Los nanoensamblajes fotosensibles de profármacos que albergan una función de latencia quimioterapéutica potencian la inmunoterapia contra el cáncer
Dec 25, 2023
Abstracto
La inmunoterapia combinada con terapias eficaces como la quimioterapia y la terapia fotodinámica es una estrategia exitosa para activar las respuestas inmunes antitumorales para mejorar el tratamiento contra el cáncer. Sin embargo, el desarrollo de nanoinmunoestimulantes transformados multifuncionales, biodegradables, biocompatibles, poco tóxicos pero altamente eficientes y clínicamente disponibles sigue siendo un desafío y tiene una gran demanda. En este documento, informamos y diseñamos un nuevo nanoprofármaco fotoquimioterapéutico sin portador COS-BA/Ce6 NP mediante la combinación de tres componentes multifuncionales, ácido betulínico (BA) de molécula pequeña natural autoensamblado, un oligosacárido de quitosano (COS) soluble en agua. y un fotosensibilizador de baja toxicidad clorina e6 (Ce6) para aumentar la eficacia antitumoral de la inmunoterapia contra el cáncer mediada por anti-PD-L1-adyuvante inmunológico. Mostramos que los nanofármacos diseñados albergaban una característica de "latencia" inteligente y distintiva en el efecto quimioterapéutico con una citotoxicidad más baja deseada y múltiples características terapéuticas favorables que incluyen una generación mejorada de 1 O2 inducida por la reducción de la brecha energética de Ce6, capacidad de respuesta al pH, buena biodegradabilidad y biocompatibilidad, asegurando una fotoquimioterapia sinérgica y altamente eficiente. Además, cuando se combinan con la terapia anti-PD-L1, tanto la quimioterapia basada en nanocoensamblajes como la quimioterapia/terapia fotodinámica (PDT) podrían activar eficazmente la inmunidad antitumoral en el tratamiento de tumores primarios o distantes, abriendo posibilidades potencialmente atractivas para la inmunoterapia clínica.
Beneficios de la cistanche tubulosa-Antitumoral
PALABRAS CLAVE
Inmunoterapia contra el cáncer; Nanoinmunoestimulantes; Latencia quimioterapéutica; Prodrogas; Autoensamblaje; Pequeña molécula natural; ácido betulínico; Terapia fotodinámica
1. Introducción
La inmunoterapia contra el cáncer, como la estrategia de bloqueo de los puntos de control inmunológico que utiliza PD-L1 o CTLA-4 para combatir el cáncer activando el sistema inmunológico del huésped, sin duda ha revolucionado el tratamiento del cáncer1,2. Desafortunadamente, la débil respuesta inmune y los efectos terapéuticos ineficaces limitaron en gran medida sus perspectivas clínicas3,4. Recientemente, los estudios actuales han revelado que una combinación de inmunoterapia con otras modalidades como quimioterapia5, terapia fotodinámica (PDT)6, terapia fototérmica (PTT)7 y radioterapia8, puede desencadenar eficazmente la inmunogenicidad antitumoral al inducir que las células cancerosas experimenten una muerte celular inmunogénica ( ICD)9, que sugiere el potencial de la modulación inmune para activar respuestas inmunes antitumorales. Numerosos diseños innovadores de nanomateriales basados en estas combinaciones sinérgicas de estrategias de inmunoterapia han logrado una actividad anticancerígena significativamente mejorada, incluidas nanopartículas (NP) inorgánicas10, poliméricas11 y biomiméticas12. Sin embargo, el desarrollo de nanoinmunoestimulantes transformados multifuncionales, biodegradables, biocompatibles, de baja toxicidad pero altamente eficientes y clínicamente disponibles sigue siendo un gran desafío y una gran demanda. Los materiales biológicos naturales como los ácidos nucleicos13, las proteínas12, los péptidos14,15 y los productos naturales de pequeño peso molecular16,17 debido a sus beneficios inherentes (p. ej., biocompatibilidad, no toxicidad) han despertado un importante interés en la investigación para aplicaciones médicas. Especialmente en los últimos años, se han descubierto sucesivamente pequeñas moléculas naturales (NSM) terpenoides bioactivas anticancerígenas que poseen una función de autoensamblaje18,19. Por ejemplo, el ácido betulínico (BA), el ergosterol (ET) y el ácido abiético (AA) pueden autoensamblarse en partículas micrométricas o nanoestructuradas. Estos NSM son componentes básicos atractivos para desarrollar agentes antitumorales para quimioterapia sinérgica y TFD. Se ha demostrado que exhiben beneficios significativos de fácil nanofabricación, mejor biocompatibilidad y biodegradabilidad, menor toxicidad con menor daño hepático y alto sinergismo en la terapia antitumoral20e23. Esto proporciona alternativas prometedoras para desarrollar nanoinmunoestimulantes traducibles clínicamente disponibles para la inmunoterapia sinérgica. Sin embargo, la lipofilicidad generalmente más fuerte de estas NSM condujo a una endocitosis celular ineficiente, lo que debilitó su actividad anticancerígena y limitó su valor clínico para el tratamiento del cáncer24. De manera similar a los nanocompuestos comúnmente reportados, las nanoformulaciones de NSM correspondientes promovieron la absorción celular para mejorar los efectos quimioterapéuticos, pero también aumentaron inadvertidamente el riesgo de citotoxicidad no específica para las células normales22. Por lo tanto, vale la pena pensar profundamente en cómo maximizar la eficacia anticancerígena de los nanoagentes terpenoides NSM y al mismo tiempo minimizar su toxicidad para el tejido normal como un tema crucial en el proceso de inmunoterapia sinérgica.
Beneficios de cistanche para hombres: fortalece el sistema inmunológico.
Se han aplicado ampliamente estrategias de profármacos para mejorar la absorción celular de pequeñas moléculas lipófilas mediante el aumento de la hidrofilicidad25. Generalmente, los fármacos anfifílicos poseen particularmente una mayor eficiencia de absorción celular que los fármacos hidrófilos o lipofílicos26. Cuanto mayor sea la fagocitosis celular, mejor será la eficacia terapéutica24. Por lo tanto, el desarrollo de moléculas profármaco de NSM terpenoides anfífilos puede ser un método potencial para maximizar sus efectos terapéuticos. Además, los nanofármacos que responden a estímulos del microambiente tumoral específico (p. ej., capacidad de respuesta al ácido, redox) son muy prometedores para controlar la liberación de fármacos, lo que resulta ventajoso para suprimir la citotoxicidad de los fármacos quimioterapéuticos27,28. Mientras tanto, el coensamblaje supramolecular (p. ej., un enfoque de reprecipitación) fue una estrategia eficaz para preparar nanofármacos sin portadores altamente solubles en agua22,29, que se podría esperar que disminuyeran ligeramente la eficiencia de fagocitosis de las NSM anfifílicas hasta cierto punto, atenuando así su pre- citotoxicidad diseñada. Nuestra hipótesis es que los nanofármacos totalmente hidrófilos y que responden a estímulos se establecieron aún más basándose en el profármaco de NSM anfifílicos y pueden suprimir eficazmente su citotoxicidad no específica para las células normales al tiempo que estimulan la liberación de NSM anfifílicos altamente tóxicos en las células tumorales, facilitando su latencia en tejidos normales y activación en el sitio del tumor. Es importante seleccionar el precursor apropiado, soluble en agua y que responda a estímulos, para modificar los NSM terpenoides y preparar moléculas de profármaco anfifílicas. Durante años, los oligosacáridos de quitosano (COS), como productos degradados del quitosano, no solo tienen buena solubilidad en agua y abundantes grupos eOH o NH2 que conducen a una buena respuesta de pH, sino que también tienen actividades antitumorales beneficiosas al mejorar la función inmune del huésped mediante la regulación de la actividad. de células inmunes como monocitos, macrófagos y linfocitos30,31. Estos garantizan la enorme posibilidad de construir nanoinmunoestimulantes objetivo que respondan a estímulos para la inmunoterapia sinérgica.
En este documento, con base en las consideraciones anteriores, en nuestro diseño experimental, se utiliza un triterpeno pentacíclico NSM de ácido betulínico (BA) como un potente agente anticancerígeno32, se introdujo COS para sintetizar una molécula anfifílica de COS-BA para mejorar el efecto quimioterapéutico. Se empleó cloro e6 (Ce6), un fotosensibilizador ampliamente utilizado con muy baja o nula toxicidad para la oscuridad33, para construir un profármaco fotosensible COS-BA/Ce6 sin portador completamente soluble en agua utilizando una estrategia de coensamblaje directo. Las NP COS-BA/Ce6 combinaron dos modalidades terapéuticas, quimioterapia y terapia fotodinámica (PDT), que pueden aumentar eficazmente la presentación de antígenos derivados de tumores a las células T, generando respuestas inmunológicas sólidas con la ayuda de un adyuvante inmunológico anti-PD-L1. para causar quimioterapia/PDT/inmunoterapia antitumoral altamente eficiente y sinérgica (Esquema 1). Las NP COS-BA/Ce6 diseñadas mostraron una función de latencia inteligente con efectos insidiosos de la quimioterapia, es decir, las NP coensambladas no irradiadas mostraron una citotoxicidad in vitro notablemente inhibida en comparación con las COS-BA anfifílicas, ya sea contra células cancerosas o normales. Debido al comportamiento distintivo de respuesta al pH, presenta una baja toxicidad y bioseguridad para el tejido normal in vivo, pero es altamente tóxico para el tejido tumoral debido a la estimulación de la liberación de COS-BA hiperactivo en el microambiente tumoral débilmente ácido34. Hasta donde sabemos, en la actualidad, los nanofármacos diseñados que albergan esta función quimioterapéutica de latencia rara vez se informan. Mientras tanto, el nanofármaco tiene múltiples características terapéuticas favorables, como una generación mejorada de 1 O2 al reducir la brecha energética (DEST) de Ce6, un metabolismo biológico rápido y una mayor acumulación de tumores, lo que condujo a una combinación antitumoral eficiente y segura de quimioterapia y tratamiento PDT. Más importante aún, tanto la quimioterapia basada en NP como los sistemas de quimioterapia/PDT podrían activar eficazmente la inmunidad antitumoral al facilitar la proliferación de células T CD8+ productoras de TNF-a e IFN-g en tumores primarios o distantes. Nuestro nanofármaco fotoquimioterapéutico biodegradable, biocompatible, excepcionalmente inactivo, bioseguro y altamente eficiente propuesto logra respuestas terapéuticas inmunes sistémicas significativas, abriendo posibilidades atractivas para la aplicación clínica en el tratamiento de la terapia contra el cáncer a distancia o metastásico.
La TFD del esquema 1 y la quimioterapia de NP COS-BA/Ce6 coensambladas potenciaron el anti-PD-L1 para inducir una inmunoterapia antitumoral sistémica. La introducción de COS soluble en agua puede mejorar eficazmente la actividad quimioterapéutica de BA (representado como una media espada), lo que da como resultado un profármaco anfifílico COS-BA hiperactivo (espada larga). Cuando se ensamblaron conjuntamente con el fotosensibilizador Ce6 (vaina), los nanoensamblajes estructurados en cáscara y sensibles al pH tuvieron una función de "latencia" inteligente y distintiva con toxicidad quimioterapéutica inhibida para los tejidos normales. Pero, una vez que llegó y fue estimulado por el microambiente tumoral ácido (Hþ), se liberará el profármaco anfifílico altamente activo COS-BA, lo que dará como resultado una quimioterapia significativa. Además, los coensamblajes construidos exhibieron una excelente actividad PDT con una generación mejorada de oxígeno singlete (1 O2) inducida por la reducción de la brecha de energía entre los estados excitados singlete y triplete (DEST) de Ce6. Combinada con un bloqueo del punto de control anti-PD-L1, la liberación de antígenos asociados a tumores después del tratamiento de quimioterapia/TFD puede activar eficazmente una respuesta inmune antitumoral sistémica para la inmunoterapia contra el cáncer a distancia.
2. Materiales y métodos
2.1. Síntesis de COS-BA
Ácido betulínico (40 mg, 0.1 mmol), EDC (38 mg, 0.2 mmol) y NHS (17 mg, 0.15 mmol ) se disolvieron en 3 ml de N,N-dimetilformamida (DMF). Después de agitar a temperatura ambiente durante 30 min, se añadieron suavemente gota a gota 96 mg de solución acuosa de COS (1 ml) a la mezcla y se agitó durante 24 h. Luego la mezcla de reacción se diluyó con CH2Cl2 y se extrajo repetidamente. La capa de CH2Cl2 se evaporó y se purificó en una columna de gel de sílice. El BA sin reaccionar se eliminó inicialmente usando éter de petróleo: acetona (5:1, v/v) como eluyente, y luego se cambió a 3:1 para producir COS-BA blanco (rendimiento: 42%), donde COS se identificó como dímero ( norte Z 2). RMN 1H (40{{70}} MHz, CDCl3) d: 8,98 (1H, s, BA-28 O]CeNH), 4,73 (1H, s, H -29a), 4,60 (1H, s, H-29b), 3,18 (1H, dd, JZ 4,8, 10,8 Hz, H-3), 2,95e3,93 (8H, m, COS), 2,64 (3H, s, CH3eCOS), 0,76 (3H, s, H-24), 0,83 (3H, s, H-25), 0,90 (3H, s, H{ {69}}), 0,97 (3H, s, H-26), 0,98 (3H, s, H-27), 1,70 (3H, s, H-30). RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) d: 179,18 (CO, COS), 156,43 (C- 28), 150,97 (C-20), 109,03 (C-29), 78,74, 77,04 , 69,32, 69,22, 65,25, 58,14, 55,62, 55,21, 53,65, 53,22, 50,52, 45,96, 44,32,44,11, 41,85, 40,59, 38,68, 38,55, 37,32, 37. 04, 36.39, 35.31, 34.21, 31.81, 31.54, 31.17, 30.28 , 29,09, 27,80, 27,22, 25,74, 25,53, 20,91, 19,48, 18,12, 16,02, 15,87, 15,17, 14,65, 14,62. ESIeMS m/z: 814,5871 [M‒6H] (C44H72N2O12).
2.2. Preparación de NP COS-BA/Ce6
Las NP COS-BA/Ce6 coensambladas se prepararon mediante el método de reprecipitación en un solo paso. Normalmente, primero se mezclaron 5 ml de soluciones de Ce6 (33 mmol/l) y 40 ml de COS-BA (33 mmol/l) de DMSO. Posteriormente, la mezcla se inyectó rápidamente en 1 ml de agua que contenía 10 ml de NaOH (50 mmol/l) bajo ultrasonidos (KQ-250E, ShuMei, Kunshan, China). Después de la sonicación durante 10 minutos, las NP COS-BA/Ce6 se obtuvieron mediante centrifugación a 13,000 rpm (TGL-16G, Xiangyi, Changsha, China) durante 25 min. Se prepararon otras formulaciones con diferentes proporciones de COS-BA a Ce6 mediante el mismo procedimiento con una proporción molar constante de NaOH a Ce6 de 3:1.
2.3. Líneas celulares
Las líneas celulares humanas MCF-7, HepG2, LO2 y 4T1, L929 de ratón son proporcionadas por el Instituto de Bioquímica y Biología Celular, SIBS, CAS (China). MCF-7, HepG2 y LO2 se cultivaron en medio DMEM con suero bovino fetal al 10 % (FBS, Gibco) y antibiótico penicilina-estreptomicina al 1 % (Life Technology, EE. UU.) a 37 °C. 4T1 y L929 se cultivaron en RMPI-1640 medio con la misma proporción que el anterior.
2.4. Estudios de captación celular y vías endocíticas.
Para la investigación de la captación celular, se incubaron células 4T1 o LO2 con NP de Ce6 o COS-BA/Ce6 libres (concentración equivalente de Ce6: 1,7 mg/ml, COS-BA: 19,5 mg/ml, BA: 10 .8 mg/mL) durante varios tiempos. Después de lavar, fijar y teñir con DIPA (#D9542, Sigma), se tomaron imágenes de las células bajo un microscopio invertido fluorescente (FIM) (DSY-2000X, UP Optotech, Changchun, China). La intensidad de la fluorescencia se determinó mediante citometría de flujo utilizando el mini sistema Guava EasyCyte (Merck Millipore, Alemania). Para cuantificar la eficiencia de absorción, se midió la acumulación celular de BA y COS-BA mediante HPLC (Agilent 1200, EE. UU.). Normalmente, las células 4T1 se trataron con COS-BA o BA libre (BA equivalente: 25 mg/ml) durante 0,5 y 3 h. Después de lavar con PBS, los sedimentos celulares se recogieron y se sometieron a homogeneización ultrasónica (JY92-IIN, Scientz Biotechnology, Ningbo, China) para la lisis celular. Luego, se extrajo COS-BA o BA mediante cloroformo para análisis por HPLC después de liofilizar las muestras. La fase móvil fue agua (ácido fosfórico al 0,2%) y acetonitrilo a un caudal de 1,0 ml/min, y las relaciones de volumen correspondientes fueron 60:40 y 15:85 (v/v) para el análisis de COS-BA y BA, respectivamente. . La longitud de onda de detección fue de 213 nm. Para la investigación de las vías endocíticas de las NP COS-BA/Ce6, se sembraron células 4T1 en placas de pocillos 6- y se incubaron durante 24 h antes de ser pretratadas con varios inhibidores de endocitosis durante 30 minutos, incluido un inhibidor de micropinocitosis [50 mmol/L , isopropil amilorida de etilo (EIPA) (#N132356, Aladdin)], un inhibidor de la endocitosis mediada por clatrina [20 mmol/L, clorpromazina (#C7010, Solarbio)], un inhibidor de la endocitosis mediada por caveolas [25 mmol/L, nistatina ( #IN0260, Solarbio)], y un inhibidor de la acidificación de los lisosomas [50 mmol/L, fosfato de cloroquina (#C9720, Solarbio)]35. A continuación, las células se cultivaron adicionalmente con 2 ml de NP COS-BA/Ce6 (Ce6: 1,7 mg/ml, COS-BA: 19,5 mg/ml) durante 2 h y se tomaron imágenes en FIM (UP Optotech). Las células incubadas sin inhibidor endocítico a 37 C se establecieron como control y en incubación a baja temperatura (4 C) para la evaluación de la endocitosis dependiente de energía. Mientras tanto, la intensidad media de fluorescencia de las células también se determinó mediante citometría de flujo.
cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico
Haga clic aquí para ver los productos Cistanche Enhance Immunity
【Pregunte por más】 Correo electrónico:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
2.5. Ensayo de citotoxicidad
Se sembraron células 4T1 en una placa 96-pocillos. Luego, las células se trataron con diversas concentraciones de COS-BA NP durante 24 h. Posteriormente, se añadió al pocillo 10 ml de colorante MTT (#M158055, Aladdin) (5 mg/mL) y se incubó durante 4 h más, y luego se agregaron 150 ml de DMSO para disolver los cristales de formazán. . La absorbancia de cada pocillo a 492 nm se registró mediante un lector de microplacas. Para el grupo de irradiación, las células se trataron con medicamentos durante 4 h, luego se irradiaron durante 10 minutos con luz 675 10 nm y se incubaron durante 20 h adicionales. La citotoxicidad de las NP de COS-BA/Ce6 (1 mg/mL de Ce6 corresponde a 11,5 mg/mL de COS-BA y 6,4 mg/mL de BA) contra otras células (MCF-7, HepG2, LO2 y L929) También se determinaron mediante el mismo ensayo MTT solo que con un medio diferente. Mientras tanto, el índice de combinación se calculó mediante el software CompuSyn 2.0 utilizando el cálculo del teorema de Chou Talalay36.
2.6. Modelos animales
Todos los procedimientos experimentales se ejecutaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Médica de Harbin. Se suspendieron células 4T1 en medio RMPI-1640 y se inyectaron por vía subcutánea en la parte posterior derecha de cada ratón BALB/c hembra (18-22 g, 6-7 semanas de edad).
2.7. Imágenes de fluorescencia in/ex vivo
Se inyectaron 200 ml de solución de glucosa al 5 % de COS-BA/Ce6 NPs (Ce6 equivalente: 0,35 mg/ml, COS-BA: 4,02 mg/ml) a través de la vena de la cola en ratones con tumores. Después de eso, se realizaron imágenes de fluorescencia de los sitios tumorales en un momento predeterminado utilizando un sistema de imágenes de animales in vivo multimodelo AniView 100/600 (Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., China) con excitación a 630 nm. Después de 24 h después de la inyección, se recogieron los órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón) y el tumor para obtener imágenes de fluorescencia ex vivo. Además, también se evaluaron las imágenes de fluorescencia ex vivo de tumores y órganos principales en diferentes momentos después de inyecciones intravenosas de Ce6 o COS-BA/Ce6 NP.
2.8. Quimioterapia/PDT in vivo
Los ratones portadores de 4T1- (75e100 mm3) se dividen aleatoriamente en seis grupos (n Z 5): 1) solución de glucosa al 5%; 2) Ce6; 3) Ce6 con irradiación; 4) COS-BA (40,2 mg/kg, donde BA: 22,3 mg/kg); 5) NP COS-BA/Ce6; 6) NP COS-BA/Ce6 con irradiación. Para cada grupo, a los ratones se les inyectan 200 ml de NP COS-BA/Ce6 (Ce6 equivalente: 3,5 mg/kg de cuerpo) a través de la vena de la cola los días 0, 2 y 4. Para los grupos de irradiación, a las 4 h Después de la inyección, después de cada administración, todos los ratones se anestesiaron con isoflurano y los sitios del tumor se irradiaron con luz de 675 10 nm (150 mW/cm2) durante 15 minutos. También se registran los volúmenes de los tumores y los pesos corporales de los ratones cada dos días. Los volúmenes de los tumores se calculan mediante la fórmula: VZ ancho2 largo/2. Después de 14 días de tratamiento, los tumores se extirparon y se pesaron para calcular el índice de inhibición tumoral (TIR) mediante la ecuación comúnmente utilizada: TIRZ (1 muestra/control) 100 %. Donde la muestra y el control fueron el peso promedio del tumor de cada grupo tratado y el grupo de solución acuosa de glucosa al 5%, respectivamente.
2.9. Quimioterapia/PDT/inmunoterapia in vivo
Para demostrar el potencial de las NP COS-BA/Ce6 combinadas con inmunoterapia, se diseñó el modelo de tumor bilateral mediante inyección subcutánea de células 4T1 en los flancos izquierdo y derecho. Cuando los tumores se acercaron a 75e100 mm3, los ratones se dividieron en cinco grupos. (1) Controlar; (2) NP COS-BA/Ce6 (COS-BA Z 40,2 mg/kg, donde BA Z 22,3 mg/kg); (3) NP COS-BA/Ce6 + luz; (4) NP COS-BA/Ce6 + anti-PDL1; (5) NP COS-BA/Ce6 þ anti-PD-L1 þ luz. El día 0, se inyectaron iv a ratones 200 ml de solución de glucosa al 5 % (Grupo 1) o NP de COS-BA/Ce6 (Ce6 Z 3,5 mg/kg) (Grupo 2, 3, 4, 5). Después de 4 h después de la inyección, los tumores derechos de los Grupos 3 y 4 se irradiaron durante 15 min. Los ratones fueron anestesiados con isoflurano y colocados sobre un costado para evitar exponer los tumores izquierdos. Luego, se inyectó por vía intravenosa anticuerpo anti-PD-L1 (BioXcell, número de producto: BE0101, número de clon: 10F.9G2) en ratones para los grupos 4 y 5 los días 2, 4 y 6 (15 mg por ratón por inyección). La longitud y el ancho de cada tumor se controlaron cada dos días. Después de 14 días de tratamiento, se recogió el suero sanguíneo de los ratones para evaluar el interferón gamma (IFN-g) (#KMC4021) y el factor de necrosis tumoral (TNF-a) (#BMS607-3) mediante un ensayo ELISA (eBioscience ). Los tumores se recogieron, se disociaron, se trataron con tampón de lisis de glóbulos rojos y se lavaron con PBS mediante centrifugación. Luego, la suspensión celular se tiñó con anti-CD3-FITC (#MA1-10187, clon 145-2C11, eBioscience) y anti-CD8a-PE (#12-0081-85, clon 53-6.7, eBioscience). Posteriormente, se evaluó mediante citometría de flujo la infiltración de linfocitos T citotóxicos (CTL) en los tumores derecho e izquierdo después de diferentes tratamientos.
3. Resultados y discusión
3.1. Síntesis, fabricación y caracterización de NP COS-BA/Ce6.
En este estudio, diseñamos una nueva molécula pequeña de profármaco COS-BA basada en oligosacárido de quitosano (COS) soluble en agua, que puede elevar la actividad quimioterapéutica del ácido betulínico (BA) triterpeno pentacíclico al mejorar la absorción celular mediante el aumento de la hidrofilicidad. El COS (grado de polimerización, DP: 2e6) empleado aquí se preparó mediante nuestro método descrito anteriormente 30. Luego, el COS-BA se sintetizó mediante una reacción de condensación por deshidratación. Combinado con el análisis de componentes principales de COS, se pensó que la estructura química de COS-BA era un BA modificado con disacárido (DP:2) (Información de respaldo, Fig. S1), lo cual fue confirmado por 1 H NMR, 13 C NMR y ESIeMS. (Información de respaldo, figuras S2eS4). El análisis de la RMN 1 H representativa mostró la señal distintiva de protones de COS alrededor de 2,64 a 3,93 ppm y picos de C]CH2 (4,60, 4,73 ppm) de BA, lo que demuestra la síntesis exitosa de COS-BA (Fig. 1A). Para la preparación del reactivo antitumoral sinérgico coensamblado COS-BA/Ce6 NP, se empleó un enfoque de reprecipitación versátil cooperando con un fotosensibilizador Ce6 altamente eficiente. Al cambiar las relaciones molares iniciales, ambas formulaciones de coensamblaje COS-BA/Ce6 podrían formar nanoestructuras esféricas con tamaños modulados (Fig. 1B e información de respaldo Fig. S5). En diferentes relaciones de entrada de COS-BA/Ce6, los diámetros hidrófilos de las NP de COS-BA/Ce6 estaban cerca de 200e300 nm con un potencial z negativo. Teniendo en cuenta que las NP preparadas con una formulación de 8:1 mostraron un índice de polidispersidad más bajo (PDI, 0,143) con un tamaño relativamente más pequeño (249 nm), también se requirió una cantidad suficiente de agente quimioterapéutico COS-BA para el tratamiento combinatorio. Por lo tanto, elegimos las formulaciones de COS-BA/Ce6 (8:1) para el siguiente estudio. Bajo esta optimización, las NP COS-BA/Ce6 exhibieron distribuciones de tamaño estrechas (Fig. 1C) y buena solubilidad en agua, lo que indica su naturaleza coloidal (Fig. 1D). Para explorar las razones detrás de este coensamblaje exitoso, se investigó el comportamiento de autoensamblaje primario del COS-BA libre mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) (Fig. 1E), lo que sugirió que COS-BA podría formar una nanopartícula altamente uniforme. esfera de w168 nm, lo que implica que la modificación química de COS no altera la capacidad de autoensamblaje del propio BA (Información de respaldo, Fig. S6). Es esa propiedad la que finalmente induce la construcción exitosa de los coensamblajes. En particular, aparte de la nanoestructura sólida confirmada por microscopía electrónica de transmisión (TEM), las NP COS-BA/Ce6 mostraron una estructura de capa distinta de NP COS-BA libre, y el espesor promedio de la capa fue de aproximadamente 2,35 nm. La otra caracterización fisicoquímica se resume en la Fig. 1F. Además, las NP COS-BA/Ce6 mostraron un potencial z negativo de 5,38 mV y un tamaño hidrodinámico de w249 nm, superior al obtenido por SEM (w182 nm). Simultáneamente, las eficiencias de carga y encapsulación de Ce6 fueron del 8,1 y el 96 %, respectivamente, según lo determinado por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Además, los datos de FT-IR (Fig. 1G) confirmaron aún más este coensamblaje porque las NP COS-BA/Ce6 exhibieron los picos característicos de C]N, CeN y C]CH de Ce6 que aparecen en 1633, 1078 y 633 cm 1. , respectivamente.
cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico
3.2. Mecanismo coensamblado y formación de la estructura de la cáscara.
Posteriormente, para comprender mejor el mecanismo de coensamblaje, primero investigamos el proceso de formación primaria de NP. Descubrimos que el coensamblaje de COS-BA con Ce6 puede ser espontáneo porque estas dos especies también podrían formar una nanoestructura esférica incluso sin sonicación (Información de respaldo, Fig. S7), lo que puede deberse al cambio negativo de energía libre de Gibbs (DG ) en co-ensamblajes37. Este ensamblaje espontáneo también sugirió una interacción intermolecular más fuerte entre COS-BA y Ce6. Generalmente, las interacciones intermoleculares en autoensamblajes (o co-) supramoleculares son apilamiento p‒p no covalente, enlaces de hidrógeno y fuerzas de van der Waals 38,39. Para este análisis, luego investigamos la absorción de UV de las NP COS-BA/Ce6 (Fig. 1H y F), lo que sugirió bandas de Soret (410 nm) y Qy (667 nm) desplazadas al rojo en comparación con Ce6 libre (405 y 665 nm, respectivamente). Mientras tanto, también se puede encontrar la importante absorción característica desplazada al rojo de COS-BA, lo que indica un posible apilamiento intermolecular de pp entre COS-BA y Ce640. Además, después de incubar con el surfactante dodecilsulfato de sodio (SDS, 0,2% p/v) (Información de respaldo, Fig. S8), las NP COS-BA/Ce6 mostraron una nueva banda Qy desplazada hacia el azul a 641 nm y recuperaron dramáticamente la fluorescencia, lo que demuestra que las interacciones hidrofóbicas también contribuyeron al coensamblaje28. Desde estas interacciones asociativas no covalentes, los coensamblajes mostraron una notable extinción de la fluorescencia (98,2%) en agua (Fig. 1I). En conjunto, es razonable creer que el apilamiento de p‒p y las interacciones hidrofóbicas pueden ser las principales fuerzas impulsoras para la construcción de coensamblajes. Posteriormente, para visualizar aún más el proceso de ensamblaje de manera más intuitiva y revelar las razones subyacentes por las que se pueden formar NP con estructura de capa, realizamos un modelo de simulación de dinámica molecular (MD) simplificado que contiene 16 moléculas COS-BA optimizadas y dos Ce6 adicionales en una caja de agua. . Inicialmente, evaluamos la posible interacción/unión de los autoensamblajes de COS-BA dentro de los 5 ns del tiempo de simulación (Fig. 2A e información de respaldo, Fig. S9). Descubrimos que, a excepción de numerosos enlaces de hidrógeno intramoleculares en la fracción COS, también se podían observar varios pares de enlaces H intermoleculares entre COS-BA (Fig. 2B e información de respaldo Fig. S10), lo que indicaba que los enlaces de hidrógeno pueden ser uno de ellos. de las principales fuerzas impulsoras para la formación de NP COS-BA. Particularmente interesante es que en los autoensamblajes de COS-BA, todas las moléculas de COS-BA forman una estructura aparentemente simétrica (Fig. 2C). Este fascinante fenómeno nos motivó a explorar la posible relación entre esta propiedad y la formación de NP COSBA con estructura de capa. Luego, intentamos ampliar las unidades de la caja. Sorprendentemente, las cajas conectadas que constan de moléculas de COS-BA se dispusieron de manera regular, lo que dio como resultado estructuras de red huecas "ortogonales" (Información de respaldo, figura S11). Más importante aún, calculamos aleatoriamente el grosor de las moléculas de la capa y descubrimos que eran consistentes con el TEM (w2.35 nm) (Fig. 2D). Esta tendencia a formar estructuras de red huecas puede ser responsable de la formación de NP con estructura de caparazón. Para probar esta idea, se simuló la estructura MD de los coensamblajes COS-BA/Ce6 (Fig. 2E e información de respaldo, Fig. S12). De manera similar a los autoensamblajes de COS-BA, también se encontró una gran cantidad de enlaces H intramoleculares e intermoleculares en los coensamblajes (Fig. 2F e información de respaldo, Fig. S13). Además, en los coensamblajes se observó el posible apilamiento de pp entre C]C de COS-BA y el anillo aromático de Ce6 (Fig. 2G), lo que concuerda con los datos de investigaciones UV anteriores. Después de ampliar el número de cajas, todavía se pueden encontrar estructuras de red huecas similares, solo que con regularidad y ortogonalidad reducidas (Información de respaldo, Fig. S14). Esta puede ser la posible razón de la morfología no uniforme de las NP COS-BA/Ce6 en comparación con las NP COSBA. Además, la distancia molecular entre la capa y la capa también está cerca del espesor de la capa (w 2,35 nm) de las NP, como se ve con el TEM (Fig. 2H). En conjunto, especulamos que la formación de NP COS-BA / Ce6 estructuradas en capa o NP COS-BA podría atribuirse en gran medida a esta tendencia de las moléculas a ensamblarse en estructuras de red de capa hueca.
Figura 1 Fabricación y caracterización de nanoensamblajes de NP COS-BA/Ce6 mediados por profármacos de ácido betulínico modificado con oligosacáridos de quitosano (COS-BA). (A) Las posiciones clave amplificadas de 1 H NMR de COS-BA. (B) Preparación de NP COS-BA/Ce6 coensamblados con varias relaciones COS-BA/Ce6. (C) Distribución de tamaño de NP COS-BA/Ce6 utilizando COS-BA y Ce6 (relación molar, 8:1) como bloques de construcción. (D) La solubilidad en agua y el efecto Tyndall de los coensamblajes indican una naturaleza coloidal. (E) Imágenes SEM y TEM de autoensamblajes COS-BA libres y NP COS-BA/Ce6 coensamblados. (F) Resumen de las propiedades fisicoquímicas de las NP COS-BA/Ce6. (G) espectros FT-IR, (H) espectros UV Vis y (I) espectros de emisión de fluorescencia de Ce6 libre, COS-BA y NP COS-BA/Ce6 coensamblados en agua.
Figura 2 Estructuras de (A) autoensamblajes de COS-BA y (E) NP de COS-BA/Ce6 coensamblados después de una simulación de dinámica molecular (MD) durante 5 ns con una relación molar de unidades estructurales de 8:1 (COS-BA /Ce6, calculado en base a la eficiencia de carga de Ce6). El modelo lineal se utilizó para H2O y los modelos de barra representan moléculas COS-BA o Ce6, donde los átomos de C de Ce6 están marcados con color púrpura. La información del enlace de hidrógeno entre las moléculas COS-BA en (B) sus autoensamblajes y (F) los coensamblajes COS-BA/Ce6 NP. (C) La estructura aparentemente simétrica de la disposición molecular de COS-BA después de la simulación MD. (G) Las posibles interacciones moleculares entre COS-BA y Ce6 muestran un posible apilamiento de pp. El espesor indicado de las moléculas de la capa en una estructura de red hueca "ortogonal" después de extender las cajas MD correspondientes de (D) autoensamblajes COSBA libres y (H) coensamblajes COS-BA/Ce6 NP.
3.3. Mecanismo energético de generación mejorada de 1 O2.
A continuación, examinamos más a fondo la generación de oxígeno singlete (1 O2), una de las especies reactivas de oxígeno (ROS) críticas del rendimiento de la PDT utilizando DPBF (1,3-difenilisobenzofurano) como sonda. Después de la irradiación sostenida de las soluciones mixtas de COS-BA/Ce6 NP con DPBF, la absorción de UV de DPBF disminuyó en intensidad, lo que indica 1 generación de O2 (Fig. 3A). Después de la comparación con la referencia de azul de metileno (MB), el F (1 O2) de las NP de COS-BA/Ce6 se calculó como 0.26, ligeramente superior al del Ce6 libre (FZ0.19). (Figura 3B). Generalmente, la energía absorbida por los fotosensibilizadores pasará por tres vías de relajación que implican fluorescencia, efecto de calentamiento mediante relajación vibratoria y generación de ROS a través de un cruce entre sistemas (ISC)41. De acuerdo con la emisión de fluorescencia significativamente apagada, las NP de COS-BA/Ce6 tampoco promovieron ningún efecto de calentamiento en el agua (Información de respaldo, Fig. S15), lo que implicó un proceso ISC mejorado después del coensamblaje de Ce6 con COS-BA, lo que llevó a a la generación mejorada 1 O2. Para dilucidar aún más el mecanismo molecular de tal efecto, intentamos optimizar y calcular el posible modelo de molécula única de COS-BA/Ce6 que consiste en un apilamiento potencial de pp obtenido de la simulación MD mediante la teoría funcional de la densidad (DFT) (Fig. 3C). . Sorprendentemente, COS-BA/Ce6 mostró una absorción de UV desplazada al rojo observable de 581,24 nm que la del Ce6 libre (579,30 nm), lo que indica la aparición de apilamiento de pp (Fig. 3D). Aunque la geometría minimizada por energía de COS-BA/Ce6 mostró ligeras diferencias estructurales con la configuración MD ingresada, el apilamiento distintivo entre los enlaces C]C o C]O de COS-BA con el anillo de porfina de Ce6 aún era observable, lo que valida aún más que la Es posible apilar por encima de p‒p. Mientras tanto, se ha demostrado recientemente que la mayor eficiencia de donación de electrones mediante el apilamiento p‒p podría facilitar el proceso ISC42, mientras que la tasa ISC (KISC) es proporcional a (1/DEST) 2,43. Es decir, la menor brecha de energía (DEST) del fotosensibilizador mejorará el proceso ISC promoviendo una generación eficiente de ROS. Posteriormente calculamos el estado singlete excitado más bajo (S1) y el estado triplete (T1) de Ce6 y COS-BA/Ce6 (Fig. 3E), respectivamente. Los resultados indicaron que COS-BA/Ce6 mostró una DEST disminuida de 1,1892 eV en comparación con el Ce6 libre (1,2001 eV), lo que confirma el proceso ISC mejorado. La reducción de DEST es útil para la producción de 1 O2, lo que también se ha verificado en otros nanofotosensibilizadores44. En conjunto, el apilamiento p parece reducir el DEST de Ce6 después del coensamblaje con COS-BA, lo que conduce a una generación mejorada de 1 O2.
![Figure 3 Energy mechanism of improved 1 O2 generation induced by COS-BA/Ce6 NPs. (A) UV Vis spectra of photodecomposition of 1,3-diphenylisobenzofuran (DPBF) after prolonged irradiation of COS-BA/Ce6 NPs. (B) In the first-order plots of DPBF UV absorption changes (DOD), the 1 O2 yield was evaluated using methylene blue (MB) (F Z 0.52) in DMSO as the reference compound. (C) Energy-minimized structures of a possible single-molecule COS-BA/Ce6 model viewed from the side and front, which was obtained according to the initial molecular configuration between Ce6 with COS-BA after MD simulation and following DFT calculations. (D) Predicted UV Vis absorption spectra transitions (vertical bars) of free Ce6 and an optimized COS-BA/Ce6 model. (E) Calculated energy levels of their lowest excited singlet state (S1) and lowest triplet state (T1), respectively, [Gaussian 09/B3LYP/6-31G (d, p)]. Where DEST was calculated as ES1 ET1.](/Content/uploads/2023842169/20231220105921392c9765b52f4ceb80db09f348c7b92e.png "Figure 3 Energy mechanism of improved 1 O2 generation induced by COS-BA/Ce6 NPs. (A) UV Vis spectra of photodecomposition of 1,3-diphenylisobenzofuran (DPBF) after prolonged irradiation of COS-BA/Ce6 NPs. (B) In the first-order plots of DPBF UV absorption changes (DOD), the 1 O2 yield was evaluated using methylene blue (MB) (F Z 0.52) in DMSO as the reference compound. (C) Energy-minimized structures of a possible single-molecule COS-BA/Ce6 model viewed from the side and front, which was obtained according to the initial molecular configuration between Ce6 with COS-BA after MD simulation and following DFT calculations. (D) Predicted UV Vis absorption spectra transitions (vertical bars) of free Ce6 and an optimized COS-BA/Ce6 model. (E) Calculated energy levels of their lowest excited singlet state (S1) and lowest triplet state (T1), respectively, [Gaussian 09/B3LYP/6-31G (d, p)]. Where DEST was calculated as ES1 ET1.")
Figura 3 Mecanismo energético de generación mejorada de 1 O2 inducida por NP COS-BA/Ce6. (A) Espectros UV Vis de fotodescomposición de 1,3-difenilisobenzofurano (DPBF) después de una irradiación prolongada de NP COS-BA/Ce6. (B) En los gráficos de primer orden de los cambios de absorción de UV (DOD) de DPBF, el rendimiento de 1 O2 se evaluó utilizando azul de metileno (MB) (FZ 0.52) en DMSO como compuesto de referencia. (C) Estructuras de energía minimizada de un posible modelo COS-BA/Ce6 de una sola molécula visto desde el lado y el frente, que se obtuvo de acuerdo con la configuración molecular inicial entre Ce6 con COS-BA después de la simulación MD y después de los cálculos DFT. (D) Transiciones de espectros de absorción UV Vis previstas (barras verticales) de Ce6 libre y un modelo COS-BA/Ce6 optimizado. (E) Niveles de energía calculados de su estado singlete excitado más bajo (S1) y estado triplete más bajo (T1), respectivamente, [Gaussiano 09/B3LYP/6-31G (d, p)]. Donde DEST se calculó como ES1 ET1.
3.4. Características de la latencia de la quimioterapia.
Posteriormente, para validar el concepto de diseño en el presente estudio de que el desarrollo de una molécula anfifílica de COS-BA podría aumentar efectivamente el efecto terapéutico de BA al mejorar la absorción celular mediante el aumento de la hidrofilicidad y, mientras tanto, construir aún más COS-BA/Ce6 que responde a estímulos y es totalmente hidrófilo. Las NP facilitaron su latencia en tejidos normales y su activación en sitios tumorales. Para probar esta hipótesis, primero investigamos el comportamiento de liberación de fármaco de las NP COS-BA/Ce6 en varias soluciones tampón (Fig. 4A). Los resultados indicaron que las NP COS-BA/Ce6 mostraron un comportamiento sensible al pH con una liberación acumulada de Ce6 del 88% a pH 5,6 y del 57% a pH 7,4 después de 24 h, respectivamente. Esta característica probablemente surgió de la destrucción de numerosos enlaces de hidrógeno que existían en las NP COS-BA/Ce6 después de la introducción de Hþ45 ácido, lo que condujo a una mayor liberación de Ce6 (Fig. 4B). Esto se confirmó aún más mediante el desmontaje de las NP COS-BA/Ce6 después de la incubación directamente en ambientes ácidos (Fig. 4C). Esta característica de respuesta al pH puede ser beneficiosa para una terapia antitumoral eficaz debido al microambiente tumoral débilmente ácido34. Mientras tanto, las NP COS-BA/Ce6 tuvieron una mejor estabilidad porque no se pudieron observar cambios significativos de tamaño o PDI después de la incubación en PBS y medio de cultivo celular 1640-RMPI durante 10 días (Información de respaldo, figura S16), lo que sería importante. por su uso potencial para futuras aplicaciones biomédicas. Posteriormente, se realizaron más investigaciones evaluando la citotoxicidad del BA lipófilo libre (ángulo de contacto q: 133,3) y del COS-BA anfifílico (q: 52) (Fig. 4D) mediante un ensayo estándar de bromuro de metil tiazolilo-difenil tetrazolio (MTT). Como se predijo, ya sea para las células cancerosas 4T1 o para los hepatocitos LO2 normales, el COS individual esencialmente no tiene actividad anticancerígena en dosis relativamente bajas. Esto podría deberse a que los efectos antiproliferación de COS se activan mediante la inducción de la vía de señalización NF-kB solo en concentraciones altas (aproximadamente a nivel de miligramos)30. Considerando que, COS-BA presenta una citotoxicidad notablemente mejorada con valores de IC50 extremadamente bajos (6,03 mg/mL para 4T1 y 9,92 mg/mL para LO2) en comparación con los de BA (17,63 mg/mL para 4T1 y 20,53 mg/mL para LO2) incluso a las mismas concentraciones de masa (Fig. 4E y J). Los resultados obtenidos implicaron que la modificación de COS soluble en agua mejora en gran medida la eficiencia de absorción celular de BA lipófilo, lo que conduce a la fuerte actividad anticancerígena de COS-BA. Para cuantificar la eficiencia de absorción, la acumulación de BA o COS-BA dentro de las células 4T1 se determinó directamente mediante HPLC (Información de respaldo, figura S17). Los resultados respaldaron claramente que el COS-BA anfifílico exhibe una absorción significativamente mayor que el BA libre (aproximadamente 3,{70}} veces después de 3 h de incubación), lo que demuestra la actividad quimioterapéutica mejorada de COS-BA. La conclusión anterior fue respaldada aún más por la citotoxicidad significativamente mejorada del COSBA anfifílico contra las células cancerosas HepG2 y MCF-7 (Información de respaldo, Fig. S18), que son consistentes con el concepto de diseño. Después del coensamblaje con Ce6, encontramos que las NP de COS-BA/Ce6 sin irradiación exhiben una citotoxicidad notablemente inhibida contra las células cancerosas 4T1 en comparación con el COS-BA equivalente, especialmente a 11,5 mg/ml, pero la actividad básica de PDT no se vio afectada ( Figura 4F). Para validar este fenómeno más completamente, investigamos más a fondo la citotoxicidad in vitro de las NP COS-BA/Ce6 contra otras células cancerosas, incluidas MCF-7 y HepG2. Curiosamente, el COS-BA anfifílico mostró una citotoxicidad muy fuerte contra las células MCF-7 (Fig. 4G), pero la actividad quimioterapéutica disminuyó significativamente después del coensamblaje con Ce6, es decir, NP de COS-BA/Ce6 no irradiadas. También se observaron resultados similares en las células HepG2 solo con una ligera disminución (Fig. 4H). Para respaldar aún más las conclusiones anteriores, también evaluamos los efectos quimioterapéuticos de los nanoensamblajes y COS-BA contra células de fibroblastos L929 de ratón normales y hepatocitos LO2 humanos (Fig. 4I). Los resultados indicaron que las NP COS-BA/Ce6 ensambladas redujeron significativamente el fármaco anfifílico altamente tóxico COS-BA original, mostrando una excelente biocompatibilidad. Al analizar la citotoxicidad, los valores de IC50 del COS-BA anfifílico fueron significativamente más bajos que los de las NP COS-BA/Ce6 coensambladas, independientemente del cáncer o las células normales (Fig. 4J). Es decir, la construcción de nanocoensamblajes completamente hidrófilos y que responden a estímulos puede suprimir eficazmente de antemano la alta citotoxicidad del fármaco anfifílico COS-BA. Teniendo en cuenta la característica distintiva de respuesta al pH, parece que las NP COS-BA/Ce6 estarán inactivas en tejidos normales con la baja toxicidad deseada por la quimioterapia, pero activas en tejidos tumorales debido a su liberación estimulante de COS-BA altamente tóxico en el tumor débilmente ácido. microambiente. En conjunto, a diferencia de la neofuncionalización ampliamente reportada de reactivos quimioterapéuticos que han mejorado la actividad anticancerígena22,23, los nanoensamblajes anfifílicos mediados por COS-BA no sólo exhiben una característica inteligente de "latencia" con efectos insidiosos de la quimioterapia, sino que también retienen una actividad PDT especializada, lo que muestra un enorme potencial. para una terapia antitumoral inteligente.
Figura 4 (A) Perfiles de liberación de Ce6 in vitro de NP COS-BA/Ce6 en PBS (pH 7,4, 6,5 o 5,6) que contiene Tween 80 (0.5%, v/v) a 37 C. (B) El posible mecanismo sensible al pH que Hþ desencadena el desmontaje de las NP. (C) El desmontaje de NP COS-BA/Ce6 después de la incubación directa en aproximadamente pH 4.0 agua. (D) El ángulo de contacto de los NP BA, Ce6, COS-BA y COS-BA/Ce6 libres, respectivamente. (E) Citotoxicidad celular de BA, COS y COS-BA anfifílico contra células cancerosas representativas 4T1 y LO2 normales. Viabilidad celular de células cancerosas (F) 4T1, (G) MCF-7, (H) HepG2 después de incubarlas con NP COS-BA, COS-BA/Ce6 libres con/sin irradiación a la concentración de COS-BA equivalente indicada durante 24h. (I) Citotoxicidad celular de COS-BA libre, NP de COS-BA/Ce6 no irradiadas contra células LO2 y L929 normales. (J) El análisis IC50 de COS-BA contra el cáncer y las células normales. Los datos se expresan como medias DE (n Z 6). *P ˂ 0.05, **P ˂ 0,01 y ***P ˂ 0,001 muestran las diferencias significativas.
Para explorar las posibles razones detrás de esta característica de latencia de la quimioterapia, se evaluó sucesivamente el comportamiento de absorción celular dependiente del tiempo de las NP COS-BA/Ce6 mediante incubación con células cancerosas 4T1. Los resultados indicaron que, aunque las NP COS-BA/Ce6 mostraron una notable extinción de la fluorescencia, aún mostraron una eficiencia fagocítica mejorada en comparación con el Ce6 libre debido a la fluorescencia roja citoplasmática más fuerte, según lo determinado por análisis cuantitativo de citometría de flujo (Fig. 5A). Esta internalización celular mejorada de las NP puede atribuirse a la endocitosis21. En conjunto, especulamos que, aunque los coensamblajes COS-BA/Ce6 NP altamente solubles en agua (ángulo de contacto q: 36,7) exhibieron una endocitosis celular mejorada que el Ce6 lipófilo (q: 132,6, cerca de BA), la eficiencia de fagocitosis reducida de Las NP pueden aparecer en comparación con la molécula anfifílica de COS-BA, lo que parece suprimir la citotoxicidad quimioterapéutica de las NP de COS-BA/Ce6. Es decir, la eficiencia de absorción celular de mayor a menor como tal secuencia: COS-BA anfifílica, NP COS-BA/Ce6 hidrófilas, BA lipofílica o Ce6. Más importante aún, el desmontaje inadecuado de las NP celulares puede ser otra razón importante para el efecto quimioterapéutico debilitado, todo lo cual puede estar relacionado con la inteligente latencia de la quimioterapia de las NP COS-BA/Ce6. Además, debido a que el desmontaje de las NP se realizó específicamente en el ambiente ácido de las células tumorales, para demostrar la característica de respuesta al pH, intentamos comparar los efectos de absorción de las NP de COS-BA/Ce6 en células LO2 normales (Fig. 5B). . Sin embargo, las NP de COS-BA/Ce6 no mostraron una fluorescencia roja de Ce6 significativamente inhibida en células LO2. Por el contrario, el comportamiento de absorción por LO2 fue similar al de las células cancerosas 4T1, lo que sugiere que las NP COS-BA/Ce6 también pueden desmontarse incluso en células normales, lo que puede resultar de los compartimentos intracelulares de pH débilmente ácidos (endosomas/lisosomas) existentes en el interior. tanto cancerosas como normales46. Dado que la absorción celular de NP depende del proceso de endocitosis, la incubación directa del fármaco podría no resaltar la capacidad de respuesta al pH de COS-BA/Ce6 NP a nivel celular. Sin embargo, el microambiente tumoral (TME) es muy ácido en comparación con los tejidos normales47. Independientemente del cáncer intracelular o TME, las NP COS-BA/Ce6 pueden responder al pH y desmontarse para desencadenar la liberación de COS-BA altamente tóxico. Mientras que, en los tejidos normales, las NP COS-BA/Ce6 solo se pueden desmontar después de ingresar a un entorno celular normal, lo que reduce la probabilidad de liberación de COSBA. Por lo tanto, inferimos que la característica de latencia de la quimioterapia de las NP COS-BA/Ce6 en el microambiente tumoral es válida y confiable, y la idea de diseño en el presente estudio es factible.
3.5. Eficacia anticancerígena de quimioterapia/TFD in vitro de COS-BA/Ce6 NP
Además, antes de detallar la eficacia anticancerígena de la quimioterapia/TFD in vitro de las NP COS-BA/Ce6 y para descubrir aún más el mecanismo de endocitosis, estudiamos las cuatro vías principales de endocitosis agregando los inhibidores endocíticos correspondientes, incluida la clorpromazina (mediada por clatrina), el fosfato de cloroquina ( inhibidor de la acidificación lisosómica), nistatina (mediada por caveolas) y un inhibidor de la macropinocitosis EIPA (etilisopropil amilorida) (Fig. 5C y D). Observamos que la introducción de nistatina y clorpromazina podría inhibir más eficientemente la eficiencia fagocítica que EIPA y fosfato de cloroquina, mostrando una fluorescencia celular significativamente menor en comparación con el 37 C normal. Estos resultados indicaron que las NP COS-BA/Ce6 fueron internalizadas por múltiples mecanismos, principalmente a través de las vías de endocitosis mediadas por clatrina y caveolas. Desde el aumento de la generación de 1 O2 a través de interacciones intermoleculares, las NP COS-BA/Ce6 exhiben un rendimiento de ROS intercelular significativamente mayor que el de Ce6, como lo indica la fluorescencia verde más fuerte de la sonda DCFH (Fig. 5E), lo que implica una mayor eficiencia fotodinámica. Los ensayos de MTT demuestran que las NP COS-BA/Ce6 bajo irradiación realizan un efecto de inhibición notablemente mejorado en las células 4T1 que el de Ce6 equivalente, mientras que con una citotoxicidad relativamente moderada sin irradiación (Fig. 5F). Significativamente, la IC50 de Ce6 (0,53 mg/mL) en NP COS-BA/Ce6 fue mucho menor que la de Ce6 libre (1,39 mg/mL) (Fig. 5G), lo que sugiere una eficacia de la TFD notablemente mejorada, que fue Además, se demuestra perfectamente por la citotoxicidad de las NP de COSBA/Ce6 contra células cancerosas humanas MCF-7 y HepG2 (Información de respaldo, figura S19). Asimismo, en comparación con el Ce6 libre, también se observaron valores relativamente más bajos de IC25, IC50 e IC75 en los coensamblajes (Fig. 5G). Mientras tanto, en comparación con la PDT con Ce6 sola y la quimioterapia única de NP en la oscuridad, las NP COS-BA/Ce6 bajo irradiación lograron una quimioterapia/PDT combinada más efectiva contra las tres células cancerosas anteriores, mostrando una sinergia (índice de combinación: IC ˂ 1) ( Figura 5I). Además, la tinción dual de fluorescencia de células vivas/muertas usando éster de calceína-acetoximetilo (calceína-AM) y yoduro de propidio (PI) confirmó aún más que las NP de COS-BA/Ce6 podrían inducir eficientemente la apoptosis y necrosis celular, ya que las células tratadas estaban casi teñidas. con señal de fluorescencia de PI roja cuando se cultiva durante 10 h adicionales después de la irradiación (Fig. 5H). Mientras tanto, las NP de COS-BA/Ce6 no irradiadas (dosis más alta de Ce6: 3,2 mg/ml) también tuvieron cierta actividad quimioterapéutica como se observa en las señales AM y PI simultáneamente. Esta actividad PDT notablemente mejorada de las NP COS-BA/Ce6 se validó aún más mediante la tinción AM/PI después del tratamiento durante 20 h adicionales (Información de respaldo, Fig. S20). Además, al agregar azida de sodio (SA) y D-manitol (DM), un extintor especial separado de 1 O2 y $OH48, a las células 4T1 tratadas con NPs-PDT con COS-BA/Ce6, la viabilidad celular obviamente aumentada implicaba que Las fotorreacciones de tipo I ($OH) y tipo II (1 O2) ocurrieron simultáneamente en el proceso de PDT mediado por COSBA / Ce6 NP (Fig. 5J). Además, las NP COS-BA/Ce6 poseen particularmente una mejor compatibilidad sanguínea, como lo indica la hemólisis insignificante de los glóbulos rojos (Fig. 5K), lo que sugiere el potencial para aplicaciones biomédicas mediante administración intravenosa.
3.6. Biodistribución in vivo de NP COS-BA / Ce6
Posteriormente, antes de la investigación de distribución in vivo, evaluamos la farmacocinética de las NP de COS-BA/Ce6 mediante el control de la concentración de Ce6 en la sangre después de la inyección intravenosa con Ce6 equivalente o NP de COS-BA/Ce6. Los perfiles de concentración-tiempo de Ce6 en la sangre (Fig. 6A) y los parámetros farmacocinéticos comparativos (Tabla de información de respaldo S1) respaldan claramente que las NP de COS-BA/Ce6 tienen una circulación prolongada en el torrente sanguíneo, lo que puede permitir una mayor acumulación en el tumor. sitios. En particular, las NP COS-BA/Ce6 mostraron una rápida eliminación sanguínea en 2 h, lo que implica una biodegradabilidad favorable. En consecuencia, luego investigamos la biodistribución in vivo y la capacidad de acumulación de tumores de las NP COS-BA / Ce6 (Fig. 6B y C). De manera similar a los nanocompuestos de Ce6 reportados universalmente33, las NP COS-BA/Ce6 se pueden distribuir rápidamente por todo el cuerpo. Especialmente durante las primeras 4 h, los ensamblajes exhibieron una emisión de fluorescencia obviamente más fuerte en los sitios del tumor que el Ce6 libre, lo que sugiere una mejor retención y capacidad de acumulación dirigida al tumor de las NP COS-BA/Ce6, probablemente atribuidas al efecto pasivo de retención de permeabilidad mejorada (EPR). proporcionado por las nanopartículas14. Después de 6 h después de la inyección, la intensidad de la fluorescencia en los sitios del tumor disminuyó gradualmente y rápidamente. En particular, a diferencia de los nanocompuestos comúnmente reportados con una acumulación tumoral significativamente mayor en comparación con el fármaco positivo libre29, las NP de COS-BA/Ce6 no mostraron una acumulación muy prominente en los sitios del tumor a las 24 h después de la inyección que el Ce6 libre (Fig. 6C), que fue respaldado aún más por las imágenes del tumor extirpado (Fig. 6D y E). La excelente biodegradabilidad de las NP puede ser responsable de la introducción de pequeñas moléculas orgánicas naturales. Esto también se observó con otros nanoensamblajes mediados por moléculas pequeñas de otros terpenoides49. Además, las NP de COS-BA/Ce6 también mostraron una distribución tisular similar a la del Ce6 libre (Fig. 6E), y la intensidad de fluorescencia promedio ex vivo fue generalmente menor que la presentada in vivo, lo que implica además una buena biodegradabilidad. Además, considerando la estrecha diferencia en el nivel de fluorescencia entre 2 y 4 h después de la inyección de NP y Ce6, así como la operatividad experimental que permite intervalos suficientes para la irradiación, se eligió 4 h después de la administración como el punto de tiempo de luz para la terapia TFD posterior.
Teniendo en cuenta la acumulación de tumores no muy prominente a las 24 h que el Ce6 libre, para validar aún más el mayor efecto EPR que tienen las NP COS-BA/Ce6, monitoreamos inmediatamente las imágenes de fluorescencia ex vivo de los tumores en diferentes momentos después de la inyección intravenosa con nanofármacos ( Figuras 6F y G). Sorprendentemente, ya sea a los 20 minutos o a las 12 h después de la inyección, las NP de COS-BA/Ce6 mostraron una emisión de fluorescencia más fuerte en los sitios del tumor que el Ce6 libre, lo que demuestra una capacidad de acumulación de tumor excelente y mejorada. Mientras tanto, a medida que pasaba el tiempo, las intensidades de fluorescencia retenidas en el tejido tumoral se debilitaron gradualmente (Fig. 6G), lo que es totalmente consistente con los resultados de las imágenes de fluorescencia en animales in vivo. Claramente, este rápido metabolismo biológico y la mayor acumulación de tumores evitaron la posible toxicidad por acumulación a largo plazo, lo que garantiza una terapia antitumoral altamente eficiente con mayor bioseguridad.
Figura 5 Eficacia anticancerígena in vitro de las NP COS-BA/Ce6. Internalización celular de (A) células cancerosas 4T1 y (B) células normales LO2 incubadas en NP Ce6 o COS-BA/Ce6 libres durante 0. 5 y 3 h, y el correspondiente análisis de citometría de flujo de la intensidad de la fluorescencia. (C) Inhibición de la captación de estudios de vías endocíticas específicas y (D) intensidad de fluorescencia correspondiente de las células medida por citometría de flujo después de la incubación con NP COSBA/Ce6 con/sin inhibidores endocíticos que incluyen clorpromazina, cloroquina, nistatina y etilisopropil amilorida (EIPA). Barras de escala Z 20 mm. (E) Generación de ROS celular inducida por NP de Ce6 o COS-BA/Ce6 libres (Ce6 equivalente: 1,6 mg/ml). Barras de escala Z 20 mm. (F) Viabilidad celular de células 4T1 después de varios tratamientos durante 24 h. (G) El análisis IC25, IC50, IC75 de NP Ce6 y COS-BA/Ce6 libres contra células 4T1, MCF-7 y HepG2, respectivamente. (H) Tinción viva/muerta con calceína-AM/yoduro de propidio (PI) de células 4T1 tratadas con COS-BA/Ce6 NP (Ce6: 1,6 mg/ml) después de la incubación durante 10 h adicionales, así como COS- NP BA/Ce6 (Ce6: 3,2 mg/ml). Barras de escala Z 50 mm. (I) Índice de combinación (CI) de NP COS-BA/Ce6 en células 4T1, MCF-7 y HepG2, según lo determinado por el cálculo del teorema de Chou Talalay. (J) Mecanismos de PDT (Tipo I y Tipo II) inducidos por la irradiación de NP COS-BA/Ce6 y evaluados por azida sódica (SA) y D-manitol (DM) extintores específicos de 1 O2 y $OH, respectivamente. (K) Porcentaje de hemólisis de glóbulos rojos después de la incubación con NP COS-BA/Ce6 durante 4 h. Los datos se expresan como medias DE (n Z 3). *P ˂ 0,05, **P ˂ 0,01 y ***P ˂ 0,001 muestran las diferencias significativas.
Figura 6 Circulación sanguínea in vivo y biodistribución de NP COS-BA/Ce6. (A) Perfiles de concentración-tiempo de Ce6 en la sangre después de inyecciones intravenosas de Ce6 equivalente o NP COS-BA/Ce6 coensamblados (n Z 3). (B) Imágenes de fluorescencia de cuerpo entero de ratones con tumores 4T1 después de inyecciones intravenosas de los fármacos indicados en varios momentos. (C) Intensidad de fluorescencia promedio obtenida de los sitios del tumor en (B). (D) Imágenes de fluorescencia ex vivo de tumores y órganos principales extirpados de los ratones anteriores a las 24 h, y el resultado cuantitativo de intensidad de fluorescencia correspondiente (E) (n Z 3). (F) Imágenes de fluorescencia ex vivo de tumores y órganos principales en diferentes momentos después de inyecciones iv de Ce6 o COS-BA/Ce6 NP, y (G) análisis de intensidad de fluorescencia correspondiente de los tumores. Los datos se expresan como medias DE (n Z 3).
3.7. Tratamiento antitumoral combinatorio de quimioterapia in vivo/TFD
Motivado por la característica única de latencia, buena biodegradabilidad y actividad de PDT, se investigó la terapia antitumoral combinada de quimioterapia/PDT in vivo. Los ratones portadores de tumores 4T1 se dividieron aleatoriamente en 6 grupos y se les inyectó por vía intravenosa Ce6 equivalente (3,5 mg/kg de cuerpo) cada 2 días para un total de tres dosis. 4 h después de la inyección, los sitios tumorales de los ratones en los grupos de luz se irradiaron durante 15 minutos (Fig. 7A). Mientras tanto, los volúmenes tumorales o los pesos corporales correspondientes se registraron cada dos días. Después de 14 días de tratamiento (Fig. 7B), el Ce6 libre con irradiación y el COS-BA libre fueron ineficaces en la supresión del tumor, probablemente debido a la acumulación limitada del fármaco en el tejido tumoral. Por el contrario, después de la irradiación de NP COS-BA/Ce6, se observó la inhibición tumoral más significativa, lo que valida la excelente eficiencia de la combinación quimioterapia/TFD. Los pesos promedio de los tumores (Fig. 7D) y las fotografías correspondientes de los tumores disecados (Fig. 7E) demostraron la mejor eficacia antitumoral de las NP COS-BA/Ce6 bajo irradiación, ya que los ratones tratados mostraron los tamaños de tumores más pequeños que los de otros grupos. La proporción media de inhibición tumoral de las NP de COS-BA/Ce6 tratadas con TFD alcanzó el 80,3%, superior a la de la TFD con Ce6 libre (42,4%) y la de COS-BA libre (38,5%). En particular, aunque estudios in vitro previos han demostrado que las NP de COS-BA/Ce6 sin luz mostraron una función latente de actividad quimioterapéutica, todavía realizan una eficiencia antitumoral mejorada (49,5%) en comparación con el COS-BA libre (Fig. 7D). Especulamos que dos posibles razones contribuyen a este resultado, una es la mayor acumulación tumoral de NP COS-BA/Ce6 debido al efecto EPR ampliamente informado. Otro factor es el microambiente tumoral débilmente ácido que estimuló la liberación de COS-BA altamente tóxico. Debido a la mayor concentración micelar crítica (CMC, 187 mg/mL) de COS-BA (Información de respaldo, Fig. S21), podría existir en estado de monómero en el entorno del tumor, favoreciendo así la quimioterapia mejorada de COS-BA no irradiado. BA/Ce6 NP. Además, para verificar aún más la eficacia anticancerígena superior de las NP COS-BA / Ce6, se realizó una tinción de tumores con hematoxilina y eosina (H&E) (Fig. 7G).
Figura 7 Estudio de eficacia con un modelo de xenoinjerto 4T1 subcutáneo. (A) Ilustración esquemática del tratamiento con TFD in vivo. (B) Perfiles de crecimiento tumoral, (C) cambios en el peso corporal y (D) pesos tumorales extirpados que contienen proporciones de inhibición tumoral de ratones portadores de 4T1-después de diversos tratamientos en los grupos indicados (n Z 5 para cada grupo). (E) Imágenes de tumores extirpados de ratones representativos después del tratamiento. (F) Análisis de bioquímica sérica después del tratamiento con NP COS-BA/Ce6 durante 14 días. (G) Tinción H&E representativa de secciones de tumores extirpados después de diferentes tratamientos. Barras de escala Z 50 mm. (H) Tinción TUNEL de secciones tumorales tratadas con PDT con Ce6 libre y COS-BA/Ce6 NP. Barras de escala Z 20 mm **P < 0,01 indica las diferencias significativas.
Los resultados indicaron que las secciones de tumores tratadas con COS-BA/Ce6 NPs-PDT mostraron un grave deterioro del tejido y deficiencia de núcleos, mientras que en los otros grupos se observó necrosis tisular moderada. Simultáneamente, en comparación con la luz Ce6 libre, las NP COS-BA/Ce6 bajo irradiación aumentaron notablemente el número de células TUNEL positivas que muestran una tinción nuclear marrón más fuerte (Fig. 7H), lo que confirma aún más la excelente terapia combinada de quimioterapia/TFD. Además, no se observaron variaciones obvias en el peso corporal en todos los grupos (Fig. 7C). Incluso si los grupos COSBA/Ce6 NP o Ce6 light tuvieron una modesta pérdida de peso corporal durante la administración, el peso corporal volvió a la normalidad después de unos días. No se pudo encontrar daño evidente o lesión inflamatoria en los órganos principales extraídos al final de los tratamientos (Información de respaldo, Fig. S22), lo que indica la baja o nula toxicidad sistémica y la buena bioseguridad de las NP de COS-BA/Ce6. Además, aunque las NP COS-BA/Ce6 se acumulan principalmente en el tejido hepático, los marcadores de función hepática correspondientes (ALT, AST y ALP) no mostraron cambios significativos en comparación con ratones sanos normales (Fig. 7F), lo que sugiere una mejor biocompatibilidad. Además, los marcadores de función renal (BUN, CRE y UA) y los parámetros bioquímicos (ALB y TBIL) también parecían ser similares a los de ratones normales, lo que implica además una mejor bioseguridad. Claramente, estos coensamblajes COS-BA/Ce6 NP mediados por COS-BA de molécula pequeña orgánica de profármaco poseen múltiples características terapéuticas favorables que abren posibilidades atractivas para aplicaciones en medicina clínica.
3.8. Inmunidad antitumoral de quimioterapia/PDT combinada y bloqueo anti-PD-L1
Recientemente, numerosos estudios innovadores han demostrado que la combinación de inmunoterapia contra el cáncer con otras modalidades de tratamiento podría despertar eficazmente respuestas inmunitarias específicas de tumores para la eliminación de tumores primarios o distantes1. Alentados por la función única de latencia de la quimioterapia y la excelente eficacia antitumoral de la quimioterapia/PDT de las NP COS-BA/Ce6, nos preguntamos si también podría desencadenar respuestas inmunológicas con la ayuda de un adyuvante inmunológico anti-PD-L1 para provocar una terapia antitumoral altamente eficiente. . ¿Podría tratar tumores distantes que no pueden tratarse directamente mediante TFD, proporcionando así una estrategia alternativa para aplicaciones clínicas contra el cáncer? Para probar esta hipótesis, en este estudio, se estableció un modelo de "dos tumores" y en la Fig. 8A se muestran procedimientos experimentales detallados. Normalmente, se inocularon dos tumores 4T1 en los flancos izquierdo y derecho de cada ratón. Teniendo en cuenta que el anti-PD-L1 por sí solo no tiene un efecto inmunoterapéutico notorio50, los experimentos se dividieron en 5 grupos, incluido un grupo no tratado, COS-BA/Ce6 NP, COS-BA/Ce6 NP con anti-PD-L1, COS- NP BA/Ce6 con luz, NP COS-BA/Ce6 con luz y anti-PD-L1. Después de una única inyección iv de NP (Ce6: 3,5 mg/kg), los tumores derechos (tumor primario) en los grupos de luz se irradiaron durante 15 minutos para evaluar los efectos inmunológicos de la PDT/quimioterapia, mientras que los tumores izquierdos (tumores distantes) en todos los grupos sin ningún tratamiento fueron seleccionados para quimioterapia individual. Posteriormente, en los días 2, 4 y 6, a los ratones de los grupos inmunes se les inyectó por vía intravenosa anticuerpo anti-PD-L1 (15 mg por ratón por inyección) hasta un total de tres dosis. Significativamente, independientemente del tratamiento con TFD o no, las NP de COS-BA/Ce6 más anti-PD-L1 podrían inhibir eficazmente la progresión del tumor primario (Fig. 8B). Y los correspondientes índices promedio de inhibición tumoral alcanzaron por separado 86.7 % (irradiación) y 76,5 % (sin irradiación), mucho más altos que el tratamiento con quimioterapia individual (5,7 %) o quimioterapia/TFD (27,4 %) (Fig. 8C). . Las fotografías de tumores disecados (Fig. 8D) y ratones portadores de 4T1- (Información de respaldo, Fig. S23) después de 14 días de tratamiento también respaldaron visualmente la conclusión anterior. Estos resultados sugirieron que tanto la quimioterapia basada en NP como la quimioterapia/TFD podrían activar eficazmente la inmunidad antitumoral. Mientras tanto, lo más sorprendente es que el bloqueo anti-PD-L1 más NP también ofreció un notable efecto de inhibición tumoral en tumores distantes (izquierdos) no irradiados (Fig. 8E y F), generalmente más fuerte que las NP COS-BA/Ce6 solas, que fueron también confirmado por los correspondientes tumores disecados y imágenes de ratones después del tratamiento (Fig. 8D y Fig. S23), lo que demuestra aún más la eficiente respuesta inmune antitumoral inducida por COS-BA / Ce6 NP.
Para explorar completamente esta eficiente respuesta inmune antitumoral, se evaluaron más a fondo los linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+, un inmunocito crítico para la inmunoterapia contra el cáncer4, analizando las células inmunes en los tumores derecho o izquierdo después de 14 días de tratamiento. Se descubrió que las NP de COS-BA / Ce6 más anti-PD-L1 con o sin tratamiento con TFD inducían una infiltración robusta de CTL CD8+ en los tumores primarios (Fig. 8H y J). La infiltración de CD8þ CTL fue de hasta el 11,3 % después de la quimioterapia/TFD basada en COS-BA/Ce6 NP más tratamiento anti-PD-L1, ligeramente mayor que la de COS-BA/Ce6 NP más anti-PD-L1 (9,63 %), y mucho más alto que en otros grupos sin anti-PD-L1, incluido el tratamiento con quimioterapia basada en COS-BA/Ce6 NP (5,12%) o quimioterapia/TFD sola (4,07%). De manera similar, en comparación con los grupos no inmunes, también se observó un aumento significativo de la infiltración de CTL en los tumores izquierdos (distantes) de los ratones después de NP COS-BA/Ce6 más antiPD-L1 con o sin tratamiento con TFD (Fig. 8I y K), además lo que implica respuestas inmunes altamente efectivas inducidas por quimioterapia o terapia combinada de quimioterapia/TFD. Mientras tanto, después de la introducción de anti-PD-L1, tanto la quimioterapia basada en COS-BA/Ce6- como la quimioterapia/PDT condujeron a una producción sólida de múltiples citocinas que desempeñan funciones fundamentales en la regulación de las funciones citotóxicas de los CTL8, incluidas las tumorales. factor de necrosis alfa (TNF-a) (Fig. 8L) e interferón-gamma (IFN-g) (Fig. 8M) en las muestras de suero de ratones después de 14 días de tratamiento, lo que respalda aún más que hubo respuestas inmunes antitumorales eficientes. Además, no se observaron cambios aparentes en el peso corporal en los diferentes grupos de tratamiento (Fig. 8N), lo que indica la bioseguridad favorable de esta combinación de quimioterapia/TFD/inmunoterapia. En conjunto, encontramos que, aunque las NP anti-PD-L1 más COSBA/Ce6 con luz mostraron una proporción de inhibición tumoral ligeramente mayor (86.7%) que el grupo no irradiado (76,5%) contra los tumores correctos. Debido a la influencia de la TFD (Fig. 8B-D), no se observaron diferencias significativas en los efectos terapéuticos en los tumores izquierdos en presencia (77,8%) o ausencia (78,4%) de TFD (Fig. 8E-G). Especulamos que las siguientes posibles razones conducen a este fenómeno. En primer lugar, en cuanto al mecanismo de la quimioterapia o la PDT que mejora los efectos inmunológicos del bloqueo del punto de control anti-PD-L1, estudios acumulados han demostrado que estas modalidades de tratamiento podrían desencadenar una inflamación aguda en el área del tumor, aumentando así la presentación de antígenos asociados al tumor a T células, induciendo así a las células cancerosas a someterse a ICD8,9. Las células tumorales sometidas a ICD regularían positivamente las señales de "cómeme" al exponer la calreticulina (CRT) en las superficies de las células tumorales que mueren inmunogénicamente y las señales de "peligro" al liberar la caja del grupo 1 de alta movilidad (HMGB1), promoviendo la activación de las células dendríticas. para activar los CTL, cuya actividad podría mejorarse mediante anti-PD-L1, lo que daría como resultado una inmunoterapia anticancerígena significativamente mejorada51.
Figura 8 Efecto antitumoral de la quimioterapia/TFD basada en COS-BA/Ce6 NP más inmunoterapia anti-PD-L1 con bloqueo de puntos de control. (A) Ilustración esquemática de quimioterapia/PDT basada en CNP con terapia anti-PD-L1. (BeD) (B) Los perfiles de crecimiento tumoral, (C) pesos promedio de los tumores e (D) imágenes de tumores extirpados de ratones representativos para tumores primarios (derecha) después de varios tratamientos durante 14 días como se indica. (EeG) (E) Las curvas de crecimiento del tumor, (F) pesos promedio de los tumores y (G) imágenes de tumores extirpados para tumores distantes (izquierda) no irradiados después de diferentes tratamientos, según se indica. (H) Las poblaciones de células T CD8+ en tumores derechos y (J) los porcentajes de infiltración de CTL se detectaron cuantitativamente mediante citometría de flujo después de 14 días de tratamiento. (I, K) Las poblaciones de células T CD8+ en tumores izquierdos el día 14 se detectaron cuantitativamente mediante citometría de flujo (n Z 3). Secreción de citocinas en sueros después de 14 días de tratamiento, incluidos (L) IFN-g y (M) TNF-a, medida mediante ensayo ELISA (n Z 3). (N) Cambios en el peso corporal de los ratones durante varios tratamientos. *P < 0.05, **P < 0.01 y ***P < 0,001 muestran las diferencias significativas.
En segundo lugar, en este trabajo, las NP COS-BA/Ce6 podrían distribuirse en los tumores izquierdo y derecho simultáneamente; tanto la quimioterapia izquierda como la quimioterapia/PDT derecha tienen un enorme potencial para inducir células tumorales sometidas a ICD. Mientras tanto, las NP COS-BA/Ce6 se administran en una sola dosis, la inmunoterapia depende principalmente de tres dosis de anti-PD-L1, ya sea quimioterapia o quimioterapia/PDT, son solo cebadores. Las diferencias terapéuticas en la inducción de ICD de células tumorales entre la quimioterapia individual y los tratamientos combinados de quimioterapia/TFD podrían no ser muy destacadas. El porcentaje de CTL CD8+ en los tumores izquierdo (Fig. 8I y K) y derecho (Fig. 8H y J) también apoyó la especulación anterior; no se observó ninguna diferencia significativa en los CTL CD8+ en presencia o ausencia de TFD. Por lo tanto, las NP COS-BA/Ce6 más anti-PD-L1 con o sin irradiación lograron una eficacia anticancerígena similar contra los tumores izquierdos. Además, debido a que las células 4T1 expresan niveles bajos de PD-L152, se ha demostrado ampliamente que el anti-PD-L1 solo tiene algún efecto inmunoterapéutico notable en los cánceres de mama 4T153,54. A pesar de que los efectos de la ICD mediados por las NP COS-BA/Ce6 justifican una mayor investigación, los resultados presentados han demostrado que las NP COS-BA/Ce6 logran respuestas inmunes notablemente mejoradas con la ayuda de anti-PD-L1. En conjunto, parece que las NP COS-BA/Ce6 de hecho potenciaron la inmunoterapia anti-PD-L1 contra el cáncer, no solo una terapia combinada. Aunque las NP anti-PD-L1 más COS-BA/Ce6 con o sin tratamiento con TFD no mostraron diferencias significativas en los efectos terapéuticos, ambas mostraron una eficacia antitumoral obviamente mejorada en comparación con una dosis de NP COS-BA/Ce6. Es decir, incluso sin tratamiento con luz, una vez que se introdujo el adyuvante inmunológico antiPD-L1, la inmunogenicidad de los residuos tumorales después de la quimioterapia con COS-BA/Ce6 NP puede potenciarse, lo que da como resultado respuestas inmunes antitumorales sistémicas notables, lo que lleva a una supresión efectiva. de tumores primarios o distantes. Por lo tanto, debería ser posible eliminar los tumores primarios y metastásicos durante la inmunoterapia clínica contra el cáncer con tratamientos repetidos con NP. Claramente, estos resultados en conjunto proporcionan evidencia de respuestas inmunes antitumorales altamente efectivas y sinérgicas inducidas por NP COS-BA/Ce6 en combinación con un bloqueo anti-PD-L1, ya sea con quimioterapia sola o en combinación con quimioterapia/TFD.
cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico
4. Conclusiones
En resumen, diseñamos, sintetizamos y desarrollamos intencionalmente un nanoprofármaco fotoquimioterapéutico transformado COS-BA/Ce6 NP biocompatible, biodegradable, poco tóxico pero altamente eficiente y clínicamente disponible mediante la combinación de tres componentes multifuncionales, ácido betulínico de molécula pequeña natural autoensamblado. (BA), un COS soluble en agua y un fotosensibilizador Ce6 de baja toxicidad para quimioterapia combinada/TFD. Posteriormente, desencadena respuestas inmunitarias antitumorales altamente eficaces y sinérgicas en combinación con un bloqueo anti-PD-L1, ya sea con quimioterapia sola o en combinación con quimioterapia/TFD. Específicamente, mostramos que la disposición molecular de la red hueca podría facilitar la formación de nanopartículas con estructura de capa. Las modificaciones de COS solubles en agua podrían mejorar en gran medida la actividad anticancerígena de pequeñas moléculas naturales lipófilas mediante la construcción de un profármaco anfifílico. También mostramos que los nanofármacos resultantes mostraron múltiples características terapéuticas favorables, especialmente una función inteligente de "latencia" con efectos insidiosos de la quimioterapia. Combinados con la distintiva capacidad de respuesta al pH, estos coensamblajes tienen una baja toxicidad y bioseguridad con el tejido normal, pero son altamente tóxicos para los tejidos tumorales. Junto con la generación mejorada de 1 O2, la buena biodegradabilidad y la biocompatibilidad, todo lo cual contribuyó a la quimioterapia/PDT/inmunoterapia anticancerígena altamente eficiente, sinérgica y segura. En particular, la quimioterapia individual sin tratamiento con PDT puede activar respuestas inmunes antitumorales sistémicas, abriendo posibilidades atractivas para la inmunoterapia de quimioterapia anticancerígena clínicamente sinérgica. En general, este trabajo proporciona información prometedora para el desarrollo de nanoinmunoestimulantes naturales, multifuncionales, altamente bioactivos y poco tóxicos para la inmunoterapia clínica.
Referencias
1. Sang W, Zhang Z, Dai YL, Chen XY. Avances recientes en la inmunoterapia combinada sinérgica contra el cáncer basada en nanomateriales. Chem Soc Rev 2019;48:3771e810.
2. Li XY, Guo XM, Ling JB, Tang Z, Huang GN, He LZ, et al. Inmunoterapias contra el cáncer basadas en nanomedicinas desarrolladas mediante la reprogramación de macrófagos asociados a tumores. Nanoescala 2021;13:4705e27.
3. Chao Y, Xu LG, Liang C, Feng LZ, Xu J, Dong ZL, et al. La terapia combinada con radioisótopos inmunoestimulantes locales y el bloqueo de los puntos de control inmunitarios sistémicos imparten potentes respuestas antitumorales. Nat Biomed Eng 2018;2:611e21.
4. Wen YY, Chen X, Zhu XF, Gong YC, Yuan GL, Qin XY, et al. Las nanopartículas integradas de quimioterapia fototérmica con respuesta al microambiente tumoral mejoraron la inducción de muerte celular inmunogénica para un tratamiento eficaz del cáncer colorrectal. Interfaces ACS Appl Mater 2019;11:43393e408.
5. Peng JR, Xiao Y, Yang Q, Liu QY, Chen Y, Shi K, et al. La agregación intracelular de nanoensamblajes de moléculas pequeñas reprogramadas con péptidos mejora la quimioterapia contra el cáncer y la inmunoterapia combinatoria. Acta Pharm Sin B 2021;11:1069e82.
6. Song W, Kuang J, Li CX, Zhang MK, Zheng DW, Zeng X, et al. Inmunoterapia mejorada basada en terapia fotodinámica para la erradicación de tumores primarios y de metástasis pulmonares. ACS Nano 2018;12: 1978e89.
7. Wang C, Xu LG, Liang C, Xiang J, Peng R, Liu Z. Respuestas inmunológicas desencadenadas por la terapia fototérmica con nanotubos de carbono en combinación con la terapia anti-CTLA-4 para inhibir la metástasis del cáncer. Adv Mater 2014;26:8154e62.
8. Él CB, Duan XP, Guo NN, Chan C, Poon C, Weichselbaum RR, et al. Los polímeros de coordinación a nanoescala núcleo-cubierta combinan quimioterapia y terapia fotodinámica para potenciar la inmunoterapia contra el cáncer con bloqueo de puntos de control. Nat Commun 2016;7:12499.
9. Galluzzi L, Buque A, Kepp O, Zitvogel L, Kroemer G. Muerte celular inmunogénica en cáncer y enfermedades infecciosas. Nat Rev Immunol 2017;17: 97e111.
10. Chiang CS, Lin YJ, Lee R, Lai YH, Cheng HW, Hsieh CH, et al. Una combinación de inmunomoduladores y nanopartículas magnéticas a base de fucoidan mejora la inmunoterapia localizada en tumores. Nat Nanotechnol 2018;13:746e54.
11. Zheng XL, Ge JC, Wu JS, Liu WM, Guo L, Jia QY, et al. Nanovesícula biodegradable derivada de hipocretina como teranóstico impulsado por luz infrarroja cercana para la terapia y la obtención de imágenes fotoactivas duales del cáncer. Biomateriales 2018;185:133e41.
12. Spicer CD, Jumeaux C, Gupta B, Stevens MM. Plataformas versátiles de conjugados de nanopartículas de péptidos y proteínas para aplicaciones biomédicas. Chem Soc Rev 2018;47:3574e620.
13. Mei YL, Wang RB, Jiang W, Bo Y, Zhang TF, Yu JL, et al. Progresos recientes en nanomateriales para la administración de ácidos nucleicos en la inmunoterapia del cáncer. Biomater Sci 2019;7:2640e51.
14. Zheng YL, Ye JX, Li ZY, Chen HJ, Gao Y. Progresos recientes en la terapia sonofotodinámica contra el cáncer: desde nuevos sensibilizadores desarrollados hasta estrategias de mejora de la eficacia basadas en nanotecnología. Acta Pharm Sin B 2021;11:2197e219.
15. Li SK, Zou QL, Li YX, Yuan CQ, Xing RR, Yan XH. Metalonanofármacos fotodinámicos supramoleculares inteligentes basados en péptidos diseñados mediante autoensamblaje de coordinación multicomponente. J Am Chem Soc 2018; 140:10794e802.
16. Zhi KK, Wang JC, Zhao HT, Yang X. Gel de producto natural de molécula pequeña autoensamblado para la administración de fármacos: un gran avance en una nueva aplicación de productos naturales de molécula pequeña. Acta Pharm Sin B 2020;10: 913e27.
17. Yang X, Ma C, Chen ZM, Liu J, Liu FY, Xie RB, et al. Las nanopartículas ensambladas con una única molécula pequeña median en la administración oral eficiente de fármacos. Nano Res 2019;12:2468e76.
18. Zhi KK, Zhao HT, Yang X, Zhang H, Wang JC, Wang J, et al. Gelificantes de productos naturales y método general para su obtención a partir de organismos. Nanoescala 2018;10:3639e43.
19. Cheng JJ, Fu SY, Qin Z, Han Y, Yang X. Ácidos diterpénicos de molécula pequeña naturales autoensamblados con actividad anticancerígena favorable y bioseguridad para quimioterapia antitumoral mejorada sinérgicamente. J Mater Chem B 2021;9:2674e87.
20. Wang JC, Zhao HT, Zhi KK, Yang X. Exploración del proceso de carga de fármacos de molécula pequeña activa natural y eficacia antitumoral sinérgica altamente eficiente. Interfaces ACS Appl Mater 2020;12:6827e39.
21. Cheng JJ, Zhao HT, Yao L, Li Y, Qi BK, Wang J, et al. Esteroles autoensamblados naturales simples y multifuncionales con fotosensibilizadores supramoleculares mediados por actividad anticancerígena para una terapia fotodinámica antitumoral mejorada. Interfaces ACS Appl Mater 2019;11: 29498e511.
22. Cheng JJ, Zhao HT, Wang JC, Han Y, Yang X. Coensamblaje bioactivo natural de moléculas pequeñas sintonizadas de fármacos fotosensibles para una fotoquimioterapia de tipo I mejorada, sinérgica y altamente eficiente. Interfaces ACS Appl Mater 2020;12:43488e500.
23. Wang JC, Zhao HT, Qiao WS, Cheng JJ, Han Y, Yang X. Nanomedicina-cum-portador mediante coensamblaje de pequeños productos naturales para acciones antitumorales mejoradas sinérgicas con acciones protectoras de tejidos. Interfaces ACS Appl Mater 2020;12:42537e50.
24. Xi JC, Liu HP. Avances recientes en el diseño de vacunas y fármacos anfifílicos de autoadministración. Adv Ther 2019;3:1900107.
25. Zhang RS, Qin XF, Kong FD, Chen PW, Pan GJ. Mejora de la captación celular de entidades terapéuticas mediante la interacción con componentes de la membrana celular. Entrega de drogas 2019;26:328e42.
26. Pujals S, Giralt E. Péptidos anfipáticos penetrantes en células ricos en prolina. Adv Drug Deliv Rev 2008;60:473e84.
27. Karimi M, Ghasemi A, Sahandi Zangabad P, Rahighi R, Moosavi Basri SM, Mirshekari H, et al. Micro/nanopartículas inteligentes en sistemas de administración de genes/fármacos que responden a estímulos. Chem Soc Rev 2016;45: 1457e501.
28. Cheng JJ, Li XY, Wang S, Han Y, Zhao HT, Yang X. Profármacos triterpénicos sin portador con respuesta al glutatión y bioseguridad para fotoquimioterapia mejorada sinérgicamente. Interfaces ACS Appl Mater 2021;13:245e56.
29. Li XS, Lee SY, Yoon J. Los fotosensibilizadores supramoleculares rejuvenecen la terapia fotodinámica. Chem Soc Rev 2018;47:1174e88.
30. Zou P, Yuan SJ, Yang X, Guo YZ, Li LN, Xu CW, et al. Caracterización estructural y efectos antitumorales de los oligosacáridos de quitosano contra el tumor hepático ortotópico a través de la vía de señalización NF-kB. J Funct Foods 2019;57:157e65.
31. Zhai XC, Yuan SJ, Yang X, Zou P, Li NL, Li GY, et al. Los oligosacáridos de quitosano inducen la apoptosis en el carcinoma renal humano a través del estrés del retículo endoplásmico dependiente de especies reactivas de oxígeno. J Agric Food Chem 2019;67:1691e701.
32. Deng G, Ma C, Zhao HT, Zhang SQ, Liu J, Liu FY, et al. Terapia combinada antiedema y antioxidante para el accidente cerebrovascular isquémico mediante nanopartículas de ácido betulínico cargadas con glibenclamida. Theranóstica 2019;9: 6991e7002.
33. Liu K, Xing RR, Zou QL, Ma GH, Mo¨hwald H, Yan XH. Autoensamblaje simple de fotosensibilizadores sintonizado con péptidos para la terapia fotodinámica contra el cáncer. Angew Chem Int Ed Engl 2016;55:3036e9.
34. Li Y, Lin JY, Wang PY, Luo Q, Lin HR, Zhang Y, et al. Nanofármaco inspirado en el virus autodireccional de inversión de forma sensible al microambiente tumoral para quimioterapia fototérmica de infrarrojo cercano II guiada por imágenes. ACS Nano 2019;13:12912e28.
35. Sawada SI, Sato YT, Kawasaki R, Yasuoka JI, Mizuta R, Sasaki Y, et al. Ensamblaje híbrido de nanogel para la administración intracelular de exosomas: efectos sobre la endocitosis y la fusión mediante la ingeniería de polímeros de superficie de exosomas. Biomater Sci 2020;8:619e30.
36. Chou TC. Bases teóricas, diseño experimental y simulación computarizada de sinergismo y antagonismo en estudios de combinación de fármacos. Pharmacol Rev 2006;58:621e81.
37. Zhao YP, Zhao YN, Ma QS, Sun B, Wang QP, Ding Z, et al. Nanobarras de doble función y sin portadores mediante autoensamblaje de moléculas de fármacos puros para terapia quimiofotodinámica sinérgica. Int J Nanomed 2019;14:8665e83.
38. Ma X, Zhao YL. Aplicaciones biomédicas de sistemas supramoleculares basados en interacciones huésped-huésped. ChemRev 2015;115:7794e839.
39. Qin XH, Zhang MZ, Hu X, Du Q, Zhao ZP, Jiang Y, et al. Nanoingeniería de un derivado de clorina e6 de nuevo diseño para terapia fotodinámica amplificada mediante la regulación del metabolismo del lactato. Nanoescala 2021;13:11953e62.
40. Du Q, Qin XH, Zhang MZ, Zhao ZP, Li Q, Ren XM, et al. Un nanofármaco sin portador regulable por el metabolismo mitocondrial para amplificar la sensibilidad de la terapia fototérmica. Chem Commun (Camb) 2021;57:8993e6.
41. Li XS, Yu S, Lee D, Kim G, Lee B, Cho Y, et al. Enfoque supramolecular sencillo para los nanoteranásticos activables impulsados por ácidos nucleicos que superan los inconvenientes de la terapia fotodinámica. ACS Nano 2018; 12:681e8.
2. Gilson RC, Black KC, Lane DD, Achilefu S. El nanofotosensibilizador híbrido de TiO2-rutenio produce sinérgicamente especies reactivas de oxígeno en condiciones hipóxicas y normóxicas. Angew Chem Int Ed Engl 2017;56:10717e20.
43. Xu SD, Yuan YY, Cai XL, Zhang CJ, Hu F, Liang J, et al. Ajuste de la brecha de energía singlete-triplete: un enfoque único para fotosensibilizadores eficientes con características de emisión inducida por agregación (AIE). Ciencia química 2015;6:5824e30.
44. Wu WB, Mao D, Xu SD, Kenry, Hu F, Li XQ, et al. Fotosensibilización mejorada por polimerización. Química 2018;4:1937e51.
45. Kundu PK, Samanta D, Leizrowice R, Margulis B, Zhao H, Bo¨rner M, et al. Autoensamblaje controlado por luz de nanopartículas no fotorresponsivas. Nat Chem 2015;7:646e52.
46. Miyazaki M, Yuba E, Hayashi H, Harada A, Kono K. Liposomas modificados con polímeros sensibles al pH a base de ácido hialurónico para sistemas de administración de fármacos intracelulares específicos de células. Bioconjug Chem 2018;29:44e55.
47. Zhang JY, Liu ZN, Lian P, Qian J, Li XW, Wang L, et al. Imágenes selectivas y muerte de células cancerosas mediante fluorescencia del infrarrojo cercano conmutable por pH y efectos fototérmicos. Chem Sci 2016;7:5995e6005.
48. Cheng JJ, Tan GH, Li WT, Zhang HY, Wu XD, Wang ZQ, et al. Síntesis fácil de nanopartículas fluorescentes magnéticas multifuncionales asistidas por quitosano Fe3O4@SiO2@CS@pyropheophorbide-a para terapia fotodinámica. Nuevo J Chem 2016;40:8522e34.
49. Cheng JJ, Wang S, Zhao HT, Liu Y, Yang X. Exploración del mecanismo de autoensamblaje y la quimiofototerapia antitumoral sinérgica eficaz de un nanofármaco fotosensible mediado por un profármaco de ácido ursólico biodegradable y sensible al glutatión. Biomater Sci 2021;9: 3762e75.
50. Yang Y, Xu J, Sun Y, Mo LT, Liu B, Pan XS, et al. Reacción informática lógica basada en aptámeros en células vivas para permitir una terapia de bloqueo de puntos de control inmunológico sin anticuerpos. J Am Chem Soc 2021;143: 8391e401.
51. Kuai R, Yuan WM, Son SJ, Nam J, Xu Y, Fan YC, et al. Eliminación de tumores establecidos con quimioinmunoterapia combinada basada en nanodiscos. Ciencia avanzada 2018;4:eaao1736.
52. Lesniak WG, Chatterjee S, Gabrielson M, Lisok A, Wharram B, Pomper MG, et al. Detección de PD-L1 en tumores mediante [(64)Cu]atezolizumab con PET. Bioconjug Chem 2016;27:2103e10.
53. Sagiv-Barfi I, Kohrt HEK, Czerwinski DK, Ng PP, Chang BY, Levy R. La inmunidad antitumoral terapéutica mediante el bloqueo de puntos de control se ve reforzada por ibrutinib, un inhibidor tanto de BTK como de ITK. Proc Natl Acad Sci USA 2015;112:E966e72.
54. Liang C, Chao Y, Yi X, Xu J, Feng LZ, Zhao Q, et al. Terapia con radioisótopos internos mediada por nanopartículas para aumentar localmente la permeabilidad de la vasculatura tumoral para terapias contra el cáncer mejoradas sinérgicamente. Biomateriales 2019;197:368e79.
También podría gustarte
-
Extracto de Cistanche Deserticola 100 por ciento natural
-
Mejorar la inmunidad Cistanche
-
Mejora la memoria, los efectos del suplemento Cistanche T...
-
Wecistanche Black Platinum 50 grados
-
Suplemento dietético Cistanche Glucósidos feniletanoide i...
-
Cistanche Suplemento dietético Soporte antioxidante Glucó...