturas por muestra). La calidad de los archivos FASTQ se verificó a través de FASTQC y poseían puntajes de calidad Phred promedio por lectura superiores a 30 (es decir, menos del 0,1 por ciento de error de secuenciación). Los archivos FASTQ se alinearon con un genoma de referencia de ratón (mm10; UCSC Genome Browser) usando TopHat (v2.1.0)32 en Galaxy Project33. Se usaron Cufflinks y Cuffmerge (v2.2.1.0)34 para ensamblar transcripciones de lecturas mapeadas y fusionar archivos de transcripción para el ensamblaje final del transcriptoma. Los valores de P ajustados de la tasa de descubrimiento falso (FDR) se calcularon para la expresión génica diferencial de muestras NIC‐Sired y SAL‐Sired utilizando Cuffdiff (v2.2.1.3),34 con un límite FDR estándar de 0.05.35 Se depositaron conjuntos de datos transcriptómicos a la expresión génica ómnibus.

2.11 Análisis de enriquecimiento

Los genes expresados ​​diferencialmente se analizaron mediante el análisis de vía de ingenio (IPA, ejecutado en diciembre de 2018; www.qiagen.com/ingenuity; Qiagen, Redwood City, CA, EE. UU.)36 para revelar el enriquecimiento potencial de las redes biológicas asociativas. Los parámetros de ejecución especificaron un máximo de 35 moléculas por red de genes y el análisis restringido a líneas celulares o tejidos del SNC de mamíferos. La significación estadística para el enriquecimiento se determinó mediante una prueba exacta de Fisher de cola derecha corregida para pruebas múltiples.

2.12 Secuenciación de bisulfito dirigida

Se utilizó ADN coaislado con ARN (consulte la Sección 2.9) para el análisis de metilación del ADN. RNA-seq identificó 952 y 162 genes expresados ​​diferencialmente en vHPC y DHCP, respectivamente. Los 1010 genes únicos de estas listas combinadas se seleccionaron para el enriquecimiento en bisulfito‐seq utilizando un sistema de enriquecimiento SeqCap Epi personalizado (Roche, Pleasanton, CA, EE. UU.; Tabla S1).38 Bisulfito dirigido la secuenciación se realizó en los Institutos Penn State Huck de la Instalación central de genómica de ciencias de la vida. Las bibliotecas se construyeron utilizando el kit KAPA Hyper Prep (Kapa Biosystems, Wilmington, MA). Las bibliotecas convertidas con bisulfito de sodio se amplificaron mediante PCR y se enriquecieron para regiones genómicas seleccionadas utilizando un conjunto de sondas de captura personalizado (SeqCap Epi Choice Probes; Roche, Pleasanton, CA, EE. UU.). El ADN capturado se secuenció en Illumina HiSeq 2500 utilizando lecturas de extremos emparejados de 100 nt. La calidad de los archivos FASTQ se verificó a través de FASTQC. Las secuencias del adaptador de Illumina se eliminaron y las bases de baja calidad se recortaron con Trimmomatic.39 El recorte de bases de baja calidad se realizó con un enfoque de ventana deslizante, recortando cuando la calidad promedio dentro de una ventana de cuatro pares de bases cayó por debajo de un umbral de 20, con una longitud de lectura mínima de 35. Después de recortar, los archivos FASTQ poseían puntajes de calidad Phred promedio por lectura superiores a 30 (es decir, menos del 0,1 por ciento de error de secuenciación). Las lecturas recortadas se mapearon al genoma de referencia del ratón (mm10) usando Bowtie240 implementado en Bismark.41 Se usó extracto de metilo_dentro de Bismark para extraer información de metilación de CpG y para crear informes de metilación. Se utilizó MethylKit42 para el análisis de regiones diferencialmente metiladas (DMR). El estado de metilación se resumió en ventanas no superpuestas de 500 pares de bases y se realizó un análisis de metilación diferencial, con un FDR estándar de 0,05.35 Los conjuntos de datos se depositaron en Gene Expression Omnibus.

Beneficio del extracto de cistanche

3 RESULTADOS

3.1 La nicotina paterna mejora el condicionamiento del miedo contextual y revierte el aumento agudo de nicotina del condicionamiento del miedo contextual en ratones de generación F1 y F2

Los ratones machos y hembras NIC-Sired y SAL-Sired F1 fueron condicionados por el miedo después de la administración aguda de SAL o NIC (0.09 mg/kg ip, Figura 1A). El análisis completo de la línea de base, pre‐CS y congelación de CS se incluye en la Información de apoyo. Un ANOVA de 3 vías de congelación contextual con el tratamiento del padre, el tratamiento agudo con drogas y el sexo como factores reveló una interacción significativa padre × tratamiento agudo con drogas (F(1,36)=32.75, P < .{{27="" }}01).="" debido="" a="" que="" no="" hubo="" una="" interacción="" significativa="" entre="" el="" sexo="" y="" el="" padre="" o="" el="" tratamiento="" farmacológico="" agudo,="" se="" realizó="" un="" análisis="" de="" varianza="" de="" 2="" vías="" colapsado="" por="" sexo="" y="" reveló="" una="" interacción="" significativa="" entre="" el="" tratamiento="" del="" padre="" y="" el="" tratamiento="" farmacológico="" agudo="" (f(1,40)="20.96" ,="" p="">< 0,001).="" las="" comparaciones="" post="" hoc="" indicaron="" que="" los="" ratones="" nic-sired="" f1="" tratados="" con="" solución="" salina="" exhibieron="" un="" condicionamiento="" de="" miedo="" contextual="" aumentado="" en="" comparación="" con="" los="" ratones="" sal-sired="" f1="" tratados="" con="" solución="" salina="" (t20="2.73," p="">< .05).="" en="" línea="" con="" hallazgos="" previos,43="" la="" nic="" aguda="" a="" 0,09="" mg/kg="" produjo="" un="" condicionamiento="" de="" miedo="" contextual="" mejorado="" en="" ratones="" sal‐sired="" (t22="2.99," p="">< .01).="" sin="" embargo,="" la="" nic="" aguda="" a="" 0,09="" mg/kg="" perjudicó="" el="" condicionamiento="" del="" miedo="" contextual="" en="" ratones="" engendrados="" por="" nic="" (t18="3.36," p="">< .01).="" en="" general,="" los="" niveles="" de="" congelación="" del="" contexto="" en="" los="" ratones="" nic="" engendrados="" por="" nic="" fueron="" comparables="" con="" los="" observados="" en="" los="" ratones="" sal="" engendrados="" por="" sal="" en="" ambos="" 0,09="" mg/kg="" (p=""> 0,05).

Además, se probaron animales machos y hembras NIC- y SAL-Sired en sensibilidad al choque (Figura S2), laberinto en cruz elevado (EPM, Figura S3), campo abierto y paradigmas de reconocimiento de objetos novedosos (Figura S4, consulte la Información de apoyo para conocer los métodos completos). y resultados). Con la excepción de las hembras NIC-Sired en EPM (que mostraron un aumento de los comportamientos similares a la ansiedad) y los animales NIC-Sired en sensibilidad al shock (que mostraron una menor reactividad vocal al shock, lo que no confundiría el fenotipo multigeneracional de aprendizaje de miedo mejorado), no hubo diferencias. se detectaron entre ratones NIC- y SAL-Sired.

FIGURA 1 La nicotina paterna mejora el condicionamiento contextual del miedo y atenúa el realce agudo de nicotina del condicionamiento del miedo. La congelación contextual fue significativamente mayor en NIC‐Sired más SAL en comparación con los controles SAL‐Sired más SAL. La nicotina aguda a 00,09 mg/kg mejoró el condicionamiento del miedo contextual en los animales con padres SAL, pero redujo significativamente el condicionamiento del miedo contextual en los animales con padres NIC (n=10-12 por grupo). B, la congelación contextual fue significativamente mayor en NIC‐abuelo más SAL en comparación con SAL‐abuelo más SAL controles (n=9‐11 por grupo). Las barras de error indican el error estándar de la media (SEM), *P <>

Para determinar si el condicionamiento del miedo contextual deteriorado continuó en la siguiente generación (F2), se cruzaron ratones F2 machos y hembras NIC-abuelo y SAL-abuelo a partir de ratones macho F1 ingenuos. El análisis completo de la línea de base, pre‐CS y congelación de CS se incluye en la Información de apoyo. Se realizó un ANOVA de 3 vías de congelación contextual con tratamiento abuelo, tratamiento farmacológico agudo y sexo como factores independientes (Figura 1B). Debido a que no hubo una interacción significativa entre el sexo y el padre o el tratamiento farmacológico agudo, se realizó un ANOVA colapsado de 2 vías para el sexo. Se encontró un efecto principal significativo del padre (F(1,37)=9.88, P < .01),="" y="" las="" comparaciones="" post="" hoc="" indicaron="" que="" los="" ratones="" abuelos="" nic="" exhibieron="" un="" condicionamiento="" de="" miedo="" contextual="" aumentado="" en="" comparación="" con="" ratones="" sal‐abuelo="" (t39="3.04," p="">< 0.01).="" además,="" los="" ratones="" sal-abuelo="" a="" los="" que="" se="" administró="" nic="" aguda="" mejoraron="" el="" condicionamiento="" del="" miedo="" contextual="" (t19="2.41," p="0.026)," pero="" la="" nic="" aguda="" no="" mejoró="" el="" condicionamiento="" del="" miedo="" contextual="" en="" los="" ratones="">

FIGURA 2 La nicotina paterna mejora el condicionamiento del miedo señalado y la recuperación espontánea de la memoria del miedo. Para examinar los posibles efectos de techo durante las pruebas con claves, una cohorte separada de ratones F1 recibió un entrenamiento idéntico con solo un emparejamiento CS-US. Tanto el condicionamiento del miedo contextual como el estimulado aumentaron en ratones NIC‐Sired en comparación con ratones SAL‐Sired entrenados con 1 emparejamiento CS‐US (n=8‐10 por grupo). B, la exposición paterna a la nicotina no afectó la extinción del miedo contextual pero mejoró la recuperación espontánea de la memoria del miedo 7 días después de la última sesión de extinción (n=8‐10 por grupo). Las barras de error indican el error estándar de la media (SEM), *P <>

3.2 La nicotina paterna mejora el condicionamiento del miedo estimulado en ratones de la generación F1

Para examinar si un efecto de techo impidió la detección de diferencias de grupo para el condicionamiento del miedo con señales (ver Información de apoyo), se entrenó a un grupo separado de ratones F1 con un emparejamiento CS‐US. En esta cohorte, se encontró una mejora del condicionamiento del miedo contextual (t7=3.21, P < .05),="" así="" como="" del="" condicionamiento="" del="" miedo="" con="" señales="" en="" ratones="" nic‐sired="" (t6="2.41," p="">< .="" 05;="" figura="">

3.3 La nicotina paterna mejora la recuperación espontánea de la memoria del miedo contextual en ratones de la generación F1

La cohorte de ratones F1 que recibió un emparejamiento CS-US se probó posteriormente para determinar la extinción y la recuperación espontánea de la memoria del miedo contextual. Los ratones F1 NIC-Sired mostraron una extinción normal del miedo, pero mostraron una recuperación espontánea mejorada de la memoria del miedo contextual en relación con los ratones SAL-Sired (t7=3.38, P <0.05; figura="">

3.4 La nicotina paterna disminuye la autoadministración de nicotina

Antes del entrenamiento para la autoadministración de nicotina, se analizó la capacidad de los sujetos para aprender una tarea operante para obtener una recompensa de alimentos y no se observaron diferencias (Información de apoyo, Figura S5). Para probar los efectos potenciales de la exposición a la nicotina del padre sobre el refuerzo de la nicotina en la descendencia F1, se evaluó la adquisición de la autoadministración de nicotina IV (0.03 mg/kg/infusión) en un ANOVA de diseño mixto de 2 vías, que identificó un efecto principal de la sesión (F(7,119)=13.60, P < .001)="" y="" una="" interacción="" sesión="" ×="" tratamiento="" del="" toro="" (f(7,119)="5.00," p="">< .001).="" sin="" embargo,="" las="" pruebas="" post="" hoc="" no="" revelaron="" diferencias="" estadísticamente="" significativas="" entre="" los="" grupos="" en="" cada="" una="" de="" las="" ocho="" sesiones="" de="" adquisición="" (figura="" 3a).="" luego="" se="" analizó="" el="" número="" de="" presiones="" de="" palanca="" activas="" e="" inactivas="" para="" determinar="" si="" los="" grupos="" mantuvieron="" una="" preferencia="" a="" lo="" largo="" de="" la="" sesión="" por="" la="" palanca="" activa="" durante="" la="" adquisición="" (figura="" 3b),="" lo="" que="" identificó="" un="" efecto="" principal="" de="" la="" sesión="" (f(7,238)="" {{20}="" }.18,="" p="">< .001)="" y="" una="" interacción="" sesión="" ×="" tratamiento="" del="" toro="" (f(21,238)="11.40," p="">< .001).="" el="" análisis="" post="" hoc="" reveló="" que="" los="" grupos="" diferían="" el="" primer="" día="" de="" autoadministración="" de="" nicotina.="" el="" grupo="" nic-sired="" exhibió="" una="" mayor="" presión="" de="" palanca="" activa="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" sal-sired.="" este="" efecto="" puede="" representar="" un="" mayor="" nivel="" de="" comportamiento="" de="" búsqueda="" de="" drogas="" en="" el="" primer="" día="" de="" exposición,="" la="" perseverancia="" de="" responder="" a="" la="" recompensa="" del="" alimento="" y/o="" una="" disminución="" de="" la="" flexibilidad="" cognitiva="" en="" la="" transición="" de="" la="" respuesta="" del="" alimento="" al="" fármaco.="" sin="" embargo,="" esta="" diferencia="" no="" persistió="" en="" sesiones="" posteriores.="" los="" ratones="" sal-sired="" exhibieron="" una="" preferencia="" estadísticamente="" significativa="" consistente="" por="" la="" palanca="" activa="" sobre="" su="" palanca="" inactiva="" (p="" post="" hoc="">< .01),="" pero="" los="" ratones="" nic-sired="" no="" exhibieron="" esta="" preferencia="" mantenida="" por="" las="" sesiones="" 3="" a="">

FIGURA 3 La nicotina paterna reduce la autoadministración de nicotina. Un ratón macho NIC y SAL (n=9-10 por grupo) no difirió en el número total de infusiones obtenidas para cada sesión durante el período de adquisición en el 0 0,03 mg/kg/dosis de infusión. B, durante la adquisición, el número de presiones de palanca activas e inactivas difirió significativamente en la primera sesión, y los ratones NIC‐Sired con nicotina exhibieron una mayor cantidad de presiones activas de palanca en comparación con los ratones SAL‐Sired. Sin embargo, a lo largo de las sesiones posteriores, los ratones NIC‐Sired disminuyeron la respuesta, lo que resultó en diferencias significativas entre su número activo e inactivo de presiones de palanca en las sesiones 3 a 8. En contraste, los animales SAL‐Sired exhibieron una preferencia estadísticamente significativa consistente por la palanca activa. sobre su palanca inactiva. C, el número medio de infusiones de nicotina en las tres últimas sesiones de adquisición no difirió significativamente entre los ratones NIC y SAL. D, A una dosis moderada de 0,1 mg/kg/infusión, los ratones NIC‐Sired se autoadministraron una cantidad significativamente menor de infusiones de nicotina. E, La incubación de la evaluación del ansia reveló un aumento significativo en la respuesta en la palanca previamente activa después de 21 días de abstinencia exclusiva para ratones SAL‐Sired. Las barras de error indican el error estándar de la media (SEM), *P <>

Para examinar más a fondo las posibles diferencias de grupo mientras se controla la variabilidad durante la fase inicial de adquisición, se examinó el número medio de infusiones de nicotina durante las últimas tres sesiones, un momento en el que los sujetos mostraron respuestas más consistentes para la nicotina (Figura 3C). Los grupos no difirieron significativamente en el número medio de infusiones de nicotina (P > .05). A partir de entonces, los ratones pasaron a una dosis de nicotina de 0,1 mg/kg/infusión, que previamente se había demostrado que era la preferida en ratones adultos C57BL6/J.44 A esta dosis, los ratones NIC‐Sired se autoadministraron un número menor de infusiones (t {7}}.20, P < .05;="" figura="" 3d).="" para="" la="" incubación="" del="" comportamiento="" de="" ansia,="" que="" se="" considera="" una="" medida="" del="" aumento="" de="" la="" búsqueda="" de="" drogas="" durante="" la="" abstinencia,="" un="" anova="" de="" diseño="" mixto="" de="" 2="" vías="" con="" sesión="" y="" tratamiento="" con="" toros="" identificó="" el="" efecto="" principal="" de="" la="" sesión="" (f(1,17)="" {{16}="" }.90,="" p="">< .001).="" mientras="" que="" los="" animales="" nacidos="" con="" sal="" exhibieron="" un="" efecto="" de="" incubación="" con="" mayores="" respuestas="" el="" día="" 21="" de="" abstinencia="" en="" comparación="" con="" el="" día="" 1,="" los="" ratones="" nacidos="" con="" nic="" no="" mostraron="" un="" aumento="" en="" el="" comportamiento="" de="" búsqueda="" de="" nicotina="" (p=""><>

3.5 La exposición paterna a la nicotina altera la función y la unión colinérgica del hipocampo

La unión de nAChR heteromérico del hipocampo de alta afinidad se reguló positivamente en ratones NIC-Sired F1 (t28=2.14, P < .05;="" sal-sired="1.21" ±="" {{10}="" }.043,="" nic‐engendrado="1.34" ±="" 0.044).="" se="" eliminó="" un="" sujeto="" (nic‐sired)="" porque="" los="" valores="" de="" unión="" estaban="" dos="" desviaciones="" estándar="" por="" encima="" de="" la="">

Los registros amperométricos de las corrientes de ACh evocadas por potasio y nicotina se evaluaron en F1 dHPC y vHPC. Debido a los tamaños de muestra desiguales por sexo, el sexo no se incluyó como un factor preliminar en estos análisis. Las señales colinérgicas provocadas por la despolarización de KCl no difirieron entre los ratones SAL y NIC engendrados en dHPC (P > 0,05; Figura 4A); sin embargo, la aplicación local de nicotina resultó en una reducción significativa en las amplitudes de la señal colinérgica en ratones NIC‐Sired (t8=2.33, P < .05;="" figura="" 4c).="" en="" vhpc,="" la="" liberación="" de="" ach="" disminuyó="" en="" ratones="" nic‐sired="" luego="" de="" la="" aplicación="" de="" kcl="" (t8="2.60," p="">< .05;="" figura="" 4b)="" o="" nicotina="" (t8="2.98," p="">< .05="" ;="" figura="">

FIGURA 4 La nicotina paterna reduce la señalización colinérgica en el hipocampo. Señales de colina de una población de dHPC evocadas por la despolarización terminal inducida por KCl. No se detectaron diferencias significativas entre los animales NIC‐ y SAL‐Sired (n=5 por grupo). B, las señales de colina de la población de vHPC evocadas por la despolarización terminal inducida por KCl se redujeron en ratones NIC-Sired. C, Las señales de colina dHPC de la población provocada por la nicotina se redujeron en ratones NIC-Sired. D, Las señales de colina vHPC de la población provocada por la nicotina se redujeron en ratones NIC-Sired. No se observaron efectos del sexo sobre la señalización colinérgica. Las barras de error indican el error estándar de la media (SEM), *P <>

3.6 La exposición paterna a la nicotina altera diferencialmente la expresión génica del hipocampo dorsal y ventral

El análisis del transcriptoma del hipocampo F1 mediante secuenciación de ARN reveló 952 genes expresados ​​​​diferencialmente en vHPC (FDR=0 .05; Tabla S2). De estos genes, 612 estaban regulados a la baja y 340 estaban regulados al alza en ratones NIC‐Sired. En dHPC, solo 162 genes se expresaron diferencialmente en ratones NIC‐Sired en comparación con ratones SAL‐Sired (FDR=0.05). De estos 162 genes, 86 estaban regulados a la baja y 76 estaban regulados al alza. Ciento tres genes con expresión génica alterada se superpusieron entre vHPC y dHPC.

3.7 La exposición paterna a la nicotina altera las vías transcripcionales involucradas en el desarrollo del sistema nervioso

En vHPC, el análisis IPA identificó la red superior "Enfermedad neurológica, lesiones y anomalías de organismos, muerte celular y supervivencia" (puntuación=41, Tabla S3) y la segunda red superior "Desarrollo y función del sistema nervioso, morfología tisular, neurología". Enfermedad" (puntuación=23). Las cinco principales categorías de funciones moleculares y celulares fueron: "Morfología celular" (88 moléculas), "Ensamblaje y organización celular" (79 moléculas), "Desarrollo celular" (96 moléculas), "Función y mantenimiento celular" (79 moléculas), y "Crecimiento y proliferación celular" (87 moléculas). Los principales Desarrollo y función del sistema fisiológico fueron "Desarrollo y función del sistema nervioso" (175 moléculas), y algunas de las funciones principales de Enfermedades y trastornos incluyen "Enfermedad neurológica" (segundo, 191 moléculas) y "Trastornos psicológicos" (cuarto, 90 moléculas). ) (Cuadro S4).

Complementario a los resultados de IPA, el análisis de enriquecimiento con Enrichr proporcionó más evidencia de alteraciones en el crecimiento y desarrollo celular en vHPC, con los principales términos biológicos de GO que incluyen "empalme de ARN", "respuesta a la proteína desplegada" y "regulación del crecimiento celular" y " estabilización de proteínas" (Tabla S5). En consecuencia, "complejo spliceosomal" se identificó como un término celular superior GO. El análisis de la vía KEGG a través de Enrichr también señaló el funcionamiento del spliceosoma y la señalización de MAPK como vías potencialmente afectadas.

A pesar de una lista considerablemente más corta de genes expresados ​​diferencialmente en dHPC en comparación con vHPC, se identificaron vías y términos similares enriquecidos con dHPC (Tablas S3 y S4). El análisis IPA identificó la red superior "Comportamiento, enfermedad neurológica, lesiones y anomalías orgánicas" (puntuación=24) y la segunda red superior "Enfermedad neurológica, lesiones y anomalías orgánicas y trastornos psicológicos (puntuación=20) .

Las cinco categorías principales de funciones moleculares y celulares en dHPC fueron "Desarrollo celular" (29 moléculas), "Crecimiento y proliferación celular" (29 moléculas), "Morfología celular" (27 moléculas), "Ensamblaje y organización celular" (23 moléculas) , y "Función y mantenimiento celular" (25 moléculas). "Desarrollo y función del sistema nervioso" se identificó nuevamente como un término enriquecido superior en la clasificación de Desarrollo y función del sistema fisiológico (segundo, 44 ​​moléculas). Los términos más enriquecidos en la clasificación de Función de enfermedades y trastornos incluyeron "Enfermedad neurológica" (primero, 51 moléculas) y "Trastornos psicológicos" (quinto, 31 moléculas). El análisis de enriquecimiento con Enrichr identificó múltiples términos biológicos GO diferentes para dHPC en comparación con vHPC, incluida la "regulación de la muerte neuronal" y el "desarrollo cerebral" (Tabla S5), que es complementario a la función celular y molecular IPA "Muerte celular y supervivencia".

Para explorar más a fondo el papel funcional de las transcripciones expresadas diferencialmente que se superponen entre dHPC y vHPC, se evaluaron genes expresados ​​diferencialmente comunes a ambas regiones (103 en total). Las transcripciones expresadas diferencialmente superpuestas entre las dos regiones estaban todas reguladas a la baja o al alza en la misma dirección, lo que sugiere alteraciones comunes en las vías transcripcionales en las regiones del cerebro en ratones engendrados por NIC. Las cinco principales categorías de funciones moleculares y celulares identificadas por IPA fueron "Muerte celular y supervivencia" (17 moléculas), "Movimiento celular" (10 moléculas), "Señalización e interacción de célula a célula" (17 moléculas), "Crecimiento celular y proliferación" (18 moléculas) y "Morfología celular" (17 moléculas) (Tabla S4)

Los genes expresados ​​​​diferencialmente exclusivos de dHPC y vHPC se analizaron posteriormente por separado en IPA para evaluar las adaptaciones neurobiológicas divergentes entre las dos regiones (Tabla S6). No se superpusieron rutas canónicas enriquecidas entre los análisis de dHPC exclusivos de vHPC únicos. Las principales vías canónicas enriquecidas exclusivas de vHPC (44 en total) incluyeron "Señalización de calcio" y "Señalización del receptor de glucocorticoides", mientras que las principales vías canónicas de dHPC (ocho en total) incluyeron "Metabolismo de la hormona tiroidea" y "Señalización de apoptosis mediada por ácido retinoico". Las enfermedades y funciones enriquecidas exclusivas de vHPC (295 en total) incluyeron "Formación de [hipocampo] Cuerno de Amón" y "Cantidad de protuberancias celulares", mientras que los términos de enfermedades y funciones enriquecidos de forma única con dHPC (111 en total) incluyeron "Inflamación de la sustancia blanca" y "Desmielinización ."

3.8 La exposición paterna a la nicotina altera la metilación del ADN del hipocampo

Se realizó un análisis de metilación del ADN dirigido para determinar si la metilación del ADN alterada en las regiones reguladoras correspondientes representaba la expresión génica diferencial en la descendencia NIC-Sired F1. Los objetivos incluyeron 1114 genes expresados ​​diferencialmente identificados en dHPC o vHPC. En vHPC, se detectaron 11 regiones diferencialmente metiladas (DMR), con ocho mostrando aumento de metilación y tres mostrando disminución de metilación (Tabla 1). De los 11 DMR, 10 estaban ubicados en regiones asociadas con un gen que exhibía una expresión alterada en vHPC. En el dHPC, se detectaron 30 DMR, 15 mostraron un aumento de la metilación y 15 mostraron una disminución de la metilación. De los 30 DMR, 29 estaban ubicados en regiones asociadas con un gen que exhibía una expresión alterada en dHPC.

benefit de cistanche echinacoside

4. DISCUSIÓN

Una mayor comprensión de los procesos epigenéticos junto con datos recientes, incluidos los presentes hallazgos, ha desafiado la comprensión tradicional de la herencia. Los factores más allá del genotipo solo pueden determinar los fenotipos en las generaciones posteriores, y es posible que las exposiciones dentro de una generación no se secuestren de la progenie. El presente estudio sugiere que los efectos perjudiciales para la salud de la exposición a la nicotina pueden trascender la exposición individual y afectar a las generaciones posteriores. Identificamos los efectos multigeneracionales y transgeneracionales de la exposición paterna a la nicotina antes de la concepción en ratones C57BL/6J en el condicionamiento del miedo pavloviano, lo que resultó en recuerdos de miedo más fuertes en la progenie F1 y F2. La exposición paterna a la nicotina también resultó en una disminución de la autoadministración de nicotina y comportamientos relacionados con recaídas atenuados, lo que sugiere una mayor respuesta aversiva a la nicotina. En apoyo de estas diferencias de comportamiento, se observaron alteraciones multigeneracionales en la función colinérgica del hipocampo y los procesos epigenéticos. Juntos, estos resultados apuntan a cambios en la función del sistema nervioso en la descendencia de ratones expuestos a la nicotina que dan como resultado fenotipos conductuales alterados.

Las crías F1 y F2 de ratones macho expuestos a la nicotina exhibieron un condicionamiento de miedo contextual y con señales mejorado. A pesar de que no hubo diferencias en la extinción del miedo contextual entre los ratones NIC- y SAL-Sired F1, los ratones NIC-Sired mostraron una mayor recuperación espontánea de los recuerdos contextuales del miedo. Es importante destacar que no se encontraron diferencias en la sensibilidad a las descargas entre los ratones NIC y SAL que podrían explicar el aumento del condicionamiento del miedo. El condicionamiento del miedo mejorado puede sugerir una mejora generalizada de los procesos de aprendizaje en oposición a la modulación de procesos más específicos del miedo a aprender. Sin embargo, no se observaron cambios en el reconocimiento de objetos novedosos, el entrenamiento de alimentos operante o la locomoción de campo abierto en ratones NIC-Sired, aunque se identificó un efecto específico del sexo del aumento del tiempo de brazo abierto de EPM en ratones hembra NIC-Sired. Si bien esto no descarta posibles modificaciones a otros sistemas de aprendizaje o procesos cognitivos, estos hallazgos en conjunto sugieren que el aprendizaje del miedo puede ser más sensible a los efectos multigeneracionales y transgeneracionales de la exposición paterna a la nicotina. Además, estos hallazgos sugieren una función colinérgica alterada en animales NIC‐Sired. La nicotina modula el condicionamiento del miedo contextual. Mientras que la nicotina aguda mejora el condicionamiento del miedo contextual,15,45 la abstinencia de la nicotina crónica interrumpe el condicionamiento del miedo contextual.16,21 En el presente estudio, la nicotina aguda mejoró el condicionamiento del miedo contextual en ratones F1 y F2 de ratones tratados con solución salina. En contraste, la nicotina aguda interrumpió el condicionamiento del miedo contextual en ratones NIC‐Sired y no tuvo ningún efecto en los ratones NIC‐grandsire, lo que puede indicar un funcionamiento colinérgico alterado en el hipocampo.

Los efectos de la exposición paterna a la nicotina sobre la autoadministración posterior de nicotina en la generación F1 también apuntan a una función colinérgica alterada. Durante la adquisición de la autoadministración de nicotina IV en la dosis más baja, los grupos no difirieron en el número de infusiones de nicotina, aunque se encontró un aumento en el número de presiones de palanca activas en el grupo NIC‐Sired. Esto sugiere que los ratones NIC‐Sired pueden haber exhibido perseverancia al responder a la recompensa del alimento y/o disminución de la flexibilidad cognitiva en la transición de la respuesta del alimento al fármaco. Sin embargo, también vale la pena señalar que los grupos no difirieron en el día 1 de la incubación del ansia, que representa una sesión de extinción (p. ej., sin infusiones de nicotina durante la sesión), y por lo tanto, este efecto parece haber estado presente cuando los reforzadores son administrados. cambiado pero no en ausencia de un reforzador durante una sesión de extinción. Los ratones NIC‐Sired también exhibieron una disminución de la autoadministración de nicotina en la dosis moderada, lo que se alinea con un trabajo reciente que identifica disminuciones en la administración de alcohol, cocaína y opioides asociadas con la exposición de los padres al alcohol, la cocaína y la morfina (por ejemplo, Vassoler et al, 46 como revisado en Goldberg y Gould47). La reducción observada en la autoadministración de nicotina se puede atribuir a la disminución de la sensibilidad a los efectos gratificantes de la nicotina o al aumento de la sensibilidad a los efectos aversivos de la nicotina. De hecho, los grupos diferían en la dosis moderada de nicotina pero no en la dosis más baja de nicotina, lo que respalda la noción de una mayor respuesta aversiva con la dosis más alta. Curiosamente, también encontramos una falta de incubación del ansia el día 21 en ratones NIC‐Sired luego de la autoadministración en la dosis moderada, lo que sugiere que la disminución de los comportamientos de búsqueda de nicotina podría estar relacionada con una memoria asociada a la aversión a la nicotina. Aunque varios sustratos neurales pueden ser la base de estos efectos sobre la ingesta de nicotina y la respuesta relacionada con la recaída, un estudio reciente encontró que la disminución de la ADN metiltransferasa en la región CA1 del hipocampo redujo la autoadministración de morfina.48 Este hallazgo, junto con la función conocida de la función hipocampal colinérgica en procesos de aprendizaje y memoria, respalda aún más la noción de procesamiento mediado por nicotina interrumpido en el hipocampo de ratones NIC-Sired.

En este sentido, los ratones NIC-Sired exhibieron una mayor unión de nAChR de alta afinidad en el hipocampo. También encontramos reducciones en la liberación de ACh provocada por potasio en vHPC, así como en la liberación de ACh provocada por nicotina en dHPC y vHPC de animales NIC‐Sired. Los cambios en la liberación de ACh provocados por la despolarización reflejan una función colinérgica alterada aguas abajo de la unión del receptor, mientras que los cambios en la liberación de ACh provocados por la nicotina reflejan una función alterada de nAChR. Estos datos están en línea con hallazgos previos de unión de nAChR de alta afinidad regulada al alza después de una función de nAChR disminuida. los efectos multigeneracionales de la exposición paterna a la nicotina. Se sabe que la DHPC modula el condicionamiento del miedo contextual.31,50 La inhibición de vHPC interrumpe tanto el condicionamiento del miedo con claves como el contextual51,52 y las lesiones colinérgicas de vHPC alteran el condicionamiento del miedo con claves.53

Cistanche de hierbas

También hemos demostrado que la infusión directa de nicotina en dHPC mejora el condicionamiento contextual del miedo, mientras que la infusión en vHPC interrumpe el condicionamiento contextual del miedo.15 La vHPC también puede modular la recuperación espontánea de los recuerdos contextuales del miedo, ya que la inactivación del circuito prelímbico de vHPC disminuye la recuperación espontánea de los recuerdos contextuales del miedo. 54 Si bien otras regiones del cerebro involucradas en el condicionamiento del miedo, como la amígdala, 55 también pueden verse afectadas por la exposición paterna a la nicotina, estos hallazgos, junto con los datos actuales, sugieren que los cambios en la función vHPC pueden ser responsables del condicionamiento del miedo alterado en ratones NIC‐Sired . Presumimos que los efectos multigeneracionales de la exposición paterna a la nicotina pueden estar relacionados con cambios en los efectores transcripcionales que actúan aguas arriba de estos sistemas neuronales. La secuenciación transcripcional de todo el genoma en vHPC y dHPC de ratones de la generación F1 identificó 1114 genes expresados ​​​​diferencialmente entre ratones NIC y SAL. Esta diferencia fue mayor en vHPC (952) frente a dHPC (162), en consonancia con el mayor cambio en vHPC en relación con la función colinérgica de dHPC y alteraciones en el condicionamiento del miedo contextual y con señales. El análisis posterior de la vía sugirió amplias alteraciones en las vías transcripcionales asociadas con la señalización de glucocorticoides y el desarrollo/plasticidad neural en ambas regiones del hipocampo.

Con el fin de identificar posibles adaptaciones específicas de vHPC, se realizó un análisis de vías utilizando solo transcripciones específicas de cualquiera de las subregiones del hipocampo. No se superpusieron vías canónicas IPA enriquecidas entre vHPC y dHPC, que son subregiones funcionalmente distintas del hipocampo. , alteración adicional del funcionamiento de los glucocorticoides en esta región en comparación con dHPC. Con el objetivo de identificar los reguladores epigenéticos aguas arriba que pueden actuar sobre la expresión génica, realizamos una secuenciación de metilación de ADN dirigida utilizando la lista compilada de genes expresados ​​​​diferencialmente de dHPC y vHPC identificados a partir de la secuenciación de ARN. Sorprendentemente, encontramos solo 11 DMR en vHPC y 30 DMR en dHPC entre animales NIC y SAL. Aunque esto es inesperado dado el número mucho mayor de transcritos expresados ​​diferencialmente en vHPC, la metilación del ADN es solo uno de varios factores reguladores que pueden afectar la expresión génica y la metilación del ADN no se traduce consistentemente en una expresión génica alterada.56 De los 11 DMR de vHPC, siete exhibieron patrones de metilación consistentes con la dirección de la transcripción diferencial (disminución de la transcripción con aumento de la metilación del ADN y aumento de la transcripción con metilación reducida). Los genes metilados diferencialmente en el vHPC incluían Fkbp5, Ksr1 y Pnpla2. Curiosamente, la transcripción de Fkbp5 y Ksr1 se vio interrumpida en un modelo de comportamiento de ratón con TEPT,57 en el que los ratones se expusieron a una descarga eléctrica en las patas y luego se les presentaron recordatorios situacionales. Fkbp5 codifica una chaperona receptora de glucocorticoides cuyo funcionamiento se ha asociado con una respuesta de estrés prolongada desadaptativa en personas con TEPT y otros trastornos de ansiedad.58

Específicamente, los estudios en humanos muestran que la metilación y la transcripción de Fkbp5 se correlacionan con la gravedad de los síntomas del TEPT, de modo que el aumento de la metilación y la disminución de la transcripción predicen una sintomatología de TEPT más grave.59,60 La expresión de Fkbp5 modula el funcionamiento del eje HPA, que se cree que media su participación en PTSD.59,61 Nuestro hallazgo de una mayor recuperación espontánea de la memoria del miedo junto con la desregulación de las vías transcripcionales asociadas con la señalización de glucocorticoides en animales NIC‐Sired puede apuntar a una mayor vulnerabilidad a los fenotipos similares al PTSD. En dHPC, los patrones de DMR fueron en gran medida inconsistentes con la dirección de la expresión de transcripción diferencial encontrada por la secuenciación de ARN, lo que sugiere que los cambios en la metilación del ADN de vHPC producidos por la exposición paterna a la nicotina son más importantes en términos de impacto en la expresión génica que aquellos en dHPC. Esto está en consonancia con nuestra identificación de un mayor número de transcritos expresados ​​diferencialmente y cambios más exagerados en la transmisión colinérgica en vHPC NIC‐Sired en comparación con dHPC. Nuestro enfoque de secuenciación dirigida puede haber limitado la capacidad de detectar una posible regulación transcripcional por secuencias metiladas distalmente. Las investigaciones futuras, incluido el análisis de la metilación del ADN en todo el genoma, las modificaciones de las histonas y la expresión del ARN pequeño, proporcionarán una interpretación más completa de estos hallazgos.

Una limitación potencial de nuestro diseño de exposición a la nicotina es el enfoque en la exposición paterna a la nicotina para investigar el impacto multigeneracional y transgeneracional de la exposición a la nicotina. Aunque otros estudios que encontraron fenotipos multi/transgeneracionales luego de la exposición paterna a drogas, incluyendo cocaína46 y morfina,62 no encontraron diferencias en el cuidado materno, es posible que la exposición paterna a la nicotina pueda afectar el cuidado materno. Se justifican estudios futuros que investiguen el impacto en la atención materna. Como nuestro enfoque actual estaba en la exposición paterna, el trabajo futuro también debería comparar los impactos de la exposición paterna frente a la materna. En general, los presentes hallazgos brindan una comprensión novedosa de los efectos multigeneracionales y transgeneracionales de la exposición a la nicotina, que están respaldados por una creciente literatura que caracteriza los efectos multigeneracionales y transgeneracionales de la exposición a las drogas (como se revisa en Goldberg y Gould47). Este estudio fue el primero en evaluar el condicionamiento del miedo contextual en descendientes F1 y F2 de varones expuestos a la nicotina e identificó una mayor formación de memoria del miedo y recuperación espontánea de los recuerdos del miedo. Este estudio también fue el primero en identificar la autoadministración de nicotina alterada y la incubación del ansia en los hijos F1 expuestos a la nicotina.

En ratones NIC-Sired, se encontró metilación diferencial en genes asociados con el TEPT y la desregulación del eje HPA, así como interrupciones simultáneas en las vías transcripcionales relacionadas con el estrés. La nicotina paterna también se asoció con una disminución de la función colinérgica del hipocampo y un aumento de la unión de nAChR al hipocampo. Curiosamente, los pacientes con TEPT que no fumaban muestran una unión de nAChR de alta afinidad cortical mesiotemporal significativamente más alta63, y el TEPT se asocia con un mayor condicionamiento del miedo y una recuperación espontánea de los recuerdos del miedo extinguidos.64 Juntos, nuestros hallazgos sugieren que la exposición a la nicotina puede tener un impacto multigeneracional de aumentar la susceptibilidad de los hijos a la sintomatología similar al TEPT. Este hallazgo, junto con otros hallazgos recientes que muestran los efectos multigeneracionales de la exposición a la nicotina en la flexibilidad cognitiva2, sugiere que los resultados negativos para la salud de la exposición a la nicotina arrojan una red más amplia de lo que se pensaba anteriormente.

extracto de cistanche

REFERENCIAS

1 Dai J, Wang Z, Xu W, et al. La exposición paterna a la nicotina define un comportamiento diferente en la generación posterior a través de la hipermetilación de mmu-miR-15b. Sci Rep. 2017;7(1):7286.

2. McCarthy DM, Morgan TJ Jr, Lowe SE, et al. La exposición a la nicotina de ratones machos produce un deterioro del comportamiento en múltiples generaciones de descendientes. PLoS Biol. 2018;16(10):e2006497.

3. Zhu J, Lee KP, Spencer TJ, Biederman J, Bhide PG. Transmisión transgeneracional de hiperactividad en un modelo de ratón con TDAH. J Neurosci. 2014;34(8):2768‐2773.

4. Cummings KM, Proctor RN. La imagen pública cambiante del tabaquismo en los Estados Unidos: 1964‐2014. Biomarcadores de Epidemiol de Cáncer Prev. 2014;23(1):32‐36.

5. Huang LL, Kowitt SD, Sutfin EL, Patel T, Ranney LM, Goldstein AO. Uso de cigarrillos electrónicos entre estudiantes de secundaria y su asociación con el uso de cigarrillos y el abandono del hábito de fumar, Encuestas sobre el tabaco en jóvenes de Carolina del Norte, 2011 y 2013. Prev Chronic Dis. 2016;13:E103.

6. Holliday ED, Nucero P, Kutlu MG, et al. Efectos a largo plazo de la nicotina crónica sobre los comportamientos emocionales y cognitivos y la morfología de las células del hipocampo en ratones: comparaciones de la exposición a la nicotina en adultos y adolescentes. Eur J Neurosci. 2016;44:2818‐2828.

7. Johnson JG, Cohen P, Pine DS, Klein DF, Kasen S, Brook JS. Asociación entre el tabaquismo y los trastornos de ansiedad durante la adolescencia y la adultez temprana. JAMA. 2000;284:2348-2351.

8. Jung Y, Hsieh LS, Lee AM, et al. Un mecanismo epigenético media los efectos de la nicotina en el desarrollo sobre la estructura y el comportamiento neuronal. Nat Neurosci. 2016;19(7):905‐914.

9. Gitik M, Holliday ED, Leung M, et al. La colina mejora los déficits de aprendizaje de los adultos y revierte la modificación epigenética de los factores de remodelación de la cromatina relacionados con la exposición a la nicotina en los adolescentes. Neurobiol Aprender Mem. 2018;155:239‐248.

10. Ave A. Percepciones de la epigenética. Naturaleza. 2007;447:396‐398.

11. Skinner MK. Herencia transgeneracional epigenética ambiental y estabilidad mitótica epigenética somática. Epigenética. 2011;6:838‐842.

12. Davis JA, Gould TJ. Aprendizaje asociativo, el hipocampo y la adicción a la nicotina. Curr Drug Abuse Rev. 2008;1:9‐19.

13. Kutlu MG, Parikh V, Gould TJ. Adicción a la nicotina y trastornos psiquiátricos. Int Rev Neurobiol. 2015;124:171‐208.

14. Parikh V, Kutlu MG, Gould TJ. La disfunción de nAChR como sustrato común para la esquizofrenia y la adicción a la nicotina comórbida: tendencias y perspectivas actuales. Esquizofre Res. 2016;171:1‐15.

15. Kenney JW, Raybuck JD, Gould TJ. Los receptores nicotínicos en el hipocampo dorsal y ventral modulan diferencialmente el condicionamiento del miedo contextual. Hipocampo. 2012;22:1681‐1690.

16. Wilkinson DS, Turner JR, Blendy JA, Gould TJ. Los antecedentes genéticos influyen en los efectos de la abstinencia de la nicotina crónica sobre el aprendizaje y la unión del receptor nicotínico de acetilcolina de alta afinidad en el hipocampo dorsal y ventral. Psicofarmacología (Berl). 2013;225(1): 201‐208.

17. Davis JA, Gould TJ. Los efectos de DHBE y MLA en la mejora inducida por nicotina del condicionamiento del miedo contextual en ratones C57BL/6. Psicofarmacología (Berl). 2006;184:345‐352.

18. Kutlu MG, Zeid D, Tumolo JM, Gould TJ. Los ratones preadolescentes y adolescentes son menos sensibles a los efectos de la nicotina aguda sobre la extinción y la recuperación espontánea. Cerebro Res Bull. 2018;138:50‐55.

19. Kutlu MG, Gould TJ. La nicotina aguda retrasa la extinción del miedo contextual en ratones. Comportamiento Cerebro Res. 2014;263:133‐137.

20. Benowitz NL, Hukkanen J, Jacob P 3. Química, metabolismo, cinética y biomarcadores de la nicotina. En: Psicofarmacología de la nicotina. Berlín, Heidelberg: Springer; 2009: 29‐60.

21. Davis JA, James JR, Siegel SJ, Gould TJ. La abstinencia de la administración crónica de nicotina altera el condicionamiento del miedo contextual en ratones C57BL/6. J Neurosci. 2005;25:8708‐8713.

22. Petersen DR, Norris KJ, Thompson JA. Un estudio comparativo de la disposición de la nicotina y sus metabolitos en tres cepas endogámicas de ratones. Eliminación de metab de drogas. 1984; 12:725-731.

23. Gould TJ, Portugal GS, Andre JM, et al. La duración de los déficits asociados con la abstinencia de nicotina en el condicionamiento contextual del miedo es paralela a los cambios en la regulación positiva del receptor nicotínico de acetilcolina de alta afinidad del hipocampo. Neurofarmacología. 2012;62:2118‐2125.

24. Kutlu MG, Oliver C, Huang P, Liu-Chen LY, Gould TJ. El deterioro de la extinción del miedo contextual por la nicotina crónica y la abstinencia de la nicotina crónica se asocia con la regulación positiva de nAChR del hipocampo. Neurofarmacología. 2016;109:341‐348. 25. Damaj MI, Kao W, Martin BR. Caracterización de la abstinencia de nicotina espontánea y precipitada en el ratón. J Pharmacol Exp Ther. 2003;307:526‐534.

26. Fowler CD, Lu Q, Johnson PM, Marks MJ, Kenny PJ. La señalización de la subunidad del receptor nicotínico alfa5 habenular controla la ingesta de nicotina. Naturaleza. 2011;471:597‐601.

27. Lomazzo E, MacArthur L, Yasuda RP, Wolfe BB, Kellar KJ. Análisis cuantitativo de los receptores nicotínicos neuronales heteroméricos en el hipocampo de rata. J Neurochem. 2010;115:625‐634.

28. Turner JR, Castellano LM, Blendy JA. Efectos paralelos de tipo ansiolítico y regulación positiva de los receptores de acetilcolina nicotínicos neuronales después de la nicotina crónica y la vareniclina. Nicotina Tob Res. 2011;13:41‐46.

29. Parikh V, Ji J, Decker MW, Starter M. Los receptores de acetilcolina nicotínicos que contienen la subunidad beta2 prefrontal y alfa7 controlan diferencialmente la señalización glutamatérgica y colinérgica. J Neurosci. 2010;30: 3518‐3530.

30. Parikh V, Starter M. Sistemas colinérgicos y cognición del cerebro anterior: nuevos conocimientos basados ​​en la detección rápida de picos de colina mediante biosensores basados ​​en enzimas. En: Biosensores de microelectrodos. Totowa, Nueva Jersey: Humana Press; 2013:257-277.

31. Fanselow MS, Dong HW. ¿Son los hipocampos dorsal y ventral estructuras funcionalmente distintas? Neurona. 2010;65(1):7‐19.

32. Kim D, Pertea G, Trapnell C, Pimentel H, Kelley R, Salzberg SL. TopHat2: alineación precisa de transcriptomas en presencia de inserciones, deleciones y fusiones de genes. Genoma Biol. 2013;14(4): R36.

33. Afgan E, Baker D, van den Beek M, et al. La plataforma Galaxy para análisis biomédicos accesibles, reproducibles y colaborativos: actualización de 2016. Ácidos Nucleicos Res. 2016;44:W3‐w10.

34. Trapnell C, Williams BA, Pertea G, et al. El ensamblaje y la cuantificación de transcripciones por RNA-Seq revelan transcripciones no anotadas y cambios de isoformas durante la diferenciación celular. Nat Biotechnol. 2010;28(5): 511‐515.

35. Benjamini Y, Drai D, Elmer G, Kafkafi N, Golani I. Control de la tasa de descubrimiento falso en la investigación de la genética del comportamiento. Comportamiento Cerebro Res. 2001; 125(1‐2):279‐284.

36. Kramer A, Green J, Pollard J Jr, Tugendreich S. Enfoques de análisis causal en Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformática. 2014;30(4): 523‐530.

37. Kuleshov MV, Jones MR, Rouillard AD, et al. Enrichr: una actualización integral del servidor web de análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes 2016. Ácidos Nucleicos Res. 2016;44(W1): W90‐W97.

38. Wendt J, Rosenbaum H, Richmond TA, Jeddeloh JA, Burgess DL. Secuenciación de bisulfito dirigida utilizando el sistema de enriquecimiento epi SeqCap. Métodos Mol Biol. 2018;1708:383‐405.

39. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: un recortador flexible para datos de secuencia de Illumina. Bioinformática. 2014;30(15):2114‐2120.

40. Langmead B, Salzberg SL. Alineación rápida de lectura con intervalos con Bowtie 2. Métodos naturales. 2012;9(4):357‐359.

41. Krueger F., Andrews SR. Bismark: un alineador flexible y llamador de metilación para aplicaciones de bisulfito‐Seq. Bioinformática. 2011;27(11):1571‐1572.

42. Akalin A, Kormaksson M, Li S, et al. methylKit: un paquete completo de R para el análisis de perfiles de metilación de ADN en todo el genoma. Genoma Biol. 2012;13(10): R87.

43. Gould TJ, Lommock JA. La nicotina mejora el condicionamiento del miedo contextual y mejora los déficits inducidos por el etanol en el condicionamiento del miedo contextual. Comportamiento Neurosci. 2003;117(6):1276‐1282.

44. CD de Fowler, Kenny PJ. Autoadministración de nicotina intravenosa y restablecimiento inducido por señal en ratones: efectos de la dosis de nicotina, velocidad de infusión del fármaco y entrenamiento instrumental previo. Neurofarmacología. 2011;61(4):687‐698.

45. Gould TJ, Wehner JM. Mejora con nicotina del condicionamiento del miedo contextual. Comportamiento Cerebro Res. 1999;102(1‐2):31‐39.

46. ​​Vassoler FM, White SL, Schmidt HD, Sadri‐Vakili G, Pierce RC. Herencia epigenética de un fenotipo de resistencia a la cocaína. Nat Neurosci. 2013;16(1):42‐47.

47. Goldberg LR, Gould TJ. Efectos multigeneracionales y transgeneracionales de la exposición paterna a las drogas de abuso en la función conductual y neural. Eur J Neurosci. 2018;50(3):2453‐2466.

48. Zhang JJ, Jiang FZ, Zheng W, et al. DNMT3a en el hipocampo CA1 es crucial en la adquisición de la autoadministración de morfina en ratas. Adicto Biol. 2019;▪:▪‐▪.

49. Schwartz RD, Kellar KJ. Sitios de unión del receptor colinérgico nicotínico en el cerebro: regulación in vivo. Ciencias. 1983;220(4593):214‐216.

50. Logue SF, Paylor R, Wehner JM. Las lesiones del hipocampo causan déficits de aprendizaje en ratones endogámicos en el laberinto de agua de Morris y la tarea de miedo condicionado. Comportamiento Neurosci. 1997;111(1):104‐113.

51. Zhang WN, Bast T, Feldon J. El hipocampo ventral y el condicionamiento del miedo en ratas: diferentes amnesias anterógradas del miedo después de la infusión de N-metil-D-aspartato o su antagonista no competitivo MK-801 en el hipocampo ventral. Comportamiento Cerebro Res. 2001;126(1‐2):159‐174.

52. Maren S., Holt WG. Hipocampo y condicionamiento del miedo pavloviano en ratas: las infusiones de muscimol en el hipocampo ventral, pero no en el dorsal, perjudican la adquisición de la congelación condicional a un estímulo auditivo condicional. Comportamiento Neurosci. 2004;118(1):97‐110.

53. Staib JM, Della Valle R, Knox DK. La interrupción del tabique medial y las bandas diagonales de las proyecciones colinérgicas de Broca al hipocampo ventral interrumpen la memoria del miedo auditivo. Neurobiol Aprender Mem. 2018;152:71‐79.

54. Vasquez JH, Leong KC, Gagliardi CM, Harland B, Apicella AJ, Muzzio IA. La activación específica de la vía de las células hipocampales ventrales que se proyectan a la corteza prelímbica disminuye la renovación del miedo. Neurobiol Aprender Mem. 2019;161:63‐71.

55. LeDoux JE, Cicchetti P, Xagoraris A, Romanski LM. El núcleo amigdalino lateral: la interfaz sensorial de la amígdala en el condicionamiento del miedo. J Neurosci. 1990;10(4):1062‐1069.

56. Jones PA. Funciones de la metilación del ADN: islas, sitios de inicio, cuerpos genéticos y más. Nat Rev. Genet. 2012;13(7):484‐492.

57. Tanaka M, Li H, Zhang X, et al. Regulación génica dependiente de la región y el tiempo en la amígdala y la corteza cingulada anterior de un modelo de ratón similar al TEPT. Cerebro Mol. 2019;12(1):25.

58. Aglutinante EB. El papel de FKBP5, una coacompañante del receptor de glucocorticoides en la patogénesis y la terapia de los trastornos afectivos y de ansiedad. Psiconeuroendocrinología. 2009;34(Suplemento 1): S186‐S195.

59. Sarapis C, Cai G, Bierer LM, et al. Marcadores genéticos para el riesgo de PTSD y la resiliencia entre los sobrevivientes de los ataques al World Trade Center. Marcadores Dis. 2011;30(2‐3):101‐110.

60. Yehuda R, Daskalakis NP, Desarnaud F, et al. Biomarcadores epigenéticos como predictores y correlatos de la mejoría de los síntomas después de la psicoterapia en veteranos de combate con TEPT. Psiquiatría frontal. 2013;4:118.

61. Yehuda R, Cai G, Grolier JA, et al. Patrones de expresión génica asociados con el trastorno de estrés postraumático después de la exposición a los ataques del World Trade Center. Psiquiatría Biol. 2009;66:708‐711.

62. Li CQ, Luo YW, Bi FF, et al. Desarrollo de un comportamiento similar a la ansiedad a través de la señalización del IGF-2 del hipocampo en la descendencia de la exposición de los padres a la morfina: efecto del entorno enriquecido. Neuropsicofarmacología. 2014;39(12):2777‐2787.

63. Czermak C, Staley JK, Kasserman S, et al. Disponibilidad del receptor de acetilcolina nicotínico beta2 en el trastorno de estrés postraumático. Int J Neuropsychopharmacol. 2008;11(3):419‐424.

64. Milad MR, Pitman RK, Ellis CB, et al. Base neurobiológica de la incapacidad para recordar la memoria de extinción en el trastorno de estrés postraumático. Psiquiatría Biol. 2009;66(12):1075‐1082.