Oligoglucósidos Feniletanoides Y Oligoazúcares Acilados Con Actividad Vasorrelajante De Cistanche Tubulosa

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Masayuki Yoshikawa y otros

Resumen

El extracto metanólico de los tallos secos deCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight mostró un efecto inhibitorio sobre las contracciones inducidas por noradrenalina en tiras aórticas de rata aisladas. A partir del extracto, se aislaron nuevos componentes aminoglucósidos de feniletanoide, kankanósidos F y G, y un oligoazúcar acilado, kankanosa, junto con 14 compuestos conocidos. Las estructuras de estos nuevos compuestos se determinaron en base a sus evidencias químicas y fisicoquímicas. Además, los constituyentes principales, kankanosido F, kankanosa, equinacósido, acteosido y cistanosido F, mostraron actividad vasorelajante y se aclararon varios requisitos estructurales para la actividad. 2006 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.

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Introducción

La planta parásita Orobanchaceae,Cistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight, está ampliamente distribuido en NorthAfrica, Arabia y países asiáticos, y los tallos deCistanche tubulosa, así como C. salsa y C. deserticola, se han utilizado tradicionalmente como agente promotor de la circulación sanguínea y tratamiento de la impotencia, esterilidad, lumbago, debilidad corporal y tónico.2,3 Durante el curso de nuestros estudios de caracterización de componentes bioactivos de origen chino medicamentos,1,4–14 hemos informado sobre el aislamiento y elucidación de la estructura de cinco iridoides, kankanosides A–D y kankanol, y un monoterpenoglucósido, kankanoside E, junto con 16 compuestos conocidos de los tallos deCistanche tubulosa1 Como continuación del estudio sobre este medicamento a base de hierbas, se encontró que el extracto etanólico muestra un efecto inhibidor sobre las contracciones inducidas por la noradrenalina en tiras aisladas de aorta torácica de rata. A partir de este extracto de metanol, también aislamos oligoglucósidos de feniletanoide, kankanósidos F (1) y G (2), y oligoazúcar anacilado, kankanosa (3) y 14 compuestos conocidos, echinacósido (4), acteósido (5), isoactósido (6 ),20-acetillacteosido (7), tubulósidos A (8) y B (9), cistanosido F (10), salidrosido (11), (2R,3R)-butano-2,{{18 }}diol 2-ObD-glucopiranósido,meso-butano-2,3-diol2-ObD-glucopiranósido, etil bD-glucopiranósido,3-metilbutanol bD-glucopiranósido, (más)-pinoresinol40-ObD -glucopiranósido, y (más)-siringaresinol 40-ObD-glucopiranósido. Este artículo trata sobre la elucidación de la estructura de nuevos compuestos (1–3), así como los efectos vasorrelajantes de los componentes principales (1, 3–6, 10 y 11) sobre las contracciones inducidas por noradrenalina en tiras aórticas de rata aisladas basadas en la aplicación tradicional para circulación sanguínea (fig. 1).

Resultados y discusión

2.1. Efecto vasorelajante del extracto metanólico de tallos deCistanche tubulosasobre la contracción inducida por noradrenalina en aorta torácica aislada de rata

Como se muestra en la Tabla 1, el extracto metanólico de los tallos deCistanche tubulosa(comprado en Urumqi, provincia de Xinjiang, China) mostró actividad vasorrelajante en las contracciones inducidas por noradrenalina en tiras aórticas de rata aisladas, dependiente del tiempo y la concentración (30–3{{10}} 0 lg/mL). El extracto metanólico se purificó aún más mediante cromatografía en columna de fase normal e inversa y, finalmente, HPLC para dar 1 (0.016 por ciento), 2(0.{{31} }25 por ciento), 3 (0.020 por ciento), 4 (3.09 por ciento),3 5 ({{64} },68 por ciento),3 6(0.096 por ciento),3 7 (0,017 por ciento),3 8 (0,052 por ciento),3 9 (0,0036 por ciento),3 10(0,025 por ciento),15 11 (0,044 por ciento),16 (2R,3R)-butano-2,{{44 }}diol2-ObD-glucopiranósido (0,0087 por ciento),17 meso-butano-2,3-diol2-ObD-glucopiranósido (0,0065 por ciento),17 etilb-D- glucopiranósido (0,055 por ciento),17 3-metilbutanol bD-glucopiranósido (0,0030 por ciento),17 (más)-pinoresinol 40-ObD-glucopiranósido (0,016 por ciento),18 y (más)-siringaresinol{{81} }ObD-glucopiranósido (0,022 por ciento).15

2.2. Estructuras de kankanosides F (1) y G (2)

El kankanósido F (1) se obtuvo como un polvo blanco con rotación óptica negativa (½a -28D -44.8- en MeOH). El espectro IR de 1 mostró bandas de absorción a 156{{69} }, 1508 y 1458 cm-1 atribuibles a un anillo aromático y fuertes bandas de absorción en 3432, 1075 y 1044 cm-1, lo que sugiere una estructura de aminoglucósido. FAB-MS de iones negativos de 1, se observaron picos de iones cuasimoleculares en m/z 647 (M más Na) más y 623 (MH), y el análisis FAB-MS de alta resolución reveló que la fórmula molecular de 1 es C26H40O17. Los espectros de RMN de 1H y 13C (CD3OD, Tabla 2) de 1, que fueron asignados por varios experimentos de RMN,19 mostraron señales asignables a dos metilenos [d 2,78 (2H, m, H2-7), 3,70, 4.{{ 39}} (1H cada uno, ambos m, H2-8)] y protones aromáticos de tipo ABC acoplados orto y meta [d 6,56 (1H, dd, J=1,9,7,9 Hz, H-6), 6,67 (1H, d, J=7,9 Hz, H-5), 6,69 (1H, d, J=1,9 Hz, H{ {64}})] junto con tres restos de glucopiranosa [d 4,30 (1H, d, J=8,0 Hz, H-10), 4,37 (1H, d, J=8. 0 Hz, H-1000), 5,16 (1H, br s, H-100)]. La estructura del aminoglucósido en 1 se caracterizó mediante un experimento de conectividad de enlace múltiple heteronuclear (HMBC), que mostró correlaciones de largo alcance entre los siguientes pares de protones y carbono (H-10 y C-8; H-100 y C-30; H-1000 y C-60) como se muestra en la Figura 2. La desacilación enzimática del echinacósido (4), cuya estereoestructura absoluta se informó anteriormente,3 con tanasa13,14 dio 1. Sobre la base de la evidencia mencionada anteriormente, se determinó que la estructura del kankanósido F era 2-(3,4- dihidroxi fenil)etilo OaL-ramnopiranosil(1-3)[bD-glucopiranosil(1-6)]-b-D-glucopiranósido (1).

Kankanoside G (2) también se obtuvo como un polvo blanco con rotación óptica negativa (½a-26D-35.0-en MeOH). El espectro IR de 2 mostró bandas de absorción a 3432, 1709, 1638, 1518, 1447 y 1040 cm-1, atribuibles a funciones hidroxilo, éster carbonilo conjugado y éter y anillo aromático. La fórmula molecular, C29H36O14, de 2 se determinó a partir de FAB-MS de iones positivos y negativos [m/z 631 (M más Na) plus y 607(MH)-] y mediante FAB-MS de alta resolución. La desacilación enzimática de 2 con tanasa produjo cistanosido G(12), cuya estereoestructura absoluta se informó anteriormente. v/v), el ácido cafeico se identificó mediante análisis HPLC. Los espectros19 de RMN de 1H y 13C (CD3OD, Tabla 2) de 2 indicaron la presencia de las siguientes funciones: 4-parte de alcohol hidroxifeniletílico {dosmetilenos [d 2,82 (2H, m, H2-7), 3,70, 3,96 ( 1H cada uno, ambos m, H2-8)] y protones aromáticos de tipo A2B2-acoplados en orto [d 6.65, 7.03 (2H cada uno, ambos d, J=8.6 Hz,H{ {62}},5 y H-2,6)]} y dos restos de glucopiranosa [d4,33 (1H, d, J=7,9 Hz, H-10), 5,19 (1H, br s, H-100)]junto con un resto cafeoilo {una trans-olefina [d 6,29,7,56 (1H cada uno, ambos d, J=15,9 Hz, H{{84 }} y H-7)] y dihidroxibenceno de tipo pirocatecol [d 6,78 (1H, d,J=8,3 Hz, H-5), 6,89 (1H, dd, J {{ 96}}.9, 8.3 Hz, H-6),7.04 (1H, d, J=1.9 Hz, H-2)]}. En el experimento HMBC en 2, se observó una correlación de largo alcance entre el 60-protón [d 4,36 (1H, dd, J=6,1, 11,6 Hz),4,50 (dd, J {{ 119}}.8, 11,6 Hz)] y el cafeoil carbonilcarbono (dC 169,1). En consecuencia, se determinó que la estructura del kancanosido G era 4-hidroxifenil-OaL-ramnopiranosil(1 ! 3)-(6-O-cafeoil)-bD-glucopiranosido (2).

2.3. Estructura de la kankanosa (3)

También se obtuvo kankanosa (3), ½a- 27D-35.3- (MeOH), como un polvo blanco. El espectro IR de 3 mostró bandas de absorción en 343{{30}}, 1702, 1639, 1611, 1458 y 1071 cm-1, atribuibles a funciones hidroxilo, carbonilo éster conjugado, éter y anillo aromático. El FAB-MS de iones positivos y negativos de 3 mostró picos de iones cuasimoleculares en m/z 673 (M más Na) más ym/z 649 (MH), respectivamente. El FAB-MS de alta resolución de 3 reveló que la fórmula molecular era C27H38O18. Hidrólisis alcalina de 3 con 10 por ciento de KOH–50 por ciento de 1,4-dioxano acuoso liberado de ácido cafeico, que se identificó mediante análisis HPLC, junto con un oligoazúcar. La hidrólisis ácida de este oligoazúcar con ácido clorhídrico (HCl) 1,0 M liberó L-ramnosa y D-glucosa, que se identificaron mediante análisis HPLC utilizando un detector óptico de rotación.1,13,14 Los espectros 1H y 13CNMR (CD3OD, Tabla 3)19 de 3 mostraron señales asignables al resto trisacárido {d [5.11 (d, J=3.4 Hz), 4.57 (d, J=7.9 Hz), mezcla de formas a y b de H{ {52}} (aprox. 1:1)], 4,25, 4,27 (ambos d, J=7,7 Hz, H-1000), 5,13, ​​5,18 (ambos br s, H{{66 }})} junto con un grupo cafeoilo [d 6,28, 6,29 (ambos d, J=15,9 Hz, H-9), 6,78 (d,J=8,0 Hz, H -5), 6,96 (dd, J=2,0, 8,0 Hz, H-6), 7,06 (d, J=2,0 Hz, H{{90} }), 7,60 (d, J=15,9 Hz, H-7)]. En los experimentos de HMBC en 3, se observaron correlaciones de largo alcance entre el 40-protón [d 5.04, 4.99 (ambos dd,J=9.5, 9.8 Hz)] y el carbono carbonilo cafeoil (dC168.53 , 168.65). Sobre la base de la evidencia mencionada anteriormente, la estructura de la kankanosa se dilucidó en bea-L-ramnopiranosil(1-3)[bD-glucopiranosil(1-6)]-O-(4- O-cafeoil)-D-glucopiranosa (3).

2.4. Efecto vasorelajante de los componentes principales (1, 3–6,10, 11) deCistanche tubulosasobre la contracción inducida por noradrenalina y alto K plus en aorta torácica aislada de rata

Como se muestra en la Tabla 4 y la Figura 3, los efectos inhibidores de los constituyentes principales, kankanosido F (1) y kankanosa (3), echinacósido (4), acteósido (5), isoactósido (6), cistanosido F (10) y salidrosido ( 11) sobre contracciones inducidas por noradrenalina en aorta torácica aislada de rata. Como resultado, los compuestos 3-5 y 10 que tenían un grupo cafeoílo en la posición 40-inhibían significativamente las contracciones, según el tiempo y/o la concentración (10-100 lM), mientras que el 6 que tenía el grupo 60- El resto O-cafeoilo mostró una actividad más débil que 4 y 5. Por otro lado, el compuesto 1 con un grupo catecol mostró una inhibición significativa, pero el 11 con un grupo fenol no mostró tal efecto. Estos resultados nos llevaron a suponer que la fracción 40-O-cafeoílo y la fracción 10-O-dihidroxifenetilo son esenciales para una fuerte actividad vasorrelajante. Por otro lado, los compuestos 1, 3-6 y 10 (100 lM) no mostraron ningún efecto sobre las contracciones inducidas por una alta concentración de catión potasio (alta K plus ) diferente de la nifedipina, un bloqueador de los canales de calcio dependiente de voltaje, en el mismos tejidos (datos no mostrados). Este hallazgo sugirió que estos constituyentes activos inhibían las contracciones a través del canal de calcio operado por receptor, pero no a través del canal de calcio dependiente de voltaje. Recientemente, Iizuka et al. informaron que un feniletanoide, forsythiaside, del fruto de Forsythia suspensa inhibía las contracciones inducidas por noradrenalina en preparaciones de anillo aórtico de rata y sugirieron que la inhibición por forsythiaside de la contracción inducida por noradrenalina se debe en parte a una disminución en la contracción inducida por noradrenalina. entrada de calcio.20 Sin embargo, en el presente estudio, los efectos relajantes de los componentes activos se observaron ca. 30 min después de la adición de noradrenalina de una manera diferente a la prazosina, un antagonista de los receptores1-de adrenalina. Los mecanismos de acción de los constituyentes activos deben estudiarse más a fondo.

3. experimental

3.1. Procedimiento experimental general

Para la obtención de los datos físicos se utilizaron los siguientes instrumentos: rotaciones específicas, polarímetro digital Horiba SEPA-300 (l=5 cm); espectros UV, espectrómetro Shimadzu UV-1600; espectros IR, espectrómetro Shimadzu FTIR-8100; espectros de RMN 1H, espectrómetro JEOL JNM-LA500 (500 MHz); espectros de RMN de 13C, espectrómetro JEOLJNM-LA500 (125 MHz) con tetrametilsilano como patrón interno; FABMS y HR-FAB MS, espectrómetro de masas JEOL JMS-SX 102A; Detector HPLC, Shimadzu RID-6A índice de refracción y detectores UV-vis SPD 10A. Se utilizaron columnas de HPLC, YMC-PackODS-A (250 · 4,6 mm de d.i.) y (250 · 20 mm de d.i.) con fines analíticos y preparativos, respectivamente

Se usaron las siguientes condiciones experimentales para la cromatografía: cromatografía en columna de gel de sílice de fase normal, gel de sílice BW-200 (Fuji Silysia Chemical, Ltd, malla 150–350); cromatografía en columna de gel de sílice de fase inversa, Chromatorex ODS DM1020T (FujiSilesia Chemical, Ltd, malla 100–200); TLC, placas de TLC prerrecubiertas con gel de sílice 60F254 (Merck, 0,25 mm) (fase normal) y gel de sílice RP-18 F254S (Merck, 0,25 mm) (fase inversa); HPTLC de fase inversa, placas de TLC prerrecubiertas con gel de sílice RP-18 WF254S (Merck, 0,25 mm); la detección se logró rociando con 1 por ciento de Ce(SO4)2–10 por ciento de H2SO4 acuoso, seguido de calentamiento.

Cistanche tubulosa

3.2. Material vegetal

tallos secos deCistanche tubulosafueron adquiridos en Urumqi, provincia de Xinjiang, China, en enero de 2005 a través de EishinTrading Co., Ltd, Osaka, Japón, como se describió anteriormente.1

3.3. Extracción y aislamiento

Fracciones {{0}} (590 mg), 2-1 (466 mg), 2-3 (3931 mg), 3-3(3610 mg), 3-4 (190 mg), 4-5 [=echinacósido (4, 2595 mg, 0,44 por ciento)], 4-6 (1635 mg), 5-2 (1114 mg), {{ 20}} (306 mg), 5-4(347 mg), 5-5 (=4, 1620 mg, 2,03 por ciento) y 5-6 (1453 mg) se obtuvieron de el extracto metanólico de tallos deCistanche tubulosacomo se informó anteriormente.1 La fracción 1-2 (590 mg) se purificó mediante HPLC [MeOH/H2O (35:65, v/v)] para dar 3-metilbutanol bD-glucopiranósido (18 mg , 0.0030 por ciento ), ( más )-pinoresinol 40-ObD-glucopir anósido (96 mg, 0. 016 por ciento) y (más) siringaresinol 40-O bD-glucopiranósido (129 mg, 0.022 por ciento) junto con cistanoclorina (21 mg, {{ 76}}.{{80}}035 por ciento). La fracción 2-1 (466 mg) se separó por HPLC [MeOH/H2O (5:95, v/v)] para dar (2R,3R)-butano-2,{{40 }}diol 2-ObD-glucopiranósido (12 mg, {{1{{108}}4}}.0087 por ciento), (2R, 3S)-butano-2,3-diol 2-ObD glucopiranósido (9 mg, 0.0065 por ciento) y etilo bD -gluco piranósido (76 mg, 0.055 por ciento) junto con uridina (0.0069 por ciento). La fracción 2-2 (535 mg) se purificó por HPLC [MeOH/H2O (5:95, v/v)] para producir salidroside (11, 41 mg, 0,022 por ciento) junto con antirrhide (15 mg, 0,0079 por ciento) y6-desoxicatalpol (214 mg, 0,11 por ciento). La fracción 2-3(535 mg) se separó por HPLC [MeOH/H2O (5:95, v/v)] para proporcionar 11 (17 mg, 0,022 por ciento) junto con gluro side (110 mg, 0,14 por ciento) y bartsiósido (164 mg, 0,21 por ciento). La fracción 3-3 (510 mg) se sometió a HPLC [MeOH/H2O (40:60, v/v)] para dar acteósido (5, 257 mg, 0,31 por ciento), isoactósido (6, 79 mg, 0,096 por ciento) y 20-acetilactósido (7, 14 mg, 0,017 por ciento). La fracción 3-4 (190 mg) se purificó adicionalmente por HPLC [MeOH/H2O (40:60, v/v)] para dar kankanosida G (2, 17 mg, 0,0029 por ciento) y tubuloside B (9, 21 mg, 0,0036 por ciento). La fracción 4-6 (75 mg) se purificó mediante HPLC [MeOH/H2O (35:65, v/v)] para producir 5 (18 mg, 0,065 por ciento). La fracción 5-2 (1114 mg) se sometió a HPLC [MeOH/H2O (10:90, v/v)] para dar 2 (24 mg, 0,030 por ciento). La fracción 5-3 (306 mg) se purificado por HPLC [MeOH/H2O (15:85, v/v)] para dar kankanosido F (1, 13 mg, 0,016 por ciento). La fracción 5-4 (347 mg) se sometió a HPLC [MeOH/H2O (10:90, v/v)] para dar kankanosa (3, 30 mg, 0,038 por ciento) y cistanosido F (10, 20 mg, 0,025 por ciento). La fracción5-6 (530 mg) se purificó mediante HPLC [MeOH/H2O (35:65, v/v)] para producir 4 (185 mg, 0,62 por ciento), 5 (91 mg, 0,30 por ciento) y tubulosido A (8, 16 mg, 0,052 por ciento).

3.3.1. Kankanósido F (1).

Un polvo blanco, ½a{{0}}D -44.8- (c0.50, MeOH). FAB-MSm/z de iones positivos de alta resolución: Calculado para C26H40O17Na (M más Na) más , 647,2163. Encontrado: 647,2160. UV [MeOH, nm (log e)]: 224 (3,83), 283 (3,37). IR (KBr): 3432, 2940, 1560, 1508, 1458,1075, 1044 cm-1. RMN 1H (500 MHz, CD3OD) d: dado en la Tabla 2. Datos RMN 13C (125 MHz, CD3OD) dC: dado en la Tabla 2. FAB-MS de iones positivos m/z: 647 (M más Na) más . FAB-MS de iones negativos m/z: 623 (MH), 477 (M-C6H11O4)-, 623 (M-C6H11O5)-, 623 (M-C12H21O9)-.

3.3.2. Kankanósido G (2).

Un polvo blanco, ½a{{0}}D -35.0-(c 0,80, MeOH). FAB-MSm/z de iones positivos de alta resolución: Calculado para C29H36O14Na (M más Na) plus, 631.2003. Encontrado: 631.1996. UV [MeOH, nm (log e)]: 329 (4,10).IR (KBr): 3432, 2924, 1709, 1638, 1518, 1447, 1264,1040 cm-1. RMN de 1H (500 MHz, CD3OD) d: en la Tabla 2. Datos de RMN de 13C (125 MHz, CD3OD) dC: en la Tabla 2. FAB-MS de iones positivos m/z: 631 (M más Na) más iones negativos FAB-MS m/z: 607 (MH)-, 461(M-C6H11O4).

3.3.3. Kankanosa (3).

Un polvo blanco, ½a{{0}}D -35.3- (c0.50, MeOH). FAB-MSm/z de iones positivos de alta resolución: Calculado para C27H38O18Na (M más Na) plus, 673,1956. Encontrado: 673,1959. UV [MeOH, nm (log e)]: 219 (4,10), 247 (3,96), 333 (4,21). IR (KBr): 3430, 2962, 1702,1639, 1611, 1458, 1264, 1071 cm-1. RMN de 1H (500 MHz, CD3OD) d: en la Tabla 3. Datos de RMN de 13C (125 MHz, CD3OD) dC: en la Tabla 3. FAB-MS de iones positivos m/z: 673 (M más Na) más . Iones negativos FABM-Sm/z: 649 (MH), 487 (M-C9H8O3)-, 325(M-C15H18O8)-.

Cistanche tubulosa

3.4. Desacilación enzimática de 2 y 4 con tanasa

Una solución de 2 (4.8 mg, 0.008 mmol) en H2O (1.0 mL) se trató con tanasa (3.7 mg, de Aspergillus oryzae , Wako Pure Chemical Ind., Ltd, Osaka, Japón) y la solución se agitó a 37 grados durante 24 h. Después de agregar EtOH a la mezcla de reacción, el solvente se eliminó a presión reducida y el residuo se purificó por HPLC [MeOH/H2O (35:65, v/v)] para proporcionar cistanosido G (12, 2,8 mg, 80 por ciento).16 un procedimiento similar, una solución de 4 (9,2 mg, 0,012 mmol) en H2O (2,0 ml) se trató con tanasa (7,5 mg) y la solución se agitó a 37 grados durante 24 h. El tratamiento de la mezcla de reacción como se describe anteriormente dio un residuo, que se purificó por HPLC [MeOH/H2O (15:85, v/v)] para proporcionar 1 (4,7 mg, 62 por ciento).

3.5. Hidrólisis alcalina y ácida de 2 y 3

Una solución de 2 y 3 (cada uno de 3,5 mg) en 1,4-dioxano acuoso al 50 por ciento (1,0 ml) se trató con KOH acuoso al 10 por ciento (1,{{30}} ml) y el conjunto se agitó a 37 °C durante 1 h, respectivamente. La eliminación del disolvente a presión reducida dio una mezcla de reacción, que se sometió a análisis HPLC [columna: YMC-Pack ODS-A, 250 · 4,6 mm di; fase móvil: MeOH/H2O (30:70, v/v); detección: UV (254 nm); caudal: 1,0 ml/min] para identificar el ácido cafeico (tR: 13,1 min). Luego, la mezcla de reacción de 3 se disolvió en HCl 1 M (2,0 ml) y se calentó a reflujo durante 3 h. Después de enfriar, la mezcla de reacción se extrajo con EtOAc. La capa acuosa se sometió a análisis HPLC en las siguientes condiciones, respectivamente: columna HPLC, KaseisorbLC NH2-60-5, 250 · 4,6 mm id (Tokyo Kasei Co., Ltd, Tokio, Japón); detección, rotación óptica [ShodexOR-2 (Showa Denko Co., Ltd, Tokio, Japón); fase móvil, CH3CN/H2O (85:15, v/v); caudal 0,8 ml/min]. La identificación de L-ramnosa y D-glucosa presentes en la capa acuosa se realizó por comparación de su tiempo de retención y rotación óptica con los de muestras auténticas, tR: 9,9 min (L-ramnosa, rotación óptica negativa) y 17,9 min (D-glucosa, rotación óptica positiva).

3.6. Actividad vasorrelajante

3.6.1. Preparación de tejidos.

Se sacrificaron ratas macho Sprague-Dawley con un peso de 250–350 g cortando ambas arterias carótidas bajo anestesia, y se aisló la aorta torácica y se cortó en tiras helicoidales (2–3 mm ·15–2{{25 }}mm). La solución salina fisiológica contenía NaCl (118,0 mM), KCl (4,7 mM), KH2PO4 (1,2 mM), MgSO4 (1,2 mM), CaCl2 (2,5 mM), NaHCO3 (25,0 mM) y D-glucosa (10,0 mM). La solución se aireó con una mezcla de gases de 95 por ciento de O2 y 5 por ciento de CO2 y se mantuvo a 37 grados. Para investigar la respuesta mecánica, cada preparación se suspendió en un baño de órganos (6 ml) y se sometió a una carga inicial de aproximadamente 1 g. Se permitió un período de equilibrio de una hora antes de la iniciación de los experimentos. Las contracciones se midieron isométricamente mediante un transductor de desplazamiento de fuerza (AD Instruments) y se registraron en un polígrafo.

3.6.2. Efecto inhibidor de la contracción inducida por dl-noradrenalina o K plus alto.

Después del equilibrio, se añadió al baño dl-nor-adrenalina (concentración final: 1 lM) o KCl 3 M (0,1 ml, concentración final de K plus: 54 mM). Los tejidos se lavaron tres veces y se equilibraron de nuevo después de que la contracción hubiera alcanzado el nivel máximo. La contracción sostenida se indujo nuevamente mediante la adición de dl-noradrenalina o KCl, y luego se aplicó el compuesto de prueba a 10-100 lM (noradrenalina) o 100 lM (K plus alto). Se consideró que la respuesta contráctil antes de la aplicación de la muestra de prueba era del 100 por ciento. El clorhidrato de prazosina y la nifedipina se utilizaron como compuestos de referencia.

3.6.3. Análisis estadístico.

Los valores se expresan como medios ± SEM. Para el análisis estadístico, se utilizó un análisis de varianza de una vía seguido de la prueba de Dunnett para el análisis de comparación múltiple. Los valores de probabilidad (p) inferiores a 0.05 se consideraron significativos.

Expresiones de gratitud

Esta investigación fue apoyada por el Programa 21 COE, el Proyecto Frontera Académica y una Subvención para la Investigación Científica del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón.

Referencias y notas

1. Este artículo es el número 19 de la serie 'Constituyentes bioactivos de las medicinas naturales chinas'. Para el artículo número 18, véase Xie, H.; Morikawa, T.; Matsuda, H.; Nakamura, S.; Muraoka, O.; Yoshikawa, M. Química. Farmacia Toro. 2006, 54, 669–675.
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19. Los espectros de RMN de 1H y 13C de 1–3 se asignaron con la ayuda de mejora sin distorsión por transferencia de polarización (DEPT), espectroscopia de correlación de filtro cuántico doble (DQF COSY) y coherencia cuántica múltiple heteronuclear (HMQC), conectividad de enlace múltiple heteronuclear (HMBC) experimentos.
20. Iizuka, T.; Nagai, M. Yakugaku Zasshi 2005, 125, 219–224.