Abstracto

Los extractos etanólicos acuosos de tallos en polvo de Dendrobium loddigesii proporcionaron tres nuevos compuestos fenólicos, incluidos tres-7-O-etil-9-O-(4-hidroxifenil)propionil-diacilglicerol (1), (R){{ 7}},5,4ʹ-trihidroxi-3,3ʹ, -trimetoxibibencilo (2) y (S)-5,5′,7-trihidroxi-3′,4′ -dimetoxifavanona (3), junto con once análogos conocidos. Sus estructuras se determinaron mediante un extenso análisis espectroscópico. Para identificar antioxidantes naturales, blanqueadores y agentes antienvejecimiento, se evaluaron las capacidades de estos compuestos fenólicos para eliminar el radical 1,2-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH), sus capacidades para inhibir la producción de tirosinasa y sus capacidades para estimular la producción de colágeno mediante el ensayo de fibroblastos dérmicos humanos-adultos (HDFa). Se encontró que los compuestos 1, 4–8, 13 y 14 exhibieron actividades significativas de captación de radicales DPPH, el compuesto 10 exhibió actividad inhibidora de tirosinasa (IC50 37.904 ug/mL) y el compuesto 9 mostró una producción significativa de colágeno con un valor EC50 de 3.182 ug/mL. Estos resultados sugieren que los componentes fenólicos de D. loddigesii pueden ser candidatos a antioxidantes, blanqueadores de la piel y/o agentes antienvejecimiento.

Según estudios relevantes,cistanchees un comúnhierbaque se conoce como "la hierba milagrosa que prolonga la vida". Su principal componente escistanósido, que tiene varios efectos tales comoantioxidante, antiinflamatorio, ypromoción de la función inmunológica. El mecanismo entre la cistanche yblanqueamiento de la pielradica en el efecto antioxidante deglucósidos de cistanche. La melanina en la piel humana es producida por la oxidación detirosinacatalizada por la tirosinasa, y la reacción de oxidación requiere la participación de oxígeno, por lo que los radicales libres de oxígeno en el cuerpo se convierten en un factor importante que afecta la producción de melanina. Cistanche contiene cistanosido, que es un antioxidante y puede reducir la generación de radicales libres en el cuerpo, por lo tantoinhibiendo la producción de melanina.

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Resumen gráfico

1. Introducción

El género Dendrobium (Orchidaceae) contiene aproximadamente 1500 especies en todo el mundo, de las cuales unas 80 especies crecen en China [1]. Los tallos de varias plantas de este género se conocen como "Shi-Hu", que se han utilizado durante miles de años como medicina tradicional china y remedios caseros para el tratamiento de la gastritis atrófica crónica, el envejecimiento de la piel, la fiebre, las enfermedades cardiovasculares y un tónico para promover la producción de fluidos corporales [2]. Estudios previos sobre este género condujeron al aislamiento de una serie de polisacáridos, compuestos fenólicos, alcaloides y sesquiterpenoides [1, 3–5], algunos de los cuales poseen varias bioactividades que incluyen antiinflamatoria [6], antimicrobiana [2], antioxidante [7], antitumoral [8], antiagregante plaquetario [9], inmunomodulador [10] y contra la actividad de la influenza A [11].

Dendrobium loddigesii, una hierba epífita perenne, está ampliamente distribuida en el área suroeste de China, como las provincias de Guangxi, Guizhou y Yunnan [12]. Su tallo se ha aplicado en la medicina popular para tratar la gastritis, la fiebre y los mareos [13]. Continuando con la búsqueda de productos naturales estructuralmente diversos y biológicamente activos de este género [1, 5, 14–17], en este documento se realizó una investigación en profundidad de los componentes farmacológicamente activos de esta especie de planta. Como resultado, se aislaron tres nuevos compuestos fenólicos (1-3) y once conocidos (Fig. 1) de un extracto etanólico al 80 por ciento del tallo de D. loddigesii. El aislamiento, la elucidación de la estructura y la evaluación biológica de estos compuestos se presentan aquí.

2 Resultados y Discusión

El compuesto 1, obtenido como un sólido blanco, dio una fórmula molecular de C21H26O7 determinada por el ion (-)-HRESIMS en m/z 389,1602 [M−H]− (calculado para C21H25O7, 389,16{{ 28}}6) con nueve grados de instauración. El espectro de RMN de 1H de 1 contiene siete protones aromáticos en δH 6,85 (1H, d, J=1,7 Hz), 6,75 (1H, d, J=8,0 Hz), 6,68 (1H , dd, J = 8.0, 1.7 Hz), 7.01 (2H, d, J = 8.5 Hz) y 6.68 (2H, d, J = 8.5 Hz), lo que sugiere la presencia de un anillo de benceno 1,3,4-trisustituido y un anillo de benceno 1,4-disustituido. Su espectro de RMN de 13C exhibió resonancias de 21 carbonos, incluidos dos metilos (uno metoxi), cuatro metileno alifático, nueve metinos (dos sp3, siete sp2) y seis carbonos cuaternarios (un carbonilo, cinco olefínicos, incluidos tres oxigenados). Las correlaciones HMBC (Fig. 2) de H-7/C-1 (δC 131,6), C-2 (δC 111,7), C-6 (δC 121,4), C -8 (δC 74.2), y C-10 (δC 65.3); H-9/C-7 (δC 83,8) y C-8 (δC 74,2); H-10/C-11 (δC 15,6); 3-OMe (δH 3,81)/C-3 (δC 149,1), junto con correlaciones de H-7/H-8/H2-9 y H{{ 87}}/H3-11 del espectro 1 H–1 H COSY (Fig. 2) indicó la presencia de 7-O-etilguayacilglicerol [18]. Se ha informado que J7,8 fue de aproximadamente 5 Hz para el isómero eritro y 7 Hz para los tres isómeros en los casos de jeringas-gliceroles y derivados de diacilglicerol. Por lo tanto, se consideró que el compuesto 1 eran los tres isómeros con J7,8 (6,5 Hz) [18]. Las correlaciones HMBC de H-7ʹ (δH 2,79, t, J = 7,5 Hz)/C-8ʹ (δC 37,1), C-1ʹ (δC 132,7), C-2ʹ, 6ʹ (δC 130,2) y C-9ʹ (δC 174,6), H-8ʹ (δH 2,59, t, J = 7,5 Hz)/C-7ʹ (δC 31,0), C-1ʹ y C-9ʹ, junto con picos cruzados COSY de H-8ʹ/H-7ʹ indicados la presencia de ácido p-hidroxicumárico [19]. Sobre la base de la evidencia descrita anteriormente, se propuso que 1 tuviera un resto 7-O-etilguaiacilglicerol y un ácido p-hidroxi-cumárico a través de un enlace éster. La correlación HMBC de H-9 a C-9ʹ sugirió que el enlace éster estaba entre C-9 y C-9ʹ. Por lo tanto, la estructura de 1 se determinó como se muestra.

Se obtuvo (R){{0}},5,4ʹ-trihidroxi{-3,3ʹ,-trimetoxibibencilo (2) como un sólido blanco. El espectro HRESIMS de 2 mostró un pico de iones cuasimoleculares en m/z 319,1180 [M−H]− (calculado para C17H19O6, 319,1187) con 8 grados de insaturación. El espectro de RMN de 1H de 2 mostró tres grupos metoxilo en δH 3,75 (3H, s), 3,70 (3H, s) y 3,17 (3H, s); un protón de metino oxigenado en δH 4,13 (1H, t, J=6,8 Hz, H-); dos señales de metileno en δH 2,73 (1H, dd, J=13,5, 6,9 Hz) y 2,96 (1H, dd, J=13,5, 6,9 Hz); y cinco protones aromáticos, que aparecen como un anillo aromático 1,3,4,5-tetrasustituido en δH 6,28 (1H, d, J=1,8 Hz) y 6,34 (1H, d, J{{ 60}}.8 Hz), y un anillo aromático 1,3,4-trisustituido en δH 6.49 (1H, d, J=2.0 Hz), 6.62 (1H, d, J=8,0 Hz) y 6,52 (1H, dd, J = 8,0, 2,0 Hz). Los espectros 13CNMR y DEPT de 2 mostraron tres oximetileno, un metileno, un metino oxigenado y 12 carbonos aromáticos (cinco oxigenados). La comparación de sus datos de RMN (Tabla 1) con los de la dendrocandina C [20] mostró grandes similitudes excepto por la presencia de un grupo metoxilo más, que estaba ubicado en C-3ʹ por las correlaciones HMBC de 3ʹ-OMe y H-5ʹ a C-3ʹ (δC 148.4). Además, las múltiples interacciones HMBC (Fig. 2) de 3-OMe y H-2/C-3 (δC 149.5); -OMe/C- (δC 86,9) sugirió los otros grupos metoxilo en C-3 y C-, respectivamente. La configuración absoluta en C- se determinó como R sobre la base de la rotación óptica negativa ([훼] 26 D –12,46), similar a la afílica D [훼] 20 D –20,3, MeOH) [15]. En consecuencia, la estructura de 2 se determinó como se muestra.

(S){{0}},7,5′-trihidroxi-3′,4′-dimetoxifavanona (3) se obtuvo como un polvo amorfo amarillo y tenía la molécula C17H16O7 (1{{69} } índices de deficiencia de hidrógeno) según el ion (-)-HRESIMS en m/z 331,0819 [M – H]− (calcd 331,0823). Los máximos de absorción UV a 206 y 294 nm indicaron la presencia de una flavanona [21]. El espectro de RMN de 1H (Tabla 1) mostró tres señales en la región no aromática ubicadas en δH 5.29 (1H, dd, J=12.7, 3.1, H-2), 3.04 (1H, dd, J=17.1, 12.7, H-3ax), y 2.71 (1H, dd, J=17.1, 3.1, H-3 eq), cuatro protones aromáticos δH 5,87 (1H, d, J=2,2, H-6), 5,91 (1H, d, J=2,2, H-8), 6,62 (1H, d, J=2.0, H-2ʹ) y 6.61 (1H, d, J=2.0, H-6ʹ), dos grupos metoxilo δH 3.83 (3H, s) y 3,77 (3H, s). Los espectros 13C NMR y DEPT (Tabla 1) contienen resonancias para 17 carbonos, incluidos dos metoxis, un metileno, un metino, un carbono carbonílico y 12 carbonos aromáticos. El análisis exhaustivo de sus datos de RMN indicó que su estructura plana está estrechamente relacionada con la de la dihidrotricina [22], excepto que las resonancias OH-4ʹ y OCH3-5ʹ en la dihidrotricina se transpusieron en 3. Esto fue confirmado por el cruce HMBC picos (Fig. 2) de H-2ʹ, H-6ʹ y OCH3-4ʹ a C-4ʹ (δC 137.7), de H-6ʹ a C-5ʹ (δC 151.8). La configuración absoluta en C-2 se postuló en forma de S sobre la base de un valor de rotación específico negativo (-46,64, MeOH) en su rotación óptica [23]. Por lo tanto, la estructura del compuesto 3 se asignó sin ambigüedades como se muestra.

Se identificaron once compuestos conocidos como trepidación 4 [24], mescalina 5 [25], 4,5,4′-trihidroxi- 3,3′-dimetoxibibencil 6 [26], 4′,5- dihidroxi-3,3′- dimetoxibibencil 7 [27], Tristin 8 [28], batatas en III 9 [27], 3,5,3′-hidroxibibencil 10 [29], aphyllous C 11 [15], dentiforme A 12 [30], dihidroconiferil dihidro-p-coumarato 13 [31], p-hidroxifenil trans-ferulato 14 [32] mediante análisis espectroscópico y comparando sus datos espectrales con la literatura.

Los compuestos fenólicos son una parte esencial de la dieta humana y son conocidos como poderosos antioxidantes debido a su potente acción de ruptura de cadenas y pueden contribuir directamente a la actividad antioxidante [33]. El ensayo de captación de radicales DPPH es uno de los métodos más comunes y relativamente rápidos utilizados para evaluar la actividad antioxidante. Los compuestos que pueden donar un átomo de hidrógeno al radical DPPH y luego dar lugar a la forma reducida de DPPH se considerarán agentes antioxidantes potenciales. Todos los compuestos fueron evaluados por sus actividades de captación de radicales DPPH. Los presentes resultados (Tabla 2) mostraron que la mayoría de los compuestos fenólicos (1, 4–8, 13 y 14) mostraron actividades significativas con capacidades de barrido que oscilan entre 89,411 y 94,278 por ciento a 100 ug/mL.

Por otro lado, la tirosinasa es una enzima que contiene cobre y desempeña un papel fundamental en el control de la ruta de biosíntesis de melanina en los melanocitos [34]. Por lo tanto, los inhibidores de tirosinasa se convirtieron en componentes importantes de cosméticos o productos medicinales para la hiperpigmentación y el desarrollo de agentes blanqueadores de la piel. En el presente estudio, todos los aislamientos fueron evaluados por su actividad inhibidora de tirosinasa (Tabla 2). El ácido kójico, un supuesto agente para aclarar la piel, se usó como control positivo. El 3,5,3′-hidroxibibencilo (10) reveló una actividad inhibidora significativa con un valor IC50 de 37,904 ug/mL. Aphyllals C (11) mostró una inhibición moderada (IC50, 152,56 ug/mL). Todos los compuestos restantes fueron inactivos a concentraciones de hasta 200 ug/mL. En este estudio, se puede concluir que los compuestos 10 y 11 pueden ser candidatos potenciales para el tratamiento de enfermedades de la piel relacionadas con la biosíntesis de melanina.

Teniendo en cuenta que esta especie se usa medicinalmente para el envejecimiento de la piel, ya que el colágeno es fundamental para la fortaleza y elasticidad de la piel, y su degradación conduce a las arrugas que acompañan al envejecimiento [35]. Por lo tanto, todos los compuestos también se evaluaron deliberadamente por sus efectos sobre la producción de colágeno en HDFa. Los resultados (Tabla 2) mostraron que el compuesto 9 estimulaba significativamente la actividad de producción de colágeno HDFa (CE50 30,182 ug/ml). Los compuestos 6 y 7 mostraron actividades más débiles, con una producción de colágeno del 33,062 por ciento y del 29,157 por ciento a 10 ug/ml, respectivamente. Los presentes resultados no solo respaldaron el uso etnofarmacológico de D. loddigesii, sino que también proporcionaron una plantilla de estructura confiable para desarrollar enfermedades asociadas con la deficiencia de colágeno, como quemaduras y úlceras.

3 experimentales

3.1 Procedimientos Experimentales Generales

3.2 Material Vegetal

Los tallos de D. loddigesii se recolectaron en septiembre de 2014 en la ciudad de Wenshan, provincia de Yunnan, República Popular de China, y fueron identificados por el profesor Hong Yu (Universidad de Yunnan, Kunming, República Popular de China). El espécimen de comprobante (n.º 20.140.829) ha sido depositado en el Laboratorio Estatal Clave de Fitoquímica y Recursos Vegetales en China Occidental, Instituto de Botánica de Kunming, Academia de Ciencias de China.

3.3 Extracción y Aislamiento

Los tallos secos y pulverizados (10,2 kg) de D. loddigesii se extrajeron tres veces con etanol al 80 por ciento a temperatura ambiente y se concentraron a presión reducida. Luego, el residuo se suspendió en H2O y se repartió con EtOAc para obtener la fracción de EtOAc (220 g), que se sometió a cromatografía en columna de gel de sílice eluida con un gradiente de éter de petróleo/acetona (15:1 a { {110}}:1) para obtener 22 fracciones (Fr.1–22). Fr.11 (6 g) se sometió a CC de gel de sílice eluida con CHCl3/MeOH (300:1), seguido de columna MCI (gradiente de MeOH/H2O, 60:40–95:5) y CC de gel de sílice (CHCl3/ MeOH, 200:1) para producir 12 (4 mg). Fr.13 (850 mg) se separó en una columna de MCI (MeOH/H2O, 60:40 a 95:5) para dar cinco fracciones (Fr.13.1–Fr.13.5). Fr.13.4 (150 mg) proporcionó los compuestos 4 (3 mg) y 5 (5 mg) por preparación de HPLC (MeOH/H2O, 60:40). Fr.16 (19 g) se cromatografió en columna de gel de sílice eluida con CHCl3/MeOH (100:1 a 20:1) para proporcionar 6 subfracciones (Fr.16.1–Fr.16.6). Fr.16.4 (2,3 g) se aplicó a la columna MCI eluida con MeOH/H2O (50:50–100:0) y luego se fraccionó más en una columna de Sephadex LH-20 (MeOH/H2O, 90:10) para rendimiento 7 (716 mg) y 13 (39 mg). Usando las mismas condiciones de Fr.16.4, Fr.16.6 (240 mg) proporcionó el compuesto 9 (7 mg). Fr.18 (10 g) se separó con gel de sílice CC (CHCl3/MeOH, 100:1–20:1), luego se pasó a través de MCI (gradiente de MeOH/H2O, 50:50–100:0) y Sephadex LH{{ 96}} (MeOH/H2O, 90:10) para producir 3 (25 mg) y 11 (4 mg). Fr.19 (20 g) se sometió a una columna MCI eluida con MeOH/H2O (30:70–100:0) para obtener siete fracciones (Fr.19.1–Fr.19.7). Fr.19.5 (2,3 g) se separó mediante columna de gel de sílice repetida (CHCl3/MeOH, 30:1) para proporcionar 8 (15 mg) y 10 (7 mg). Fr.19.6 (4,3 g) se fraccionó en una columna de gel de sílice (CHCl3/MeOH, 30:1) para dar 5 fracciones (Fr.19.6.1– Fr.19.6.5). Fr.19.6.1 (1,2 g) se sometió a una columna de gel de sílice (CHCl3/MeOH, 30:1) y después de la purificación por HPLC (MeOH/H2O, 45:55), proporcionó 1 (15 mg). Fr.19.6.3 (540 mg) se aplicó a una columna de Sephadex LH-20 eluida con MeOH/H2O (90:10) y luego se purificó más mediante HPLC semipreparativa (MeOH/H2O, 45:55) para proporcionar 2 (6 mg) y 6 (5 mg). Fr.20 (12 g) se aplicó a un paso cromatográfico de gel MCI (MeOH/H2O, 30:70–100:0) y luego se sometió a gel de sílice CC (CHCl3/MeOH, 30:1) para dar 14 (21 mg).tres{{0}}O-etil-9-O-(4-hidroxifenil) propionil-diacilglicerol (1): sólido blanco; [ ]D 26 – 3,72 (c 0,51, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 203 (4,53), 225 (4,17), 280 (3,66) nm; IR (KBr) νmáx 3426, 1727, 1516, 829 cm−1; RMN de 1H y 13C (CD3OD), véase la Tabla 1; ESIMS m/z 389 [M−H]−, HRESIMS m/z 389,1602 [M−H]− (calculado para C21H25O7, 389,1606).

(R)-4,5,4′-trihidroxi-3,3ʹ, -trimetoxibibencilo (2): polvo amorfo blanco; [ ]D 26 -12,46 (c 1,07, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 204 (4,59), 286 (3,75) nm; IR (KBr) νmáx 3418, 1607, 1517, 1455, 1434, 796 cm−1; RMN de 1H y 13C (CD3OD), véase la Tabla 1; ESIMS m/z 319 [M-H]-, HRESIMS m/z 319,1180 [M-H]- (calculado para C17H19O6, 319,1187).

(2S)-5,7,3ʹ-trihidroxi-6,4,5-trimetoxifavona (3): polvo amorfo amarillo; [ ]D 26 – 46,64 (c 0,46, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 206 (4,70), 294 (4,17) nm; IR (KBr) νmax 3335, 2940, 1641, 1514, 1462, 1345, 1434, 1182, 1091, 998, 833 cm−1; RMN de 1H y 13C (CD3OD), véase la Tabla 1; ESIMS m/z 331 [M-H]-, HRESIMS m/z 331,0819 [M-H]- (calculado para C17H15O7, 331,0823).

3.4 Ensayo de actividad de captación de radicales DPPH

El ensayo de actividad de captación de radicales libres se llevó a cabo de acuerdo con el método anterior [36] con algunas modificaciones. Brevemente, se agregaron muestras de 30 μL (1000 ug/mL, disuelto en etanol) y Trolox (1 mM) a 270 μL de solución de DPPH (100 μM, disuelto en metanol), respectivamente. La reacción prosiguió durante 1 hora a 37 grados en una microplaca de 96-pocillos. A continuación, se leyó la absorbancia a 515 nm y se calculó el porcentaje de actividad total de eliminación de radicales mediante la siguiente fórmula: porcentaje de inhibición =[(A0− A1)/A0] × 100 por ciento, donde A0 es la absorbancia del DPPH sin muestras (reacción de control) y A1 es la absorbancia de DPPH incubada con las muestras. Todas las pruebas se realizaron por triplicado y se utilizó Trolox como agente de control positivo.

3.5 Ensayo inhibidor de tirosinasa de hongos

La inhibición de la actividad de tirosinasa se determinó espectrofotométricamente de acuerdo con el método descrito anteriormente [36] con algunas modificaciones. Brevemente, se prepararon diferentes concentraciones de compuestos de prueba en DMSO al 10 por ciento. Cada una de las soluciones de muestra (20 μM) se mezcló con L-Dopa (1,25 mM) y se diluyó con 970 μL de tampón de fosfato de sodio 0,05 mM (PBS, pH 6,8) en los tubos de ensayo. La reacción se inició añadiendo tirosinasa de hongo (25 U/mL). La mezcla de reacción se incubó durante 5 min a temperatura ambiente. La cantidad de dopacromo en la mezcla se determinó midiendo la absorbancia de cada pocillo a 490 nm. Se utilizó ácido kójico como control positivo. El porcentaje inhibidor de tirosinasa se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación: Porcentaje de inhibición=[(A0− A1)/A0] × 100 por ciento, donde A0 es la absorbancia del dopacromo sin compuestos de prueba (reacción de control) y A1 es la absorbancia del dopacromo incubado con los compuestos de prueba.

3.6 Producción de colágeno por ensayo HDFa

Agradecimientos Este proyecto fue apoyado financieramente por el Departamento de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Yunnan (Nos. 2017ZF003-04, 2015HB093 y 2019HA001). Los autores agradecen al personal del grupo analítico del Laboratorio Estatal Clave de Fitoquímica y Recursos Vegetales en China Occidental, Instituto de Botánica de Kunming, Academia de Ciencias de China, por las mediciones de todos los espectros.

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