El extracto de semilla de Phoenix Dactylifera L. exhibe efectos antioxidantes y atenúa la melanogénesis

Huey Chun Huang1 , Shr-Shiuan Wang2, Tsang-Chi Tsai3, Wang Ping Ko3 y Tsong-Min Chang2,*

Resumen:Antecedentes: Nunca se ha explorado el modo de acción del extracto de semilla de Phoenix dactylifera en el cuidado de la piel. Métodos: Las semillas de P. dactylifera L. se extrajeron mediante extracción ultrasónica. Las características antioxidantes del extracto se determinaron mediante 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) y ácido 2,2′-azino-di-(3-etilbenzotiazolina sulfónico) (ABTS plus) Ensayos y métodos de barrido. También se investigó el contenido fenólico total, la capacidad reductora, la quelación de iones de hierro (II) y las capacidades de eliminación de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares. Los efectos del extracto de semilla de P. dactylifera L. sobre la melanogénesis se evaluaron espectrofotométricamente mediante un ensayo de actividad de tirosinasa de hongos, determinación de actividad de tirosinasa intracelular y contenido de melanina. Los niveles de expresión de las proteínas relacionadas con la melanogénesis se analizaron mediante transferencia de Western. Resultados: Los resultados revelaron que P.dactylifera L.el extracto de semilla ejerció una capacidad antioxidante aparente y disminuyó significativamente el contenido intracelular de ROS en concentraciones de {{0}}.245 y 0.49 (mg/mL). Además, el extracto disminuyó la expresión del receptor de melanocortina 1 (MC1R), el factor de transcripción asociado a la microftalmía (MITF), la tirosinasa, la proteína relacionada con la tirosinasa-1 (TRP1) y la proteína relacionada con la tirosinasa-2 ( TRP2) e inhibió la melanogénesis en células B16F10. Conclusiones: Nuestros resultados revelaron que el extracto de semilla de P. dactylifera L. atenuó la melanogénesis en las células B16F10 mediante la regulación negativa de las vías de señalización de la proteína quinasa A (PKA). Por lo tanto, el extracto podría usarse como un tipo de agente blanqueador de la piel en productos para el cuidado de la piel.

Palabras clave: Phoenix dactylifera;tirosinasa; melanina; ROS; PKA

cistanche pharma especiales un tipo de agente para blanquear la piel.

1. Introducción

Los antioxidantes se han aplicado ampliamente para prevenir o tratar trastornos relacionados con el estrés oxidativo en los campos cosmético y dermatológico. En las últimas décadas, los antioxidantes también se han utilizado en la industria cosmética para prevenir o retrasar el envejecimiento de la piel. Se informa que los radicales libres y las especies reactivas de oxígeno (ROS) están asociados con varias enfermedades, como el envejecimiento y las enfermedades relacionadas con la edad [1]. Curiosamente, el daño de los radicales libres en la piel causado por el estrés de la radiación UV y las ROS juegan un papel importante en el proceso de fotoenvejecimiento de la piel [2,3]. Se informa que los antioxidantes interfieren con el proceso de oxidación al eliminar los radicales libres y las ROS o al quelar metales catalíticos de oxidación [4]. Por lo tanto, ha habido un aumento dramático en el número de aplicaciones de antioxidantes o suplementos nutricionales antioxidantes para reducir el estrés oxidativo o el daño inducido por el estrés oxidativo en el cuerpo [5,6]. Sin embargo, se ha demostrado que algunos antioxidantes químicos, como el ascorbato de sodio, el terc-butil hidroxianisol (BHA), el eritorbato de sodio y el terc-butil hidroxitolueno (BHT), promueven efectos cancerígenos en la salud humana [7]. Por lo tanto, el rápido crecimiento de los estudios sobre antioxidantes naturales derivados de plantas se ha producido en las últimas décadas. Es importante destacar que se encontró que los aumentos en el nivel de ROS pueden acelerar la pigmentación de la piel. Entre las ROS derivadas de melanocitos y queratinocitos, el óxido nítrico, NO, estimula la síntesis de melanina al mejorar los niveles de expresión de proteínas de tirosinasa y proteína relacionada con tirosinasa 1 (TRP1) [8,9]. El efecto de las ROS en la producción de melanina se ha estudiado utilizando varios antioxidantes, como la N-acetilcisteína, para suprimir la acción de la hormona estimulante de los melanocitos inducida por UVB (-MSH) [10].

La melanina es producida y secretada por los melanocitos que se distribuyen en la capa basal de la epidermis de la piel [11]. Los dos primeros pasos de la vía de la melanogénesis en humanos son la hidroxilación de L-tirosina a 3-4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) y la oxidación de L-DOPA a o-dopaquinona. La tirosinasa (EC 1.14.18.1) es una enzima limitante de la velocidad que cataliza las dos primeras reacciones durante la melanogénesis [12]. La melanina juega un papel vital en la protección de la piel contra el daño ultravioleta (UV) de la luz solar y también es responsable de teñir el cabello, la piel y los ojos. Se ha informado que varios trastornos dermatológicos, como manchas de la edad, melasma, melanodermia posinflamatoria, pecas y sitios de daño actínico, resultan de la acumulación de un nivel excesivo de melanina epidérmica [13]. Los inhibidores de la síntesis de melanina se han aplicado cada vez más en productos para el cuidado de la piel para el tratamiento o la prevención de trastornos de hiperpigmentación de la piel [14,15]. Además, los antioxidantes, como la arbutina o el ácido kójico [16], se han utilizado en el tratamiento de la hiperpigmentación [17]. Recientemente, los cosméticos para blanquear la piel han representado una gran proporción de productos cosméticos. No solo las mujeres con piel oscura, sino también aquellas que están tratando de hacer frente a las manchas oscuras en la piel que surgen de la luz ultravioleta, el embarazo o el aumento de la edad, utilizan ampliamente estos productos para blanquear la piel.

La melanogénesis está regulada por múltiples factores. Por ejemplo, se informó que la proteína relacionada con la tirosinasa-1 (TRP1), el factor de transcripción asociado a la microftalmía (MITF) y la proteína relacionada con la tirosinasa-2 (TRP2) regulan la producción de melanina [18–20 ]. El receptor de melanocortina 1 (MC1R) también ocupa un lugar destacado en la síntesis de melanina inducida por -MSH [21]. Hay varias vías de señalización involucradas en la producción de melanina. Entre las diferentes vías de señalización que regulan la producción de melanina, la activación de la proteína quinasa A (PKA) mediada por AMP cíclico (cAMP) juega un papel fundamental en la regulación de la melanogénesis [22]. En la vía de señalización de cAM-PKA, cAMP induce la activación de PKA [23], que es seguida por la fosforilación de la proteína de unión al elemento de respuesta cAMP (CREB). CREB es un factor de transcripción intracelular que estimula la expresión del gen del factor de microftalmía (MITF), que es importante en la melanogénesis. MITF es un factor de transcripción que se une a las regiones promotoras de los genes melanogénicos tirosinasa, TRP1 y TRP2, aumentando su expresión [24,25]. Posteriormente, aumenta el contenido de melanina intracelular [26]. Se ha informado que -MSH aumenta los niveles de cAMP y generalmente se aplica para activar la fosforilación de CREB y luego mejorar los niveles de proteína MITF [27].

La expresión de MITF está regulada por varias vías de señalización. La quinasa N-terminal c-Jun (JNK) y la proteína quinasa activada por mitógeno p38 (MAPK) están implicadas en la activación de la expresión de MITF y el consiguiente aumento de la expresión de tirosinasa. Las señales de activación de la quinasa de respuesta extracelular (ERK) también aumentan la fosforilación de CREB y la posterior expresión de MITF, que modula la síntesis de melanina [28,29]. Por lo tanto, se informó que varios agentes blanqueadores de la piel inhiben la actividad transcripcional de MITF al disminuir los niveles de expresión de proteínas de tirosinasa, TRP1 y TRP2 a través de la regulación negativa de la fosforilación de MITF mediada por p38MAPK. Además, se ha descrito que la vía ERK está implicada en la regulación de MITF durante la melanogénesis [30,31]. La activación de ERK fosforila MITF, lo que conduce a la degradación de MITF, lo que resulta en una reducción del contenido de melanina [32,33].

El estrés oxidativo puede ser el resultado de una sobreproducción de ROS o de una disminución de las defensas antioxidantes [1]. La búsqueda y las aplicaciones de los antioxidantes naturales siguen siendo el foco de atención de numerosos equipos de investigación en todo el mundo. Recientemente, ha habido un interés creciente en la investigación y el desarrollo de fitoquímicos, como antioxidantes naturales y compuestos fenólicos de diversas fuentes naturales, que podrían usarse como nutracéuticos, cosméticos antienvejecimiento y productos medicinales [34]. Phoenix dactylifera L. es uno de los principales cultivos frutales producidos en el Medio Oriente y África del Norte [35,36]. Estudios previos han informado que las frutas de P. dactylifera L. exhiben actividades antioxidantes, eliminadoras de radicales libres, antimicrobianas y antiinflamatorias [37,38]. Los efectos funcionales de P. dactylifera L. no solo se limitan a los frutos en sí, sino también a sus semillas, que son una especie de subproducto de los frutos [39,40]. Debido a sus propiedades antioxidantes, los extractos de semillas de P. dactylifera L. podrían servir como fuente de sustancias antioxidantes que actúan contra el estrés oxidativo [41–43]. Sin embargo, se han realizado pocos estudios sobre las aplicaciones de las semillas de P. dactylifera L. para el desarrollo de productos cosmecéuticos. Estas semillas generalmente se descartan como desechos, pero aquí se destaca su importancia como ingrediente cosmético funcional. Hasta la fecha, no ha habido informes sobre el mecanismo de acción del extracto de semilla de P. dactylifera L. en el campo de los cosméticos para el cuidado de la piel o los efectos del extracto de semilla sobre la producción de melanina. El objetivo del presente estudio fue determinar el potencial del extracto de semilla de P. dactylifera L. como inhibidor de la melanogénesis para la industria cosmética.

Los mecanismos subyacentes a los efectos inhibidores del extracto de semilla de P. dactylifera L. sobre la melanogénesis aún no se han investigado. El objetivo del presente estudio fue investigar las características antioxidantes y los posibles mecanismos de acción del extracto de semilla de P. dactylifera L. sobre la melanogénesis mediante el examen de los reguladores de la transcripción MITF y la fosforilación de los reguladores de las vías de señalización MAPK y PKA.

cistanche fresco

2. Materiales y métodos

2.1. Sustancias químicas y reactivos

Los reactivos químicos utilizados en el estudio se adquirieron de Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MS, EE. UU.). Los anticuerpos eran de Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA, EE. UU.) y el reactivo ECL era de Millipore (Billerica, MA, EE. UU.).

2.2. Preparación y extracción de extracto de semilla de P. dactylifera

Los frutos secos de P. dactylifera L. se cosecharon en 2019 de tiendas tradicionales ubicadas en la ciudad de Medina, Arabia Saudita. Las semillas de P. dactylifera L. se lavaron completamente, se expusieron a la luz solar, se secaron al aire durante un día y luego se secaron a 80 ◦C durante 2 h en una estufa. Las semillas deshidratadas se pulverizaron hasta obtener un polvo fino (malla #50) con un molino comprometido (Molino ultracentrífugo y máquina tamizadora Retsch, Tipo ZM1, Haan, Alemania). El polvo se recogió en una botella de vidrio sellada y se almacenó a 25 ◦C hasta su uso. El polvo de semilla de P. dactylifera L. desecado pulverizado (2 g) se colocó en un vaso de precipitados de extracción que contenía 10 ml de agua destilada. A continuación, se realizó la extracción ultrasónica con el modelo ULTRAsonikTM 57H (250 W, C y A Sales Industrial Supplies, Yucaipa, CA, EE. UU.). La frecuencia de trabajo fue de 45 kHz durante 30 min. Tras la extracción, las muestras se centrifugaron a 4500 rpm durante 50 min a 25 ◦C con una Eppendorf Centrifuge 5810 R (Hamburgo, Alemania). Los sobrenadantes se recogieron y filtraron con un filtro de nailon (tamaño de poro: 0,45 μm) y el filtrado se concentró a 9,8 mg/mL.

2.3. Análisis de cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) de extracto de semilla de P. dactylifera y ácido ferúlico

El extracto de semilla de P. dactylifera se analizó utilizando un ACQUITY UPLC clase H con un detector de matriz de fotodiodos (Waters, Milford, MA, EE. UU.). La columna era una columna ACQUITY UPLC BEH C18, 130 Å, 1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm. La fase móvil A era ácido acético al 0,5 por ciento y la fase móvil B era acetonitrilo. Para los puntos de tiempo 0 y 5 min, la relación porcentual de A/B fue 95/5; durante 20 min, la relación porcentual de A/B fue 5/95; para los puntos de tiempo 21 y 25 min, la relación porcentual de A/B fue 95/5. Se utilizó ácido ferúlico (1 ppm) como patrón positivo.

2.4. Ensayo de actividad de eliminación de DPPH

En este ensayo, se usaron vitamina C ({{0}},5 mg/mL) y BHA (0,1 mg/mL) como estándares antioxidantes. El extracto de semilla de P. dactylifera L. en varias concentraciones (0.0049, 0,0245 y 0,049 mg/ml) se añadió a 2,9 ml de solución de DPPH (60 μM). Los componentes antioxidantes en el extracto de semilla podrían donar hidrógeno a DPPH y convertir DPPH a la forma reducida. La disminución resultante de la absorbancia a 517 nm se registró utilizando un espectrofotómetro UV-Vis [44].

2.5. Ensayo de capacidad de barrido ABTS plus

La capacidad de eliminación de ABTS plus del extracto de semilla de P. dactylifera L. se comparó con la de la vitamina C ({{0}}.9 mg/mL) y BHA ({{10}}. 9 mg/mL). Para este ensayo, se utilizó ABTS plus. Primero se produjo el catión haciendo reaccionar la solución de ABTS (7 mM) con persulfato de potasio (2,45 mM), y la mezcla se dejó reposar en la oscuridad durante al menos 6 h antes de su uso. La absorbancia a 734 nm se midió 10 min después de mezclar diferentes concentraciones del extracto de semilla (0,0098, 0,049 y 0,098 mg/ml) con 1 ml de solución ABTS plus [45].

2.6. Determinación del contenido fenólico total

El contenido de fenoles totales se determinó mediante el reactivo de Folin-Ciocalteu [46], y se empleó ácido gálico (2 ug/mL) como estándar positivo. Se prepararon diferentes concentraciones de extracto de semilla de P. dactylifera L. (0.0196, 0.098 y 0,196 mg/mL) en metanol al 80 por ciento; Se transfirieron 100 μL de extracto a un tubo de ensayo y se añadieron 0,5 mL de reactivo de Folin-Ciocalteu (previamente diluido 10-veces con agua desionizada) y se mezcló. La mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 5 min; Se añadieron 1,5 ml de carbonato de sodio al 20 por ciento. Después de permanecer a temperatura ambiente durante 2 h, se leyó la absorbancia a 760 nm usando un espectrofotómetro UV-Vis.

2.7. Determinación de la capacidad reductora

La vitamina C ({{0}}.008 mg/ml) o BHA (4,8 mg/ml) se utilizaron como estándares positivos en este ensayo. La capacidad reductora del extracto de semilla se determinó según el método descrito por Oyaizu [47]. Se mezclaron varias concentraciones de extracto de semilla de P. dactylifera L. (0.0073, 0,036, 0,073 mg/ml) con tampón de fosfato (2,5 ml, 0,2 M, pH 6,6 ) y ferricianuro de potasio [K3Fe (CN)6] (2,5 ml, 1 % p/v). La mezcla se incubó a 50 ◦C durante 20 min. Se añadió ácido tricloroacético (2,5 ml, 10 % p/v) a la mezcla, que luego se centrifugó a 1000 × g durante 10 min. La capa superior de solución (2,5 ml) se mezcló con agua destilada (2,5 ml) y FeCl3 (0,5 ml, 0,1 % p/v) y se midió la absorbancia a 700 nm.

2.8. Medición de la capacidad quelante de iones de hierro (II)

Para la medición de la capacidad quelante de iones Fe2 más - del extracto de semilla de P. dactylifera L., EDTA (0.02, 0.04 y { {10}}.08 mg/ml) se utilizó como estándar positivo. Se agregaron diferentes concentraciones del extracto de semilla (0.0196, 0.098 y 0.196 mg/mL) a una solución de FeCl2 (0.05 mL, 1 mM). La mezcla de reacción se hizo reaccionar con ferrozina (0,1 mL, 1 mM), luego la mezcla se cuantificó a 1 mL con metanol y se incubó a 25 ◦C durante 10 min. La absorbancia de la mezcla de reacción se midió a 562 nm [48].

2.9. Ensayo de viabilidad celular

El ensayo de viabilidad celular se realizó utilizando el método MTT [49]. Las células fueron expuestas a varias concentraciones de extracto de semilla de P. dactylifera L. (0.049, 0.245 y 0.49 mg/mL) durante 24 h a 37 ◦C y 5 por ciento de CO2 en una incubadora humidificada y se añadió la solución de MTT a los pocillos. El derivado insoluble de MTT se solubilizó con etanol-DMSO (solución mixta 1:1). La absorbancia de los pocillos a 570 nm se midió utilizando un lector de microplacas. Las células B16F10 (BCRC60031) se obtuvieron del Centro de Investigación y Recolección de Biorecursos (BCRC), ciudad de Hsinchu, Taiwán. Las células se mantuvieron en DMEM (Hyclone, Logan, UT, EE. UU.) complementado con suero bovino fetal al 10 por ciento y antibióticos al 1 por ciento. Además, el efecto de la semilla de P. dactylifera L. sobre la viabilidad de las células B16F10 también se evaluó mediante el método de ensayo de exclusión con azul de tripano. Después del tratamiento con el extracto de semillas, las células se tripsinizaron y centrifugaron para recoger el sedimento. El sedimento celular se resuspendió en 300 μl de medio de cultivo celular DMEM. Una pequeña alícuota de suspensión celular (20 μL) se mezcló suavemente con 10 μL de azul de tripano (4 por ciento en PBS). Se contó el número de células (las células no viables eran azules y las células viables no se tiñeron) usando un hemocitómetro bajo el microscopio.

2.10. Medición de la actividad de tirosinasa de hongos

La solución de tirosinasa de hongos (10 μL, 200 unidades) se añadió a una microplaca de 96-pocillos. La mezcla de reacción contenía 5 mM de L-DOPA disuelta en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (50 mM, pH 6,8) y extracto de semilla de P. dactylifera L. (00,049, 0,245 , y 0,49 mg/ml), ácido kójico (200 mM; 0,03 mg/ml) o arbutina (2 mM; 0,54 mg/ml). La mezcla de ensayo se incubó a 37 ◦C durante 30 min y la absorbancia del dopacromo producido se midió a 490 nm. La medición de la actividad de la tirosinasa de hongos se realizó como se describió anteriormente [50].

2.11. Determinación del contenido de melanina

Las células B16F10 se trataron con -MSH (100 nM) durante 24 h y luego se trataron con extracto de semilla de P. dactylifera L. (0,0245–0,147 mg/ml) o arbutina (0,54 mg/ml) durante 24 h más. Después del tratamiento, los sedimentos celulares se solubilizaron en solución de NaOH (1 N) a 60 ◦C durante 60 min. El contenido de melanina se detectó a 405 nm, como describió anteriormente Tsuboi [51].

Cistanche inhibe la producción de melanina.

2.12. Medición de la actividad de tirosinasa intracelular

La actividad de tirosinasa intracelular se determinó como se describió anteriormente [52]. Las células se trataron con -MSH (100 nM) durante 24 h y luego con extracto de semilla de P. dactylifera L. (0.0245–0,147 mg /mL) o arbutina (0,54 mg/mL) durante 24 h. Después del tratamiento, los extractos celulares (100 μL) se mezclaron con solución de L-DOPA recién preparada (0,1 por ciento en PBS) y se incubaron a 37 ◦C, y se midió la absorbancia a 490 nm.

2.13. Experimento de transferencia Western

Las células se trataron con extracto de semilla de P. dactylifera L. ({{0}}.0245, 0.0368, 0.{ {14}}49 y 0.147 mg/mL) o arbutina (0.54 mg/mL) y luego lisado en PBS que contiene P-40 no dietético (1 por ciento), desoxicolato de sodio (0.5 por ciento), dodecil de sodio sulfato (SDS, 0,1 por ciento), aprotinina (5 ug/ml), fluoruro de fenilmetilsulfonilo (100 ug/ml), pepstatina A (1 ug/ml) y EDTA (1 mM) a 4 ◦C durante 20 min. Los lisados ​​​​totales se cuantificaron utilizando un kit micro BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Las proteínas (30 ug) se resolvieron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y se transfirieron electroforéticamente a una membrana de fluoruro de polivinilideno. La membrana se bloqueó en leche descremada al 5 % en PBST (PBS con 0,05 % de Tween-20) y se incubó a 4 ◦C durante la noche con los siguientes anticuerpos primarios diluidos en PBST: MITF Ab (1:1000), TRP1 Ab (1:6000), TRP2 Ab (1:1000), MC1R Ab (1:500), GAPDH Ab (1:1500), tirosinasa Ab (1:2000), p-p38 Ab (1:500), p38 Ab (1:500), p-JNK Ab (1:500), JNK Ab (1:500), p-ERK Ab (1:500), ERK Ab (1:500), p-CERB Ab (1: 500) y CERB Ab (1:200), todos de Santa Cruz Biotech (Dallas, TX, EE. UU.)). Los anticuerpos unidos se detectaron mediante anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (Amersham Corp.) seguido por el sistema de detección ECL (Amersham) según las instrucciones del fabricante.

2.14. Ensayo de inhibidor de PKA

Las células se trataron con -MSH (100 nM) durante 24 h seguido de una adición de 10 μM del regulador PKA H89 durante 1 h. Después del tratamiento, se añadieron a las células extracto de semilla de P. dactylifera L. (0,147 mg/ml) y H89 y se incubaron durante 23 h adicionales. El contenido de melanina se determinó como se describe anteriormente.

2.15. Análisis estadístico

El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando la prueba post hoc de Tukey, que se utilizó para las comparaciones de los datos medidos, utilizando el Paquete Estadístico para las Ciencias Sociales (SPSS) versión 22.0 software estadístico (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU). * p < 0.05="" se="" consideró="" significativo,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p=""><>

3. Resultados

3.1. Análisis UPLC del extracto de semilla de P. dactylifera L.

Los resultados del análisis UPLC se muestran en la Figura 1A, B. La Figura 1A representa el pico superpuesto del extracto de semilla de P. dactylifera L. y el ácido ferúlico a 330 nm. La Figura 1B muestra espectros de escaneo similares entre 220 y 500 nm para extracto de semilla de P. dactylifera L. y ácido ferúlico.

3.2. Características antioxidantes del extracto de semilla de P. dactylifera L.

La actividad antioxidante del extracto de semilla de P. dactylifera L. in vitro reveló la presencia de potencial antioxidante. En el ensayo DPPH, vitamina C ({{0}}.05 mM; 0.53 mg/mL) y terc-butil hidroxianisol (BHA) (0 0,1 mg/mL) como estándares antioxidantes positivos. La capacidad de eliminación de DPPH del extracto fue del 49,97 ± 2,9 por ciento, 81,36 ± 0,56 por ciento y 78,53 ± 3,83 por ciento del control para las concentraciones de extracto de 0.0{{ 31}}49, 0,0245 y 0,049 (mg/mL), respectivamente. En comparación, las capacidades de eliminación de vitamina C y BHA fueron 90,12 ± 0,31 por ciento y 90,44 ± 0,49 por ciento, respectivamente (Figura 2A).

Este catión radical ABTS es de color azul y es reactivo con la mayoría de los antioxidantes. Durante esta reacción, el catión radical ABTS azul se vuelve a convertir en su forma neutra incolora. La reacción se controló espectrofotométricamente. La capacidad de eliminación de ABTS plus del extracto fue de 5,69 ± 1,36 %, 18,81 ± 0,68 % y 66,82 ± 8,51 % del control en concentraciones de 0.0{{16 }}98, 0.{{20}}49 y 0.098 mg/mL, respectivamente. Por el contrario, las capacidades de eliminación de ABTS más vitamina C (0,9 mg/mL) y BHA (0,9 mg/mL) fueron 95,52 ± 0,12 por ciento y 40,3 ± 0,83 por ciento, respectivamente. Los resultados en la Figura 2B indican que el extracto de semilla elimina una cantidad significativa del radical ABTS plus.

Para determinar el contenido fenólico total del extracto de semilla de P. dactylifera L., se utilizó ácido gálico (2 ug/mL) como estándar positivo. Los resultados en la Figura 2C indican que el contenido fenólico total en 0.0196, 0.{{20}}98 y 0. 196 (mg/ml) del extracto fueron 33,43 ± 2,33 por ciento, 117,22 ± 7,81 por ciento y 195,4 ± 10,91 por ciento, respectivamente. Los equivalentes de ácido gálico (GAE) de las concentraciones antes mencionadas de extractos de semillas fueron 0.068 ± 0,01, 0,365 ± 0,01 y 0,642 ± 0,03, respectivamente (Figura 2C).

3.3. Efectos inhibitorios del extracto de semilla de P. dactylifera L. sobre la melanogénesis

Los resultados que se muestran en la Figura 4A demuestran que 0.049 mg/mL de extracto de semilla de P. dactylifera L.no ejerció un efecto inhibidor sobre la actividad de la tirosinasa de hongos. Por otro lado, los porcentajes de inhibición enzimática fueron 8.34 ± 2.67 por ciento y 33 ± 2.36 por ciento del control para 0.245 y 0.49 mg/mLTratamientos con extracto de semilla de P. dactylifera L., respectivamente. Además, los porcentajes de inhibición de tirosinasa de ácido kójico (200 μM; 0.03 mg/mL) y arbutina (2 mM; 0,54 mg/mL ) fueron 56,26 ± 5,06 por ciento y 64,56 ± 2,88 por ciento del control, respectivamente (Figura 4A). Por lo tanto, las concentraciones más altas de extracto de semilla de P. dactylifera L. (0.245 y 0.49 mg/mL) podrían representar niveles inhibidores de tirosinasa de hongos.

En la Figura 4B, los resultados indicaron que solo 0.147 mg/mL de extracto de semilla de P. dactylifera L. podría disminuir significativamente el contenido de melanina en las células de melanoma B16F10. Después del tratamiento, el contenido de melanina en las células B16F10 fue del 80,66 ± 5,43 por ciento del control. Para el estándar positivo, arbutina (0.54 mg/mL), el contenido de melanina intracelular restante fue 61.19 ± 8.17 por ciento del control. Los resultados indicaron que 0.147 mg/mL de extracto de semilla de P. dactylifera L. mostró efectos menores que la arbutina. Los valores restantes de actividad de tirosinasa intracelular fueron 85,1 ± 8,1 por ciento y 73,7 ± 11,9 por ciento para los 0,098 y 0,147 mg/mL de extracto de semilla de P. dactylifera L., respectivamente. La actividad de tirosinasa intracelular restante fue del 64,3 ± 14,9 por ciento del control después de tratar las células con arbutina (Figura 4C). Los resultados indicaron que las concentraciones más altas de extracto de semilla de P. dactylifera L. todavía exhibieron un efecto inhibidor más pequeño sobre la actividad de tirosinasa inducida por -MSH en células B16F10 que la arbutina.

3.4. El extracto de semilla de P. dactylifera L. inhibe los niveles de expresión de las proteínas implicadas en la melaninogénesis

Se usaron transferencias Western para examinar los niveles de expresión de proteínas relacionadas con la melanogénesis en células B16F10 (Figura 5A). Los resultados indican que el tratamiento con varias concentraciones de extracto de semilla de P. dactylifera L. condujo a niveles reducidos de MC1R, MITF, tirosinasa, TRP1 y TRP2. Los efectos inhibitorios del extracto sobre la expresión de proteínas fueron evidentes a una concentración de {{10}}.147 mg/mL. El cambio de veces en el nivel de expresión de proteína para MC1R fue 0.74 ± 0.02; para MITF fue {{20}}.51 ± 0.03; para tirosinasa fue 0.54 ± 0.26; para TRP-1 fue 0,57 ± 0,15; y para TRP-2 fue de 0,49 ± 0,1 (Figura 5B).

Los niveles de expresión de las proteínas de señalización relacionadas con la melanogénesis se examinaron mediante transferencias Western (Figura 5C). Los resultados indican que 0.147 mg/mL de tratamiento con extracto de semilla de P. dactylifera L. aparentemente condujo a niveles reducidos de p-p38, p-JNK, p-ERK y p-CREB. El cambio en veces del nivel de expresión de proteína para p-p38 fue 0.88 ± 0.15; para p-JNK fue 0.68 ± 0.39; para p-ERK fue 0.65 ± 0.23; y para p-CREB fue 0.44 ± 0.07 (Figura 5D).

3.5. El extracto de semilla de P. dactylifera L. no afecta la expresión génica de tirosinasa, TRP1, TRP2 o MITF

Los niveles de expresión génica de las proteínas relacionadas con la melanogénesis, como la tirosinasa, TRP1, TRP2 y MITF, se examinaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-PCR). Los niveles de expresión normalizados relativos de tirosinasa/GAPDH para 0.0367, 0.049 y 0.147 mg/mL de P. Los tratamientos con extracto de semilla de dactylifera L. fueron 3,51 ± 0,52, 2,38 ± 0,24 y 1,64 ± 0,55, respectivamente. Para TRP-1/GAPDH, los niveles de expresión normalizados relativos para 0.0367, 0.049 y {{4{{43} }}}.147 mg/ml de extracto de semilla de P. dactylifera L. Los tratamientos fueron 1.64 ± 0.2, 1.15 ± 0.02 y 0. 89 ± 0.07, respectivamente. Los niveles de expresión normalizados relativos de TRP-2/GAPDH para 0.0367, 0.049 y 0.147 mg /ml de extracto de semilla de P. dactylifera L. fueron 1,08 ± 0,13, 0,85 ± 0,01 y 0,7 ± 0,05, respectivamente. Para MITF/GAPDH, los niveles de expresión normalizados relativos para 0,0367, 0,049 y 0,147 mg/mL de tratamientos con extracto de semilla de P. dactylifera L. fueron 1,48 ± 0,19, 1,03 ± 0,02 y 0,74 ± 0,05, respectivamente (Figura 6).

4. Discusión

Se ha informado que la melanogénesis aumenta el estrés oxidativo celular. Además, varios antioxidantes, eliminadores de ROS, eliminadores de inhibidores e inhibidores pueden inhibir la síntesis de melanina mediada por UV [54]. Por lo tanto, los antioxidantes, los eliminadores de ROS y los inhibidores de la melanogénesis se han aplicado cada vez más a los cosméticos para blanquear la piel para la prevención de la hiperpigmentación cutánea no deseada [14]. También se encontró que la estimulación de la metalotioneína, un antioxidante endógeno, podría suprimir la melanogénesis en los melanocitos [55]. La piel humana está frecuentemente expuesta a contaminantes ambientales oxidantes o luz ultravioleta y es dañada por factores ambientales extrínsecos. En particular, se ha informado que la radiación UV induce la generación de ROS en la piel y promueve la peroxidación lipídica de la membrana celular [56]. Para contrarrestar el estrés oxidativo, la piel está equipada con sistemas antioxidantes particulares [57].

Para dilucidar la actividad antioxidante del extracto de semilla de P. dactylifera L., se determinó DPPH y ABTS más la actividad de eliminación de radicales, el contenido fenólico total, la capacidad reductora y la capacidad quelante de iones metálicos del extracto como se describió anteriormente [47,48]. El extracto de semilla de P. dactylifera L. ejerció considerables actividades antioxidantes en todos los estudios analíticos antes mencionados. Los resultados mostraron el potencial antioxidante del extracto de semilla de P. dactylifera L. en diferentes rangos con distintas eficiencias. La actividad de eliminación de DPPH del extracto de semilla que se muestra en la Figura 2A era diferente de la de ABTS plus que se muestra en la Figura 2B, lo que puede haber resultado de diferentes mecanismos de las interacciones antioxidante-radical. Además, la estequiometría de las reacciones entre los componentes antioxidantes en el extracto de semilla puede variar, lo que da como resultado una diferencia en la capacidad de eliminación de radicales libres [58]. Los antioxidantes potenciales en el extracto de semilla de P. dactylifera L. podrían convertir un complejo Fe3 plus/ferricianuro en la forma ferrosa, y la capacidad reductora sirvió como indicador de la actividad antioxidante del extracto de semilla que se muestra en la Figura 2D. Se encontró que el ácido kójico [59] actúa como un inhibidor de la tirosinasa porque el ácido kójico actúa como un quelante de metales para quelar los iones de cobre e inhibir que esos iones ingresen al sitio activo de la tirosinasa. Por lo tanto, los antioxidantes en el extracto de semilla pueden formar complejos metálicos insolubles con iones ferrosos y luego inhibir la interacción entre los iones metálicos y los lípidos. La mayor capacidad de quelación de iones metálicos del extracto de semilla indicó su potencial actividad antioxidante y posibles efectos inhibidores sobre la actividad de la tirosinasa (Figura 2E).

El principio del ensayo de ROS intracelular es que DCFH-DA se difunde a través de la membrana celular y se hidroliza enzimáticamente a DCFH por acción de la esterasa; luego DCFH reacciona con ROS (como H2O2) para producir DCF. Los aumentos rápidos en DCF indicaron la oxidación de DCFH por radicales intracelulares [60]. La idea detrás de la búsqueda de nuevos antioxidantes para las actividades de blanqueamiento de la piel se basa en la hipótesis de que el estrés oxidativo resultante de la radiación UV puede contribuir a la estimulación de la síntesis de melanina. Se ha informado que la radiación UV produce ROS en los tejidos cutáneos que pueden inducir la producción de melanina al activar la tirosinasa [61]. Además, se informó que varios agentes blanqueadores de la piel pueden inhibir la melanogénesis al interactuar con iones de cobre en el sitio activo de la tirosinasa o con o-quinonas para bloquear la polimerización de intermediarios en la vía sintética de la melanina [62]. Además, la vitamina C o la vitamina E pueden reducir la oxidación de las partículas de melanina preexistentes. Por lo tanto, estas vitaminas se han aplicado ampliamente en productos para blanquear la piel [63]. Curiosamente, nuestros resultados demostraron las características antioxidantes del extracto de semilla de P. dactylifera L., lo que indica que el extracto de semilla de P. dactylifera L. podría actuar como un ingrediente blanqueador de la piel en los cosméticos.

El ensayo MTT es un ensayo colorimétrico bien conocido que mide la actividad de las enzimas oxidorreductasas dependientes de NADH/NADPH celular que reducen el MTT a tintes de formazán de color púrpura. Este ensayo podría aplicarse para examinar la citotoxicidad potencial de agentes medicinales y materiales tóxicos, ya que estos agentes mejoran o inhiben la viabilidad celular. Los resultados que se muestran en la Figura 3A coincidieron con los del ensayo de exclusión con azul de tripano en la Figura 3B, lo que indica que el extracto de semilla de P. dactylifera L. no tuvo ningún efecto citotóxico sobre la viabilidad de las células de melanoma B16F10.

La tirosinasa de hongos se usa comúnmente como una enzima diana para la detección de posibles inhibidores de la melanogénesis. Primero se descubrió que el rango de dosificación ({{0}}.049–0.49 mg/mL) del extracto de semilla de P. dactylifera L. podía inhibir la actividad de la tirosinasa de hongos. Los resultados que se muestran en la Figura 4A indican que el extracto de semilla exhibió impactos inhibitorios más bajos sobre la actividad de la tirosinasa de hongos que el ácido kójico. La tirosinasa juega un papel importante en los dos primeros pasos de la vía de la melanogénesis. Para dilucidar el verdadero efecto inhibitorio del extracto de semilla de P. dactylifera L. sobre la producción de melanina, se determinaron el contenido de melanina B16F10 y la actividad de tirosinasa intracelular. Los resultados presentados en la Figura 4B indican que una mayor concentración de extracto de semilla de P. dactylifera L. ejerció un efecto inhibidor aparente sobre la formación de melanina. Los datos mostraron que el extracto de semilla de P. dactylifera L. realmente bloquea la melanogénesis en las células de melanoma. Con esto, los resultados presentados en la Figura 4C estaban de acuerdo con los resultados que se muestran en la Figura 4B. En los experimentos celulares antes mencionados, se utilizó -MSH como inductor para estimular la síntesis de melanina. Se informó que la MSH se une al receptor de melanocortina 1 (MC1R) y activa la adenilato ciclasa intracelular, que a su vez cataliza el ATP a cAMP y activa la PKA dependiente de cAMP. Los resultados en la Figura 5A revelaron que el extracto de semilla de P. dactylifera L. inhibía la expresión de MC1R, bloqueando así la producción de melanina inducida por la regulación positiva de AMPc intracelular mediada por -MSH. Además, la vía de señalización de PKA mediada por AMPc se inactivó y se inhibió la melanogénesis. Para confirmar la inferencia, llevamos a cabo los experimentos con inhibidores de PKA, y los datos que se muestran en la Figura 4D indicaron que el efecto inhibidor del extracto de semilla de P. dactylifera L. (0,147 mg/mL) sobre la melanogénesis en células B16F10 fue suprimido por H{{ 24}}tratamiento. H89 (N-[2-p-bromocinamilamino-etil]-5-isoquinolinasulfonamida) es un inhibidor selectivo y potente de la PKA. Los resultados indican que la señalización de PKA mediada por AMPc se vio afectada por el extracto de semilla de P. dactylifera L.

La tirosinasa, TRP1 y TRP2 son las tres enzimas principales que regulan la síntesis de melanina en las células de los mamíferos [64]. Además, MITF es el principal regulador transcripcional de la tirosinasa, TRP1 y TRP2, y es el regulador más importante de la pigmentación de los melanocitos [65]. Los resultados en la Figura 5A indican que el extracto de semilla de P. dactylifera L. disminuyó los niveles de expresión de estas proteínas relacionadas con la melanogénesis, inhibió la actividad de la tirosinasa y disminuyó el contenido de melanina en las células B16F10.

En este estudio, el extracto de semilla de P. dactylifera L. suprimió la fosforilación de CREB y la activación de PKA. Estos datos sugieren que la ruta cAMP-PKA puede ser responsable de la anti-melanogénesis inducida por el extracto de semilla de P. dactylifera L. (Figura 5C).

Se ha informado que las MAPK modulan la melanogénesis [66]. La familia MAPK comprende tres tipos de proteínas quinasas, incluida la quinasa de respuesta extracelular (ERK), la quinasa N-terminal c-Jun (JNK) y p38 MAPK. La p38 MAPK puede activar la proteína de unión al elemento de respuesta cAMP (CREB y CREB activa la expresión de MITF, que contribuye positivamente a la síntesis de melanina [67]. Los resultados en la Figura 5C proporcionan evidencia de que el extracto de semilla de P. dactylifera L. podría inactivar CREB, JNK y p38, que a su vez inhiben la expresión de MITF (Figura 5A).Estos resultados sugieren que el efecto antimelanogénico inducido por el extracto de semilla de Dactylifera L. puede estar mediado por la regulación a la baja de las vías de PKA. ocupan un lugar destacado en el inicio de varios trastornos de la piel, que incluyen descamación, arrugas e hiperpigmentación [68] Los resultados sugirieron que el extracto de semilla de P. dactylifera L. disminuyó la producción de melanina, lo que puede atribuirse al agotamiento de ROS intracelular.

Para evaluar el efecto del extracto de semilla de P. dactylifera L. en la producción de melanina celular, determinamos los niveles de ARNm en células B16F10 tratadas con -MSH y extracto de semilla de P. dactylifera L.. Las células tratadas con -MSH mostraron niveles aumentados de MITF, tirosinasa, TRP-1 y TRP-2, como se esperaba. Curiosamente, las células tratadas con extracto de semilla de P. dactylifera L. mostraron una reducción en la expresión de ARNm de estos genes relacionados con la melanogénesis. Sin embargo, no existió una diferencia estadísticamente significativa entre las columnas, lo que indicó que el extracto de semilla de P. dactylifera L. no afecta los niveles de expresión génica de MITF, tirosinasa, TRP1 y TRP2.

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Se ha informado que el principal ácido fenólico que se encuentra en la semilla de P. dactylifera L. es el ácido ferúlico [69]. Se ha demostrado que el ácido ferúlico inhibe eficazmente la síntesis de melanina en las células de melanoma B16 al inhibir la fosforilación de la tirosinasa inducida por la caseína quinasa 2- de una manera dependiente de la dosis [70]. Estos informes respaldan nuestros resultados que se muestran en la Figura 1: el ácido ferúlico en el extracto acuoso de la semilla de P. dactylifera L. contribuyó a la inhibición de la melanogénesis en las células B16F10. Ciertamente, otros componentes funcionales en el extracto de semillas deben investigarse en un futuro próximo.

Nuestros resultados indicaron que el extracto de semilla de P. dactylifera L. inhibió la melanogénesis en las células B16F10 mediante la regulación negativa de las vías de señalización de PKA. Por lo tanto, el extracto de semilla de P. dactylifera L. podría usarse como un agente efectivo para blanquear la piel.

5. Conclusiones

Este es el primer informe sobre el mecanismo de acción del extracto acuoso de semilla de P. dactylifera L. en la síntesis de melanina. El presente estudio demostró la participación de la vía cAMP/PKA/CREB en el efecto despigmentante del extracto de semilla de P. dactylifera L. Nuestros resultados indicaron que el extracto de semilla de P. dactylifera L. inhibió la melanogénesis en las células B16F10 al regular a la baja las vías de señalización de PKA. Por lo tanto, el extracto de semilla de P. dactylifera L. podría usarse como un nuevo agente antimelanogénesis dermatológico y un agente efectivo para blanquear la piel.