Compuestos fenólicos de hojas y flores de Hibiscus Roseus: posibles aplicaciones cosméticas para la piel de una especie poco investigada

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Resumen:El uso de extractos de plantas en cosmética para el cuidado de la piel es una tendencia moderna debido a su riqueza en polifenoles que actúan como moléculas antienvejecimiento. la rosa de hibisco es una especie perenne naturalizada en Italia, con hermosas flores de color rosa suave; su composición fenólica y actividades biológicas aún no han sido estudiadas. El objetivo de este estudio fue caracterizar y cuantificar los fenoles y evaluar las actividades antioxidante, factor de protección solar (SIPF) y anticolagenasa de los extractos etanólicos de hojas (HL) y flores (HE) de H. roseus.p- Los derivados de los ácidos cumárico, clorogénico y transferúlico, así como los flavonoides de quercetina y kaempferol, fueron los principales compuestos fenólicos detectados. Se detectaron catequina, epicatequina, kaempferol-3-O-rutinósido, kaempferol-3-O-glucósido, kaempferol-7-O-glucósido, salidrosido, oenina y peonidina-3-O-glucósido solo en HF, mientras que la floridzina fue exclusiva de HL, que también mostró mayores cantidades de derivados del ácido hidroxicinámico. El HF fue más rico en flavonoides y fenoles totales, exhibiendo también una mayor capacidad antioxidante.bioflavonoidesLa actividad SPF y anticolagenasa de ambos extractos fue similar y comparable a la de los estándares sintéticos. Los resultados generales demuestran que los extractos de H. roseus son fuentes prometedoras de compuestos fenólicos bioactivos que podrían aplicarse potencialmente como agentes antienvejecimiento en cosméticos para el cuidado de la piel.

Palabras clave:anticolagenasa; antioxidante; flavonoides; flores; cosméticos a base de hierbas; ácidos hidroxicinámicos; CL-EM/EM-MRM; hojas; protección de la piel; proteccion solar

1. Introducción

El uso de los cosméticos es milenario, y su historia se configura paralelamente a la de la humanidad [1,2]. Los cosméticos para el cuidado de la piel son algunos de los productos más importantes, es la categoría principal en esta industria [1,3]. Por lo tanto, el interés por el cuidado de la piel se ha generalizado, desencadenando la demanda de productos eficaces derivados de fuentes naturales [2].

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La reciente conciencia sobre el medio ambiente, la atención médica y el uso menor de productos químicos sintéticos llevó a un creciente interés en los cosméticos a base de plantas, que ahora representan un tercio de todo el sector cosmético [1A]. Por lo tanto, el uso de extractos de plantas y sus fitoconstituyentes como ingredientes activos es un enfoque moderno "pro-ecológico" [5,6]. La creciente demanda de estos productos puede deberse a sus efectos secundarios reducidos, su amplio espectro de acción combinado con una alta eficacia y sus precios generalmente bajos [7,8].

Las plantas son ricas en varias clases de compuestos bioactivos, siendo una de las fuentes más abundantes de nuevos ingredientes responsables del tratamiento de muchas enfermedades [9,10]. Además, las plantas también son fuentes de humectantes, saborizantes y pigmentos naturales, lo que las hace muy interesantes para aplicaciones cosméticas para la piel [5]. Finalmente, los extractos de plantas generalmente se consideran seguros y cumplen con los requisitos de las autoridades reguladoras [10,11].

Entre los compuestos presentes en los extractos de plantas, los fenoles han ganado especial atención como ingredientes activos[12,13], principalmente porque se destacan como agentes antiinflamatorios, antimicrobianos y antioxidantes[14,15]. Estas propiedades las convierten en moléculas preventivas y curativas ideales para los trastornos de la piel, siendo aplicadas en cosmetología y dermatología [16]. La notable actividad antioxidante de los fenoles también es parcialmente responsable de sus efectos antienvejecimiento, que posiblemente se deban a su capacidad para reducir la degradación del colágeno y proporcionar protección UV [16]. Por lo tanto, se ha investigado y fomentado el uso de extractos naturales ricos en fenoles con alta capacidad antioxidante para el reemplazo de antioxidantes sintéticos en productos para la piel [12].

Cistanche puede antienvejecimiento

Los productos naturales extraídos de plantas de la familia Malvaceae se utilizan en todo el mundo, y el género Hibiscus ha ganado gran atención por las múltiples actividades farmacológicas de sus extractos y por su alta abundancia fenólica [17-19]. Hibisco spp. contiene alrededor de 240 especies de hierbas, arbustos o árboles con flores anuales o perennes, que se distribuyen en diferentes regiones del mundo [20]. Los extractos de hibisco se han aplicado en la medicina tradicional como emolientes para el tratamiento de muchas afecciones cutáneas y quemaduras[19,21].comprar cistancheSobre la base de estos datos de la literatura, los extractos de Hibiscus sp. las plantas pueden ser ingredientes activos interesantes para formulaciones cosméticas para la piel, protegiendo las células del estrés oxidativo, la degradación del colágeno y los efectos nocivos de la radiación UV.

Aunque el género Hibiscus comprende muchas especies, menos del 10 por ciento de ellas han sido investigadas hasta el momento [17]. Hibiscus roseus Thore (syn. H.palustris L., H.moscheutos subsp. palustris (L.) RT Clausen.) es una especie herbácea perenne naturalizada en Italia [22,23] La identificación y descripción de H. roseus aún están en debate[ 20,23]. Según la literatura, la especie H. moscheutos subsp. palustris se introdujo muy temprano en Europa, mientras que en Francia había sido descrita como una nueva especie, H. roseus, por Thore en 1807 [23]. Esta especie no ha sido caracterizada por su composición fenólica ni estudiada por sus actividades biológicas, lo que la convierte en una fuente potencial no revelada de compuestos bioactivos para productos para el cuidado de la piel.

El uso popular en tratamientos de la piel y el amplio espectro de bioactividades de las especies de Hibiscus justifican la importancia de nuevos estudios centrados en este género de plantas [17]. Por tanto, el objetivo de este estudio fue caracterizar la composición fenólica y evaluar la capacidad antioxidante, la protección solar y la actividad inhibidora de la colagenasa de los extractos etanólicos de hojas y flores de H. roseus. Nuestros resultados presentan por primera vez la composición fenólica y las bioactividades relacionadas con el antienvejecimiento de H. roseus, lo que indica el potencial de esta especie poco investigada en aplicaciones medicinales y cosméticas como aditivo antioxidante y antienvejecimiento.

2. Resultados y Discusión

2.1.Caracterización y Cuantificación de Fenólicos

Se realizó un análisis objetivo, basado en LC-MS/MS-MRM (cromatografía líquida acoplada con espectrometría de masas en tándem que trabaja en modo de monitoreo de reacción múltiple), para identificar tentativamente los compuestos fenólicos presentes en los extractos etanólicos de H. roseus desde la composición fenólica de esta especie aún no ha sido reportada en la literatura. Diecinueve compuestos fenólicos descritos previamente en el género Hibiscus se utilizaron como estándares (Tabla complementaria S1) para desarrollar el método MRM, y la selección de las mejores transiciones se diseñó mediante la optimización de los parámetros instrumentales y los datos de la literatura [24].

The main classes of compounds detected in H.roseus leaf and flower extracts were chlorogenic, p-coumaric, and trans-ferulic acids derivatives and flavonoid derivatives (Figure 1,Table 1), similarly to the previous phytochemical characterization of other Hibiscus species[25-29]. Although the phenolic profile was quite similar, some qualitative differences were observed between flowers (HF) and leaves (HL)(Figure 1 and Table 1). While leaves showed richness in p-coumaric acid derivatives (Figure 1, blue line, peaks with Rt from 2 to 9 min), flowers were especially rich in flavonoid derivatives such as catechins, dihydrochalcones, and anthocyanins (Figure 1, red line, Rt>9.3min, Tabla 1).

Trece de los diecinueve compuestos fenólicos objetivo se identificaron auténticamente en los extractos analizados por LC-MS/MS en el modo MRM (Tabla 1).cistanchEl MRM es una forma poderosa para la determinación simultánea de varios componentes, basada en la relación masa-carga (m/z) del ion molecular (((MH] ) y su ion hijo correspondiente. Permite mejorar la selectividad y sensibilidad de los análisis LC-MS/MS [30]Esta metodología es muy fiable y adecuada para análisis de extractos de plantas y otras mezclas complejas que conducen a la más alta especificidad, excelente sensibilidad y una capacidad de multiplexación extrema gracias a la posibilidad de distinguir compuestos que tienen los mismos iones originales pero diferentes fragmentos [31,32].Con este método, hemos obtenido una reducción significativa de las corridas cromatográficas, una mayor especificidad y precisión proporcionada por una buena separación de los compuestos detectados con las mismas transiciones, evitando una pérdida de sensibilidad. en el caso de diferentes compuestos coeluyentes o para compuestos presentes en muy baja concentración [24,334].

Entre los 13 compuestos fenólicos identificados utilizando estándares auténticos (Tabla complementaria S1), diez estaban presentes exclusivamente en extractos de flores (Figura 1 línea roja, Tabla 1 HF): catequina y epicatequina (picos 16b y 23), ácido clorogénico (pico 18), peonidina-3-O-glucósido y oenina (picos 21 y 22), ácido transferúlico (pico 27), tres derivados glucósidos de kaempferol (kaempferol-3-O-rutinósido, kaempferol-7-O- glucósido y kaempferol-3-O-glucósido; picos 30, 31b y 32) y salidrosido (pico 34). Además, la floridzina (pico 33b) se detectó solo en extractos de hojas (Figura 1, línea azul, Tabla 1 HL), mientras que la rutina y la quercetina-3-O-glucósido (picos 26b y 28a) se identificaron en ambos tipos de extractos (Figura 1). 1, Tabla 1HF/HL). Derivados de quercetina similares, como quercetina-3-O-sambubiósido e isoquercitrina, se observaron previamente en H.sabdariffa [26,29,35,36] y en extractos de H. rosa-sinensis [18]. Algunos de estos glucósidos podrían corresponder a los derivados de la quercetina que detectamos en H. roseus. Además, la tilirosida también se ha detectado previamente en extractos fenólicos de H. flores sabdariffa [37,38]. La oenina (malvidina-3-O-glucósido) y la peonidina-3-O-glucósido, las dos antocianinas aquí identificadas en las flores de H. roseus por primera vez, eran diferentes de las descritas previamente en las flores de H. sabdariffa, delphinidin 3-sambubiósido, delphinidin-3-glucósido y cianidina-3-O-sambubiósido [27,35,39,40]. Sin embargo, es importante mencionar que la parte más estudiada del flores de H. sabdariffa es el cáliz (sépalos), no los pétalos como se investigó aquí para H. roseus.

Además de los compuestos identificados y confirmados por los estándares objetivo auténticos, se identificaron otros 27 compuestos en extractos de hojas y flores de H. roseus en función de su MRM (m/z) y sus iones hijos, considerando así los productos de fragmentación obtenidos. del precursor (Tabla complementaria S1). En particular, se encontró en ambos extractos la presencia de derivados de p-cumárico, trans-ferúlico y ácido clorogénico, y derivados de quercetina, así como derivados de floretina y floridzina (Tabla 1).

La cuantificación de los fenoles identificados en estos extractos se realizó mediante análisis HPLC-DAD (cromatografía líquida de alta resolución acoplada a detección por matriz de diodos; Tabla 2). El contenido de derivados del ácido hidroxicinámico (THC) fue mayor en hojas que en flores, mientras que se encontraron mayores cantidades de flavonoides (TFC) en flores que en hojas (p<0.001,table 2).catechin="" derivatives(tcd),dihydrochalcones(tdc),and="" anthocyanins="" (tac)="" were="" quantified="" only="" in="" flower="" extracts(table=""><0.001).therefore, flowers="" represent="" a="" greater="" source="" of="" phenolics="" compared="" to="" leaves="" (tpc,p="0.02," table="" 2).="">cistancheDe manera similar a los extractos de H. sabdariffa, las principales clases de compuestos encontrados en las hojas de H. roseus fueron los derivados del ácido clorogénico y p-cumárico, así como los ácidos cafeoilquínico y p-cumaroilquínico [26,40,41]. Además, las antocianinas se reportaron exclusivamente en Hibiscus spp. flores y cálices, junto con catequinas [19,28,35].

Por el contrario, el ácido ferúlico y sus derivados se informaron menos como constituyentes de Hibis-cus spp. extractos, pero pueden ser de gran importancia para sus actividades biológicas [6,42-44]. De hecho, los derivados del ácido ferúlico obtenidos de diferentes especies de Hibiscus mostraron importantes propiedades farmacológicas, como actividades inhibidoras de la enzima convertidora de angiotensina y antivirales [43,44]. Además, el ácido ferúlico se describió como una molécula activa en extractos de H. mutabilis, H. taivanensis [45,46] y en extractos de cáliz de H. sabdariffa [28, 38].

En cuanto a las posibles aplicaciones cosméticas, se ha demostrado que el ácido ferúlico inhibe la formación de melanina [6,42], mientras que los derivados del ácido p-cumárico poseen actividades despigmentantes [47,48], antiinflamatorias e inhibidoras de la tirosinasa [49]. Además, muchas investigaciones destacan funciones adicionales de los flavonoles y las antocianinas, que pueden actuar como compuestos protectores de la piel, en particular inhibiendo la melanogénesis [50,51] y mediante su acción como compuestos antienvejecimiento y prevención del melanoma [52,53]. Además, las aplicaciones potenciales de los extractos de hoja de H. roseus para los trastornos de la piel también podrían mejorarse con la presencia de floridzina, que ha demostrado disminuir la expresión de citoquinas proinflamatorias inducidas por UVB en la piel expuesta a UV [54].

2.2. Ensayos de actividad antioxidante

Hoy en día, está ampliamente demostrado que la acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS) es responsable de los procesos de envejecimiento de la piel, lo que provoca sequedad, pérdida de tejido subcutáneo y formación de arrugas [55,56]. Por lo tanto, encontrar compuestos antioxidantes potenciales naturales que puedan aplicarse en productos para el cuidado de la piel es muy importante para las industrias cosméticas.

Nuestros resultados mostraron que los extractos de hojas de H. roseus tenían una actividad antioxidante más baja (expresada como valores de ECso) que las flores (Tabla 3). De hecho, las actividades antioxidantes de los extractos de flores fueron al menos dos veces mayores que las de los extractos de hojas en ambos ensayos (Tabla 3). 3). Estos resultados concuerdan con la composición y contenido fenólico de estos extractos (Figura 1, Cuadros 1 y 2), ya que los extractos HF fueron más ricos en compuestos fenólicos (Cuadro 2). De hecho, el análisis de correlación entre los valores de ECso y el contenido de las diferentes clases de fenoles se mostró significativo y negativo para todos los compuestos excepto para el THC. Como tal, mayores cantidades de flavonoides, catequinas, antocianinas, dihidrocalconas y contenido fenólico total contribuyen a mayores capacidades antioxidantes (valores más bajos de EC50—Tabla 4).

Entre los flavonoides, la quercetina y sus derivados son los antioxidantes y eliminadores de radicales libres mejor establecidos, y también actúan como inhibidores efectivos de oxidasas y lipoxigenasas [57]. Además, las dihidrocalconas, como la floretina, también se han descrito como potentes antioxidantes en ensayos de eliminación de 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) y eliminación de OH[58]. Además, las antocianinas aisladas de los extractos de hibisco demostraron ser los principales compuestos antioxidantes en las células humanas [59].

Los extractos de diferentes partes de especies de Hibiscus han mostrado una alta capacidad antioxidante [18,21,27,35,40]. Las fracciones de extractos etanólicos de H. sabdariffa mostraron valores EC50 muy bajos en los ensayos de antioxidantes, que se correlacionaron con el alto contenido en ácido protocatequiico [21,59], ácido clorogénico, flavonoides y antocianinas [24,60]. Además, un estudio sobre H. esculentus demostró el potencial antioxidante in vitro de los derivados de quercetina y las catequinas presentes en sus extractos[61]. Finalmente, en H. acetosella, la actividad antioxidante estuvo fuertemente correlacionada con el contenido de antocianinas [62].

Los resultados de nuestro estudio en extractos etanólicos de H. roseus mostraron una actividad antioxidante cien veces superior a la reportada para extractos acuosos de cáliz de H. sabdariffl, para los cuales la CE fue cercana a 45 mg mL- en un DPPH similar in vitro modelo [56] Sin embargo, a diferencia de nuestros hallazgos, el contenido total de flavonoides y la capacidad antioxidante de los extractos de hojas de H. sabdariffa fueron más altos que los de las flores [63,64]. 2.3.Factor de Protección Solar In Vitro (SPF)

La radiación ultravioleta es uno de los factores ambientales más dañinos que influyen en la salud y la fisiología de la piel, siendo una importante causa extrínseca del envejecimiento de la piel [65,6] La exposición constante a la radiación ultravioleta aumenta el riesgo de trastornos de la pigmentación y fotoenvejecimiento de la piel [67]. Esto se debe principalmente al aumento en los niveles de ROS, lo que conduce a la estimulación de la producción de colagenasa y da como resultado un daño considerable en las funciones celulares de la piel [56]. Por lo tanto, los ingredientes protectores contra los rayos UV, incluidos los presentes en los extractos de plantas, se aplican ampliamente en los cosméticos para evitar la penetración de la radiación ultravioleta en la piel, pero también previenen la producción de ROS al actuar como antioxidantes [56,

Un método simple para verificar la eficacia de diferentes componentes naturales como filtros UV es el ensayo del factor de protección solar (SPF), que es un método in vitro rápido y confiable basado en la detección de la absorbancia dentro de la región espectral UV-B (entre 290 y 320 nm), siendo útil en una fase temprana de selección de principios activos fotoprotectores [69].

El alto contenido fenólico y la actividad antioxidante de H.beneficios de la cistancheroseus extracts suggest that they may have also an UV absorbing activity. Both leaf and flower extracts of H. roseus at 0.1 mgmL-1 showed comparable SPF results (p>{{0}}.05):2,6±0,15 para HL y 2,4±0,19 para HF. Estos resultados son prometedores, ya que una formulación estándar de filtro solar que contenía un 8 % de homosalato (un filtro solar químico ampliamente aplicado) mostró un valor SPF de 4 [69,70]. Los resultados encontrados aquí para H. roseus fueron similares a los encontrados para otras especies de plantas [68,69,71,72] y son importantes considerando la baja concentración de los extractos utilizados para probar este efecto.

Los extractos de H. rosa-Sinensis ya han mostrado efectos positivos contra el daño de la radiación ultravioleta en la piel del ratón por medio de la protección antioxidante [73]. Los productos naturales que presentan SPF junto con una alta capacidad antioxidante y la inhibición de la colagenasa y la elastasa son importantes candidatos para ser utilizados para proteger la piel del fotodaño y prevenir la aparición de arrugas[66,71]. De hecho, la asociación entre el sol tradicional aprobado filtros y los derivados de fuentes naturales representa una tendencia en la industria cosmética, ya que los consumidores perciben estos productos como más seguros, debido a los efectos secundarios de los filtros UV sintéticos[72].

El mayor contenido de compuestos fenólicos totales de los extractos de HF (TPC; Tabla 2) podría indicar su mayor actividad de absorción de UV. Sin embargo, tanto los extractos de hojas como de flores mostraron resultados muy similares, lo que indica que más que el contenido total de fenoles, el perfil fenólico de los extractos estaría relacionado con la protección frente a los rayos UV. En particular, el mayor contenido de derivados del ácido hidroxicinámico en HL( Tabla 2) puede contribuir a aumentar su valor SPF, ya que estos compuestos tienen una absorción de UV alrededor de 300-320 nm [74] que, por lo tanto, se centra en la región UV-B. Por el contrario, los flavonoides y las antocianinas, presentes principalmente en los extractos de flores, tienen un espectro de absorbancia más amplio en el que están presentes al menos dos bandas, con la banda principal dentro o cerca del rango visible, alrededor de 350 nm para flavonoles y 505-550 nm para las antocianinas [53,69]. De hecho, los derivados del ácido hidroxicinámico son producidos por las plantas, especialmente para su protección contra la radiación UV [75]. Por lo tanto, estos derivados del ácido hidroxicinámico podrían contribuir en gran medida a la absorción de UV-B por la piel humana [6]. Sin embargo, considerando la presencia de antocianinas y flavonoides que cubren un rango límite de absorción de longitudes de onda, que también incluye los rayos UV-A y las regiones visibles, los extractos de flores de H. roseus podrían ser prometedores para un análisis más profundo y el desarrollo de productos cosméticos de protección solar. Además, la mayor actividad antioxidante observada para HF (Tabla 3) podría mejorar los efectos de protección solar en posibles formulaciones adicionales [69].

2.4.Actividad de inhibición de colagenasa

Both H.roseus extracts showed high collagenase inhibitory activity (>80%)at0.25mg mL-1, which is comparable to that of the synthetic inhibitor 1,10-phenanthroline 1M (Figure 2). The IC50 value of both extracts were very similar( >{{0}}.05),IC50extractos florales =0.14 ± 0.02 mg mL-1 y IC50hoja extractos =0.13±0.01 mg mL-1, a pesar de sus diferencias en composición y contenido fenólico (Cuadros 1 y 2). Esto podría deberse a las interacciones sinérgicas entre los fenoles y la colagenasa, que podrían desempeñar un papel importante en el mecanismo de inhibición. Además, otros compuestos posiblemente presentes en los extractos de H. roseus y no analizados aquí podrían participar en la actividad anticolagenasa, incluida la vitamina E y el ácido ascórbico [71,7]. Además, los dos compuestos estándar probados, el ácido clorogénico y la quercetina, cuyos derivados están presentes en los extractos de hojas y flores de H. roseus (Tabla 1), exhibieron una inhibición de colagenasa muy alta, con valores de ICso de 5.8±0.5 y 5.6±0.7ug mL -l respectivamente. Por lo tanto, estos compuestos podrían ser responsables de la actividad anticolagenasa observada. Es importante notar que diferentes clases de fenoles, que también están presentes en nuestros extractos de plantas, ya han mostrado actividad antienvejecimiento a través de la inhibición de la degradación del colágeno y contribuyendo a la humectación de la piel [78]. Por ejemplo, se ha demostrado que el ácido ferúlico y sus derivados hidratan la piel y estimulan la síntesis de fibras de colágeno, utilizándose en cosméticos como cremas antiarrugas [6]. Además, los flavonoles, en particular los derivados de la quercetina, son fuertes inhibidores de la enzima colagenasa [79].

Nuestros resultados muestran el efecto prometedor de los extractos de H. roseus contra la degradación del colágeno, que es una de las mayores proteínas responsables de la pérdida de elasticidad e integridad de la piel y de la formación de arrugas [80,81]. La enzima colagenasa inhibe la retención de la elasticidad de la piel y la resistencia a la tracción [82]. De hecho, diferentes estudios han demostrado la importancia de los antioxidantes naturales debido a su eficacia para retrasar el envejecimiento prematuro a través de la inhibición de la actividad colagenasa [78,83].

Se han realizado estudios previos que evalúan los efectos de las especies de Hibiscus en la estimulación de la producción de colágeno y en la inhibición de la actividad de la colagenasa [56,84,85]. La inhibición de la actividad colagenasa de los extractos acuosos de H. sabdariffa se ha descrito recientemente en la literatura [56]. De manera similar a nuestros hallazgos, los autores no observaron los efectos de la inhibición de la colagenasa a bajas concentraciones de los extractos, sino solo a concentraciones significativamente altas [56]. En otro estudio, el valor ICso en la inhibición de la colagenasa de los extractos etanólicos de H. sabdariffin fue de 0.75±0.04 mg mL-1[65], que es una actividad que es casi seis veces más bajas que las aquí descritas para H. roseus.

3. Materiales y Métodos

3.1.Material vegetal

Diez plantas de Hibiscus roseus Thore, compradas en un vivero comercial en Florencia (Italia), se plantaron en macetas de 10-litros llenas de tierra arenosa (arena/turba, 60:40,v/v) y se mantuvieron en el invernadero de el Departamento de Agricultura, Alimentación, Medio Ambiente y Silvicultura (DAGRI)—la Universidad de Florencia (UNIFD, Sesto Fiorentino (Italia, 43949/N,1137/E). Las plantas se cultivaron en el invernadero de enero a julio de 2019, bajo manual riego a la capacidad de agua de la maceta. De estas diez plantas diferentes, se recolectaron hojas y flores en dos grupos a fines de julio durante el período de floración e inmediatamente se almacenaron a -80 grados hasta la extracción. 3.2. Extracción asistida por ultrasonido

Muestras liofilizadas (900 mg) de flores (HF) y hojas (HL) de H. roseus se molieron en nitrógeno líquido y se extrajeron con 3 × 15,0 ml de etanol al 75 por ciento (pH 2,5 ajustado con HCOOH) mediante un Extracción asistida por ultrasonido (EAU). La EAU se realizó en un baño ultrasónico (BioClass@CP104) usando una frecuencia constante de 39kHz y una potencia de entrada de 100 W, durante 30 min, a 5 grados. Después de la centrifugación (5 min, 9000 rpm, 5 grados; ALC@4239R, Milán, Italia), los sobrenadantes se repartieron con 3 x 15 ml de n-hexano para eliminar los compuestos lipofílicos que podrían interferir con el análisis. La fase etanólica se redujo a sequedad, se pesó en balanza analítica digital (Precisa[ 125A) y el residuo se resuspendió con solución acidificada de metanol/agua (1:1 v/v, pH 2,5 ajustado con HCOOH). El proceso de extracción se realizó por triplicado.

3.3.Análisis LC-MS: perfil fenólico de los extractos

El análisis LC-MS se realizó utilizando un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo ABSciex API3000 (AB Sciex LC, Framingham, MA, EE. ). La adquisición y la reducción de datos se realizaron con el software Analyst 1.6.2 (AB Sciex LLC, Framingham, MA, EE. UU.).

La separación por HPLC se llevó a cabo en una columna Agilent Phenyl (3 × 10 mm; 2,7 um), y los eluyentes fueron (A) agua acidificada (a pH 2,5 ajustado con HCOOH) y (B) acetonitrilo/ agua (90/10, a pH 2,5 ajustado con HCOOH). Se utilizó un sistema de disolvente en gradiente como sigue: 0-3 min, 5 por ciento de B; 3-18 min, 5-40 por ciento de B; 18-28 min, 40 por ciento B;28-38 min, 40-80 por ciento B; 38-43min, 80 por ciento de B,43-45min, 80-5 por ciento de B, a un caudal de 0,4 mLmin -l. El análisis de MS se llevó a cabo en las siguientes condiciones experimentales: Presión atmosférica Ionización química (APCI) utilizando la interfaz del nebulizador calentado; Corriente de aguja (NC), -5 μA; Gas nebulizador (aire), 10 (unidades arbitrarias); Gas Auxiliar (aire),3L min-l; Temperatura de gas auxiliar (TEM), 550 grados; Cortina de gas (CUR, nitrógeno), 6 (unidades arbitrarias); Gas de colisión (CAD, nitrógeno), 9 (unidades arbitrarias, correspondientes a 2,6 × 10 ~ Torr de presión de celda de colisión).

La identificación de los diferentes componentes fenólicos se realizó mediante un enfoque específico, usando un método de monitoreo de reacciones múltiples (MRM), optimizado con estándares para 19 compuestos objetivo (elegidos en base a estudios previos de la composición polifenólica de Hibiscus spp.[25,35] ): dos flavan-3-oles (catequina y epicatequina), siete flavonoles (quercetagetina-7-O-glucósido, rutina, quercetina-3-O-glucósido, kaempferol-3-O. rutinosido , kaempferol-7-O-glucósido, kaempferol-3-O-glucósido y quercetina), un éster de cinamato (ácido clorogénico), dos ácidos hidroxicinámicos (ácidos p-cumárico y trans-ferúlico), dos dihidrocalconas ( floridzina y floretina), una oxiflavona (salidrosido) y cuatro antocianinas (mirtilina, kuromanina, peonidina-3-O-glucósido y oenina). El tiempo de retención y las transiciones relativas de MRM (cuantificador y calificador) se informaron en la Tabla complementaria S1. Además, se han sugerido identificaciones tentativas adicionales utilizando un enfoque no dirigido, escaneando el cuadrupolo desde m/z 100 a 100 Da.

3.4.Análisis HPLC-DAD: cuantificación de fenoles

Se realizó un análisis HPLC-DAD para cuantificar las diferentes clases de compuestos fenólicos (derivados del ácido hidroxicinámico, catequinas, dihidrocalconas, flavonoides y antocianinas) en los extractos. Se inyectaron alícuotas de las muestras (15 μL) en un cromatógrafo de líquidos Perkin Elmer Flexar equipado con una bomba cuaternaria 200Q/410 y un detector de matriz de diodos (DAD) LC 200 (todos de Perkin Elmer", Bradford, CT, EE. UU.) Las condiciones cromatográficas fueron las mismas que las utilizadas para los análisis HPLC-MS/MS (Sección 3.3) .

Los cromatogramas se adquirieron a 280,330,350 ya 520 nm (para la cuantificación de antocianinas). La identificación y cuantificación de los compuestos fenólicos se realizó en base al tiempo de retención, características espectrales UV y comparación con estándares, así como en base a datos de la literatura [25] y en el análisis LC-MS previo. Se utilizaron curvas de calibración de cinco puntos con diferentes estándares (ácido clorogénico, p-cumárico, rutina, epicatequina, naringina y peonidina-3-O-glucósido, todos de Sigma-Aldrich"-Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) para cuantificar los diferentes polifenoles detectados e identificados en los extractos.Si no se disponía de un patrón comercial, la cuantificación se realizaba utilizando la curva de calibración de patrones de la misma clase fenólica, dando un contenido estimado.La linealidad de las curvas se determinaba por el coeficiente de determinación (R4), siendo superior a 0,99 para todos los estándares.

Todos los extractos se analizaron por triplicado y los resultados cuantitativos de los fenoles se dieron en mg gl de peso seco (mg gl PS), expresados ​​como contenido de derivados del ácido hidroxicinámico total (THC), contenido de flavonoides totales (TFC), derivados de catequina totales (TCD), contenido total de dihidrocalconas (IDC), contenido total de antocianinas (TAC) y contenido fenólico total (TPC), que se estimaron como la suma de los compuestos individuales identificados pertenecientes a cada clase.

3.5. Ensayos de actividad antioxidante

El ensayo de actividad antioxidante se realizó utilizando dos métodos diferentes: DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) y los ensayos de eliminación de radicales hidroxilo (OH) (HRS).

Se aplicó el método de Khandi y Charles [{{0}}] para el ensayo DPPH. Brevemente, se agregaron muestras diluidas de los extractos (0.5 mL) a 0.5 mL de solución de DPPH (0.1 mM en metanol; Sigma-Aldrich@,St. Louis, MI, EE. UU.), y la mezcla se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 40 min en la oscuridad. Este tiempo (40 min) se definió con base en los resultados de los análisis cinéticos de cada extracto y los estándares de ácido clorogénico y rutina. Transcurrido el tiempo de reacción, se midió la absorbancia a 518 nm utilizando un espectrofotómetro PerkinElmer§ Lambda 25UV/VIS. También se evaluaron las absorbancias del blanco (00,5 ml de metanol y 0,5 ml de muestras) y del control negativo (0,5 ml de metanol y 0,5 ml de solución de DPPH). Todos los análisis se realizaron por triplicado. El porcentaje de actividad antioxidante se calculó como sigue (1).

4. Conclusiones

Los metabolitos secundarios son ingredientes activos potenciales para nuevas formulaciones cosméticas. Entre estos, los compuestos fenólicos extraídos de las plantas pueden tener grandes propiedades antioxidantes y antienvejecimiento, siendo efectivos en la inhibición de las enzimas dérmicas (por ejemplo, la colagenasa) y en la absorción de los rayos UV. Por lo tanto, los extractos de plantas poco investigados, como los de H. roseus, pueden representar fuentes no reveladas de moléculas bioactivas.

Demostramos que las hojas y flores de H.roseus son ricas en derivados del ácido hidroxicinámico y flavonoides, teniendo las flores mayores cantidades de glucósidos de kaempferol, catequinas, dihidrocalconas y antocianinas, todos estos compuestos aún no descritos en la literatura para esta especie. . La gran capacidad antioxidante, especialmente de los extractos de flores, junto con la actividad de protección solar y anti-colagenasa de los extractos de hojas y flores, señalan la prometedora utilización de esta especie poco investigada en aplicaciones para el cuidado de la piel. En conclusión, nuestros resultados mostraron el potencial de las flores y hojas de H. roseus como fuentes de fenoles, así como la actividad de sus extractos como agentes antienvejecimiento que podrían usarse como ingredientes para productos cosméticos funcionales.

Este artículo está extraído de Plants 2021, 10, 522. https://doi.org/10.3390/plants10030522 https://www.mdpi.com/journal/plants