Cribado fitoquímico y actividad estrogénica de los glucósidos totales de Cistanche Deserticola

Contacto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correo electrónico:audrey.hu@wecistanche.com

Resumen

A lo largo de las décadas, ha habido esfuerzos continuos para mejorar la calidad de vida humana. El síndrome posmenopáusico es una preocupación seria para el bienestar de la salud de las mujeres. La terapia hormonal es actualmente el pilar del tratamiento para esta condición. Sin embargo, esta terapia podría conducir al abuso de estrógenos, lo que provocaría reacciones adversas y efectos secundarios. Como resultado, la terapia hormonal no ha tenido éxito en mejorar el síndrome posmenopáusico.Cistanche deserticaes una hierba tónica clásica en la medicina tradicional china. Presenta una importante actividad estrogénica. Los principales compuestos activos de esta hierba son los glucósidos. En un experimento anterior, se identificaron tres factores importantes que contribuyen a la producción total de glucósidos, la producción de actósidos y la actividad estrogénica, a saber, la concentración de eluyente, el pH y el volumen de eluyente. En este experimento, se determinó un proceso de purificación óptimo utilizando una metodología de superficie de respuesta de diseño compuesto central para obtener glucósidos de esta hierba. Se encontró que una concentración de eluyente (etanol) del 85 por ciento y un volumen de 25 BV a un pH de 11 eran óptimos. Se identificaron veintiún compuestos activos mediante cromatografía líquida de alto rendimiento/ensayo de espectrometría de masas de tiempo de vuelo de cuadrupolo. Este estudio proporciona información valiosa para futuras investigaciones en profundidad que evalúen las actividades estrogénicas de los glucósidos totales deCistanche desertica.

Palabras llave: Diseño compuesto central; Cistanche deserticola glucósidos totales; LC/Q-TOF-MS; tecnología de purificación; prueba de crecimiento uterino.

Introducción

Cistanche deserticaes una hierba tónica clásica y comestible. Se mencionó por primera vez en el clásico de hierbas de Shen Nong y se alistó en el grado superior. Es una hierba cálida y dulce. Tiene numerosas propiedades medicinales, como la nutrición del hígado y los riñones, el fortalecimiento de los músculos y los huesos, y la mejora de la regulación inmunológica junto con actividades antienvejecimiento y antitumorales [1-4]. Se han aislado e identificado algunos compuestos naturales a partir de los extractos de esta hierba, siendo los principales glucósidos feniletanoides, lignoides, iridoides, polisacáridos y alcaloides [5-8].

Los fármacos obtenidos a partir de plantas medicinales contienen diversos compuestos activos, que son los principales responsables de sus acciones terapéuticas. La eficacia de un mismo fármaco obtenido de diferentes fuentes vegetales puede variar debido a las diferencias en el tipo y cantidad de compuestos activos presentes en él. Por ello, es importante identificar y cuantificar todos los compuestos activos presentes en los fármacos obtenidos a partir de plantas medicinales. Lo mismo se aplica a C. deserticola. La metodología de superficie de respuesta es un método experimental para investigar la interacción entre diferentes factores simultáneamente [9-10]. Se puede utilizar para la optimización de los parámetros de extracción de fitofármacos y la estimación cuantitativa de compuestos activos en fármacos. El diseño compuesto central (CCD) es uno de los diseños experimentales útiles en la metodología de superficie de respuesta. En comparación con los diseños ortogonales y uniformes, CCD tiene mayor precisión y mejor predictibilidad [11].

El síndrome posmenopáusico puede reducir sustancialmente la calidad de vida de la mujer. Normalmente, el estrógeno se usa para tratar esta condición. Sin embargo, el uso a largo plazo de estrógeno puede conducir al abuso, lo que provoca diversas reacciones adversas y efectos secundarios. Por lo tanto, es imperativo elegir una terapia alternativa, preferiblemente un medicamento a base de hierbas que contenga estrógeno como ingrediente activo para el tratamiento del síndrome posmenopáusico [12-13].

En un experimento preliminar, las estructuras de varios compuestos naturales obtenidos de C. deserticola se identificaron mediante espectrometría de masas (MS) [14]. Se confirmó que los glucósidos son los principales compuestos activos que tienen una actividad estrogénica significativa [14-15]. Para desarrollar un ingrediente activo estrogénico seguro y eficaz en un nuevo fármaco, se necesita una investigación en profundidad sobre TGCD después de la purificación. En este estudio, CCD se utilizó por primera vez para optimizar la purificación de los glucósidos totales de C. deserticola (TGCD). Posteriormente, se utilizó la prueba de crecimiento del útero para evaluar las actividades estrogénicas del mismo glucósido. Se usó cromatografía líquida de alto rendimiento/espectrometría de masas de tiempo de vuelo cuadrupolo (HPLC/Q-TOF-MS) para el análisis cualitativo de los compuestos de TGCD después de la purificación. Este proceso se aplicó para demostrar explícitamente la presencia de varios compuestos activos con actividad estrogénica en TGCD. Esto puede proporcionar simultáneamente la base para su uso clínico en el síndrome posmenopáusico en sustitución del estrógeno.

Procedimiento experimental

Instrumentos

Sistema HPLC Agilent 1290 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE. UU.), sistema LC/MS de tiempo de vuelo (Q-TOF) cuadrupolo serie Agilent 6530 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE. UU.) y HPLC química{ Las estaciones de trabajo {5}}D se utilizaron como instrumentos cromatográficos para el procesamiento de datos. Se utilizó agua ultrapura Milli-Q para todo el estudio. balanza analítica electrónica AR1140 (Ohaus International Ltd.); Lector de microplacas 680 (Bio-Rad Corporation); y una centrífuga de alta velocidad 64R (Beckman Coulter Allegra) para la preparación de muestras.

drogas y productos quimicos

C. deserticola fue comprada en el mercado de drogas e identificada por el Prof. Zhang Delian (Universidad de Comercio de Harbin, China). El dietilestilbestrol estándar (pureza del 99 por ciento, número de lote 60518) se adquirió de Dr. Ehrenstorfer (Alemania). Otros estándares de acteósido (111530-200505) y equinacósido (111670-200503) se obtuvieron del Instituto Nacional para el Control de Productos Farmacéuticos y Biológicos, Beijing, China. La pureza de cada estándar fue >98 por ciento. El acetonitrilo (ACN), el metanol y el ácido fórmico (grado MS) se adquirieron de Thermo Scientific Pierce (Rockford, IL, EE. UU.). El agua ultrapura se obtuvo de Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd. (Hangzhou, China). Todos los reactivos disponibles comercialmente fueron de grado analítico.

Preparación de solución de purificación de glucósidos totales de C. deserticola

Después de sumergir en etanol al 75 % durante 12 h, el polvo crudo de C. deserticola (100 g) se extrajo con 800 ml de etanol al 75 % (v/v) a 80 grados durante 150 min a reflujo. Luego se filtró a través de un filtro de doble cubierta y posteriormente se extrajo con 800 mL de etanol al 75 por ciento dos veces durante 150 min adicionales. Posteriormente, los filtrados se combinaron y concentraron al vacío a 45 grados. El extracto se obtuvo eliminando el solvente. Al extracto se le añadió cierta cantidad de agua destilada hasta obtener una concentración de 0,5 g/mL, que se utilizó para tamizar el proceso de purificación.

Para la adsorción usando resina macroporosa AB-8, el pH de la solución de muestra de prueba se ajustó a 11. Primero, se usaron 2 BV de agua destilada para lavar las impurezas. Luego, el eluyente a una concentración de etanol al 85 por ciento de 25 BV se eluyó y se recogió. Finalmente, se fusionó el eluyente purificado recogido. Al extracto se le añadió cierta cantidad de agua destilada hasta obtener una concentración de 1,5 g/mL, que se utilizó para administración intragástrica. Para el control positivo, se preparó una solución de dietilestilbestrol (20 ug/mL) con polvo de dietilestilbestrol.

De acuerdo a la relación de purificación ({{0}}.6), se transfirió cierta cantidad del extracto (equivalente a 1 g de C. deserticola) a un matraz aforado de 10 mL, disuelto en una solución de metanol al 50 por ciento (v/v) en un baño ultrasónico durante 5 min y diluido a 10 ml. La solución medicinal se obtuvo tras la filtración del sobrenadante a través de un filtro de membrana de 0,45 μm. Se mezclaron acteósido y equinacósido (1 mg cada uno) y se disolvieron completamente en 10 ml de una solución de metanol al 50 por ciento (v/v). Finalmente, la solución estándar se filtró a través de un filtro Millipore de 0,45 μm antes del análisis.

Condiciones de CL-EM

La separación por cromatografía se llevó a cabo en un sistema HPLC (Agilent 129{{10}}), equipado con un sistema de suministro de disolvente cuaternario, desgasificador de vacío y detector de matriz de fotodiodos. El análisis MS/MS se realizó en un instrumento Agilent-1290 HPLC/6530 sistema Q-TOF-MS, equipado con una fuente de ionización por electropulverización en modos de iones positivos y negativos. Se utilizó una columna Waters Symmetry shield RP C18 (4,6 × 250 mm, 5 μm) (Waters Corporation, Milford, MA, EE. UU.) para la separación. La fase móvil comprendía una solución acuosa de ácido fórmico al 0,2 por ciento (v/v) (A) y ACN (B), y se bombeó a un caudal de 0,5 ml/min. El volumen de inyección de cada muestra fue de 10 μL. El programa de elución en gradiente fue el siguiente: 5-23 % de B durante 0-35 min, 23-25 ​​% de B durante 35-65 min y 25-5 % de B durante 65-70 min. La temperatura de la columna se mantuvo a 30 grados. Los cromatogramas se monitorearon y registraron a 330 nm. La presión del gas de atomización se fijó en 30 Psi y el voltaje del capilar fue de 3,5 kV. El caudal de gas seco fue de 8 L/min a una temperatura de 30 grados. La temperatura del gas envolvente se fijó en 400 grados a un caudal de 12 l/min. La energía de colisión se fijó en 10–20 eV para escaneos de baja energía y 30–50 eV para escaneos de alta energía. Los datos de espectros de masas se registraron dentro del rango de exploración de 50 a 1000 Da en los modos de exploración de iones positivos y negativos. En este estudio, se llevó a cabo una comparación rápida y eficiente entre TGCD y los estándares en las mismas condiciones de LC-MS.

Prueba de crecimiento del útero

Esto se llevó a cabo en estricto apego a las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Todos los procedimientos experimentales fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Comercio de Harbin, China.

Se compraron ratones Kunming hembra inmaduros (alrededor de 21 días de nacimiento, destetados) que pesaban 12 ± 2 g en el Centro de animales de laboratorio de la base de la industria biológica nacional de Changchun (Changchun, China). Los ratones se alojaron en una habitación con temperatura regulada (22 ± 2 grados) con comida y agua ad libitum. La experimentación con animales se inició después de cinco días de aclimatación. Los ratones ayunaron durante la noche con agua ad libitum antes de la administración intragástrica de la solución de prueba.

Los ratones se dividieron al azar en 22 grupos, con 10 animales en cada grupo. Se les administraron fármacos experimentales del mismo volumen dos veces al día (mañana y tarde) durante cuatro días de la siguiente manera:

Grupo 1: solución de purificación de glucósidos totales intragástricos de C. deserticola (20 ml/kg), (volumen de solución/peso del ratón),

Grupo II: agua destilada intragástrica (grupo de control negativo), y

Group III: Intragastric diethylstilbestrol (20 ug/mL) (positive control group).

El quinto día se sacrificaron todos los ratones. Los úteros se extrajeron y pesaron inmediatamente y se calcularon los coeficientes del útero.

análisis estadístico

Se usó una prueba t de muestra pareada de dos colas para identificar diferencias estadísticamente significativas en los diversos parámetros en los diferentes grupos experimentales. El análisis se realizó con el software estadístico SPSS (SPSS para Windows v21.0, SPSS Inc., EE. UU.). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a un nivel de confianza del 95 por ciento (p <>

Resultados y discusión

Linealidad y correlación de los rendimientos de actósidos y glucósidos totales

La ecuación de regresión lineal del rendimiento de acteósido fue y {{0}}x – 14,75 (donde x es la concentración de acteósido e y es su área máxima correspondiente) con un coeficiente de correlación de r=1 en el rango de concentración de 0.12−{{10}}.72 mg/mL. Esto indicó una curva de calibración lineal. La ecuación de regresión lineal del rendimiento de glucósidos totales fue y=26.074x más 0,0866 (donde x es la concentración de glucósidos totales e y es su área máxima correspondiente) con un coeficiente de correlación de r { {12}}.9982 en el rango de concentración de 0.013−0.065 mg/mL. Esto también indicó una curva de calibración lineal.

Investigación metodológica

En la investigación metodológica se investigó la precisión, reproducibilidad, estabilidad y recuperación de las muestras. En el experimento de precisión, la desviación estándar relativa (RSD) del acteósido y los glucósidos totales fue del 1,43 % y del 0,05 %, respectivamente. En el experimento de reproducibilidad, la RSD de acteósido y glucósidos totales fue 0,10 por ciento y 1,44 por ciento, respectivamente. En el experimento de estabilidad de 24 h, la RSD de acteósido y glucósidos totales fue del 0,14 por ciento y del 0,90 por ciento, respectivamente. En el experimento de recuperación, la recuperación de acteósido fue del 100,50 por ciento con una RSD de 2,08 por ciento, mientras que la recuperación de glucósidos totales fue del 99,12 por ciento con una RSD de 1,65 por ciento. Todos los valores RSD fueron inferiores al 3 por ciento. Estos resultados demostraron una buena precisión y reproducibilidad. Además, la muestra se mantuvo estable durante 24 h. Los resultados de recuperación también están dentro del rango permisible (95-105 por ciento). Por lo tanto, este método se puede utilizar para la determinación del rendimiento de actósidos y glucósidos totales después de la purificación.

Investigación de factor único de TGCD

La purificación de TGCD con resina macroporosa puede verse afectada por muchos factores, como el tipo de resina, los factores de adsorción estática (tiempo de adsorción, concentración de fugas y pH de la solución de muestra) y las condiciones de elución (velocidad de flujo, volumen y concentración). Usando la capacidad de adsorción y las tasas de desorción y elución de TGCD como índices, la condición experimental se determinó en base a los resultados de los experimentos de un solo factor. Usando resina de adsorción macroporosa tipo AB-8, se determinaron las siguientes condiciones óptimas: solución de muestra de 0.5 mg/mL, pH de 10, tiempo de adsorción estática de 8 h, 2 BV agua destilada para lavar las impurezas, 20 BV de etanol al 80 por ciento como eluyente y una velocidad de flujo de 0,5 BV/min. Los resultados específicos se muestran en las Figuras 1-7.

CCD para la optimización de la tecnología de purificación TGCD

Sobre la base de los resultados de la investigación de un solo factor, se seleccionaron como índices tres factores que influyen significativamente en el método de purificación, a saber, el pH de la solución de muestra (x1), la concentración de eluyente (x2) y el volumen de eluyente (x3). Según el principio de CCD, cada factor tiene cinco niveles. Los niveles máximo y mínimo de estos diversos factores se establecieron de acuerdo con los resultados del experimento preliminar. Los niveles de factor se muestran en la Tabla 1 y los resultados experimentales se muestran en la Tabla 2.

Se determinaron los rendimientos totales de glucósidos y actósidos para optimizar el método de purificación para TGCD. En primer lugar, los rendimientos totales de glucósidos y actósidos se ajustaron a los criterios numéricos de deseabilidad (d) entre {{0}}−1. Luego, se calculó la deseabilidad general (OD) [OD=(d1, d2, d3,....,dn)1/n, donde n es el número índice]. Se utilizó el software SPSS21.{{10}} y el software de diseño experto para la regresión lineal múltiple y el ajuste binomial de variables independientes y OD, con p < 0.05="" se="" consideró="" un="" estándar="" estadísticamente="" significativo="" de="" la="" ecuación.="" la="" ecuación="" con="" un="" valor="" r="" mayor="" (coeficiente="" de="" correlación="" múltiple)="" se="" seleccionó="" como="" el="" modelo="" de="" mejor="" ajuste.="" la="" ecuación="" lineal="" multivariada="" se="" representa="" como="" y="–" 1.02="" –="" 0.131x1="" más="" 0.034x2="" más="" 0.012x3="" (r="" {{="" 25}}.55,="" p="0.004)." la="" ecuación="" binomial="" es="" y="–" 21.92173="" –="" 0.74079x1="" más="" 0.62914x2="" más="" 0.041161x3="" más="" 0.014972x1x2="" más="" 2.06050*10-4x1x3="" más="" 1.05698="" ×="" 10-3x2x3="" -="" 0.029589x{="" {56}}.78730="" ×="" 10-3x22="" -="" 2.89446="" ×="" 10-3x32="" (r="0.91," p="0.012)." puede="" verse="" a="" partir="" de="" las="" ecuaciones="" anteriores="" que="" el="" coeficiente="" de="" correlación="" de="" la="" ecuación="" de="" regresión="" lineal="" multivariada="" es="" más="" bajo.="" la="" correlación="" entre="" las="" variables="" independientes="" y="" dependientes="" es="" muy="" baja,="" y="" se="" consideró="" desfavorable="" para="" su="" uso="" en="" el="" modelo="">

Pero, el coeficiente de correlación de la ecuación binomial fue alto y resultó en un buen ajuste. Por lo tanto, se seleccionó el modelo binomial. Sobre la base de un análisis exhaustivo de la figura de la superficie y el mapa de contorno combinado con los datos experimentales (valor OD cerca de {{0}}.6), se obtuvo el rango óptimo del método de purificación. En la Figura 8, se puede ver que el valor máximo de OD se generó cuando el pH de la solución de muestra (A) estaba en el rango de 9 a 10, y la concentración de eluyente (B) estaba en el rango de 79 a 85 por ciento. . La Figura 9 muestra que el valor máximo de OD se obtuvo cuando el valor de pH de la solución de muestra (A) estaba en el rango de 9-10 y el volumen de eluyente (C) estaba en el rango de 20-25 BV. La Figura 10 muestra que el valor máximo de OD se obtuvo cuando la concentración de eluyente (B) estaba en el rango de 80 a 85 por ciento y el volumen de eluyente (C) estaba en el rango de 20 a 25 BV. A partir de un análisis exhaustivo de estos datos, se determinó que el pH de la solución de muestra, la concentración del eluyente y el volumen del eluyente estaban en el rango de 9-10, 80-85 por ciento y 20-25 BV, respectivamente. Según la ecuación binomial multivariante para resultados derivados variables y el esquema óptimo, se encontró que el mejor método de purificación de TGCD era a una concentración de eluyente (etanol) del 85 por ciento y un volumen de 25 BV a un pH de 11. El valor de OD correspondiente fue 0.8332 y el rendimiento total de glucósidos fue del 73,0339 por ciento. La impresión visual de las figuras 8-10 identifica como mejor método aquel en el que se consideraron las interacciones entre los dos factores, aunque el mejor método deducido de la fórmula reconoce aquel en el que se incluyeron las interacciones entre los tres factores. Los dos resultados diferían y se consideró que el método de purificación óptimo era con una concentración de eluyente (etanol) del 85 por ciento y un volumen de 25 BV a un pH de 11.

Medición del crecimiento del útero

El coeficiente de útero de cada grupo se muestra en la Tabla 3. En comparación con el grupo de control negativo, los resultados de los otros grupos fueron significativamente diferentes. Se encontró que la TGCD obtenida a partir de 20 métodos de purificación diferentes ejercía acciones estrogénicas.

Experimento confirmatorio

Los resultados completos del CCD y la prueba de crecimiento del útero mostraron que se consideró que el método de purificación óptimo era con una concentración de eluyente (etanol) del 85 por ciento y un volumen de 25 BV a un pH de 11. Durante el

proceso de validación, el rendimiento promedio de glucósidos totales fue 70.9150 por ciento. La desviación promedio entre los valores pronosticados y reales fue de 2.1180 por ciento. Por lo tanto, se puede sugerir que la previsibilidad y la credibilidad experimental de este modelo son buenas.

Identificación de TGCD después de la purificación

Según el tiempo de retención y los datos de MS, se especularon 21 componentes naturales, incluido el campneósido 1, 2′-acetilacteoside, cistanoside A, cistanoside B, syringalide A 3'- - L-ramnopiranósido, tubuloside A, tubuloside B, salidroside, cistanósido G, ácido tenipósido, decaffeolacteosido, 8-ácido epilogánico, echinacósido, cistanósido F, cistantubulosido B1, isoactósido, actósido, cis-actósido, kankanósido E, osmanthusido B y cistanósido C. El tiempo de retención, MS y MS/ La información de MS, la fórmula y los compuestos especulados se muestran en la Tabla 4.

Q-TOF-MS es particularmente adecuado para la identificación estructural de componentes moleculares complejos de medicamentos y alimentos porque puede proporcionar posibles composiciones elementales a través de la masa molecular exacta y las características estructurales de los iones del fragmento. Para establecer una caracterización estructural sistemática, también se utilizaron para la identificación Q-TOF-MS, datos de MS, búsqueda de bases de datos y literatura de referencia publicada. La fórmula molecular de cada componente objetivo se dedujo del ion original y se comparó con los compuestos conocidos. Esta fórmula podría determinarse aún más a partir de sus iones de fragmentos relacionados. Por ejemplo, el pico 5 mostró un ion desprotonado predominante en m/z 654 (C30H38O16), que era idéntico a la composición elemental del campneósido 1. La pérdida de cafeoilo se formó a partir de un fragmento de ion en m/z 493, y la pérdida de el resto rha se formó a partir de un fragmento de ion m/z 347.

Conclusión

Usando una tecnología LC-Q-TOF-MS, se ha desarrollado y validado completamente un método de análisis cualitativo simple y robusto para TGCD. Los datos de validación para el cribado e identificación de compuestos naturales de TGCD fueron satisfactorios. Veintiún compuestos bioactivos de TGCD se especularon de la siguiente manera: salidroside, cistanósido G, ácido geniposídico, decaffeolacteosido, campneósido 1, 8-ácido epilogánico, 2'-acetilacteoside, cistanósido A, cistanósido B, siringalida A3'{{9 }}L-ramnopiranósido, equinacósido, cistanosido F, cistantubulosido B1, isoactosido, acteosido, tubulosido A, cis-actosido, kankanosido E, osmanthusido B, cistanosido C y tubulosido B. La caracterización estructural de estos compuestos puede proporcionar una base experimental para su control de calidad y posterior aplicación clínica debido a su actividad estrogénica. Esto puede ofrecer una opción terapéutica novedosa y mejorada para el tratamiento del síndrome posmenopáusico, evitando así los efectos secundarios y las reacciones adversas de la terapia con estrógenos.

abreviaturas

TGCDCistanche deserticaglucósidos totales LC/Q-TOF-MS cromatografía líquida/espectrometría de masas de tiempo de vuelo de cuadrupolo

Metodología de superficie de respuesta RSM

Diseño compuesto central CCD

Espectrometría de masas MS HPLC/Q-TOF-MS Cromatografía líquida de alta resolución/espectrometría de masas de tiempo de vuelo de cuadrupolo

ACN Acetonitrilo

volumen de la cama BV

Deseabilidad general de OD

LC-MS cromatografía líquida-espectrometría de masas

Espectrometría de masas de tiempo de vuelo de cuadrupolo Q-TOF-MS

MTC medicinas tradicionales chinas

RSD desviación estándar relativa

Expresiones de gratitud

Este proyecto fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 81073015), la Fundación Científica de la Naturaleza de la Provincia de Heilongjiang (ZD2017014), el plan de formación de jóvenes talentos innovadores del Colegio en la Provincia de Heilongjiang (UNPYSCT- 2017209). Los autores declaran que no existe ningún conflicto de interés con respecto a la publicación de este artículo.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

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