Abstracto:

Estudios recientes han demostrado que plumbagin tiene actividades antiinflamatorias, antialérgicas, antibacterianas y anticancerígenas; sin embargo, aún no se ha demostrado si plumbagin suprime la síntesis de melanina inducida por la hormona estimulante de melanocitos alfa (-MSH) para prevenir la hiperpigmentación. En este estudio, demostramos que plumbagin suprime significativamente la síntesis de melanina estimulada por -MSH en células de melanoma de ratón B16F10. Para comprender el mecanismo inhibitorio de plumbagin en la síntesis de melanina, realizamos ensayos de actividad de tirosinasa celular o libre de células y analizamos la expresión génica relacionada con la melanogénesis. Demostramos que plumbagin suprime directamente la actividad de la tirosinasa independientemente de la maquinaria transcripcional asociada con la melanogénesis, que incluye el factor de transcripción asociado a la microftalmía (MITF), la tirosinasa (TYR) y la proteína 1 relacionada con la tirosinasa (TYRP1). También investigamos si plumbagin era tóxico para los queratinocitos humanos normales (HaCaT) y las células epiteliales del cristalino (B3) que pueden dañarse con el uso de cosméticos para el cuidado de la piel. Sorprendentemente, las concentraciones más bajas de plumbagina (0.5–1 µM) inhibieron de manera efectiva la síntesis de melanina y la actividad de la tirosinasa, pero no causaron toxicidad en los queratinocitos, las células epiteliales del cristalino y las células de melanoma de ratón B16F10, lo que sugiere que la plumbagina es segura para la aplicación dérmica. En conjunto, estos resultados sugieren que el efecto inhibidor de la plumbagina sobre la pigmentación puede convertirlo en un componente aceptable y seguro para usar en formulaciones cosméticas para el cuidado de la piel que se usan para blanquear la piel.

Según estudios relevantes,cistanchees una hierba común que se conoce como "la hierba milagrosa que prolonga la vida". Su principal componente escistanósido, que tiene varios efectos tales comoantioxidante, antiinflamatorio, ypromoción de la función inmunológica. El mecanismo entre la cistanche yblanqueamiento de la pielreside en el efecto antioxidante de la cistancheglucósidos. La melanina en la piel humana es producida por la oxidación de tirosina catalizada portirosinasa, y la reacción de oxidación requiere la participación de oxígeno, por lo que los radicales libres de oxígeno en el cuerpo se convierten en un factor importante que afecta la producción de melanina. Cistanche contiene cistanosido, que es un antioxidante y puede reducir la generación de radicales libres en el cuerpo, por lo tantoinhibiendo la producción de melanina.

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Palabras clave:plumbagin; melanogénesis; pigmentación; tirosinasa

1. Introducción

La melanina consiste en un grupo de pigmentos sintetizados en los melanocitos epidérmicos que juegan un papel importante en la defensa de la piel contra el daño de la radiación ultravioleta (UV) [1]. La melanogénesis anormal, ya sea una producción aumentada o disminuida de melanina, está estrechamente relacionada con varias enfermedades de la piel, incluido el melanoma y los trastornos de la pigmentación, como el cloasma y las pecas [2,3]. La biosíntesis de melanina se inicia mediante múltiples estímulos, incluida la radiación UV, las citocinas inflamatorias y la señalización hormonal. Específicamente, la hormona estimulante de melanocitos (-MSH) liberada de los queratinocitos expuestos a los rayos UV puede estimular la biosíntesis de melanina en los melanocitos epidérmicos mediante la activación del eje cAMP-PKA-CREB (adenosina monofosfato cíclica-proteína quinasa A-proteína de unión al elemento de respuesta cAMP) [3] . El eje cAMP-PKA-CREB activado conduce a un aumento en el ARNm que codifica el factor de transcripción asociado a la microftalmía (MITF). MITF aumenta la expresión génica de la tirosinasa (TYR), la proteína 2 relacionada con la tirosinasa (TYRP1) y la proteína 2 relacionada con la tirosinasa (TYRP2) tras la estimulación de -MSH en los melanocitos [3,4]. Además, muchas vías de señalización que controlan el crecimiento celular, incluidas las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK), la quinasa de respuesta extracelular (ERK) y AKT, son esenciales para la melanogénesis al regular la estabilidad y la actividad de MITF [5].

La enzima tirosinasa, una oxidasa multifuncional que contiene cobre, juega un papel esencial en la biosíntesis de melanina al catalizar las reacciones en las que la L-tirosina se hidroxila a L-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) y la L-DOPA se oxida a o-quinona (dopaquinona). ) [5,6]. Por lo tanto, algunos inhibidores de la tirosinasa también inhiben la biosíntesis de melanina, y estos incluyen el resveratrol, la arbutina y el honokiol, que se han utilizado en aplicaciones cosméticas para blanquear la piel [7].

Plumbagin es una hidroxil-naftoquinona simple, que se extrajo por primera vez de las raíces del género de plantas Plumbago y se ha demostrado que tiene notables propiedades medicinales [8]. Se han informado actividades antiinflamatorias, anticancerígenas, antialérgicas y antibacterianas de la plumbagina [8,9]. De hecho, se ha informado que plumbagin inhibe la activación de neutrófilos, la angiogénesis y la expresión de colagenasa al suprimir la topoisomerasa-II, lo que sugiere el uso de plumbagin como un fármaco potencial en el tratamiento de la artritis reumatoide [10]. Además, varios informes han demostrado que la plumbagina exhibe actividad anticancerígena en múltiples tipos de cáncer, incluidos los de mama [11], próstata [12], ovario [13], pulmón [14], carcinoma de piel [15] y cáncer de hígado. [dieciséis]. Aunque cada vez está más claro que plumbagin puede ser útil como una intervención terapéutica en el tratamiento de diversas enfermedades humanas, nunca se ha informado el efecto inhibitorio de plumbagin sobre la melanogénesis relacionada con la hiperpigmentación.

En el presente estudio, evaluamos los efectos inhibitorios de la plumbagina sobre la melanogénesis estimulada por -MSH. Aquí mostramos que plumbagin suprime significativamente la biosíntesis de melanina inducida por MSH en células de melanoma de ratón B16F10 al inhibir la actividad de tirosinasa, pero que no inhibe la expresión génica mediada por MITF asociada con la melanogénesis.

2. Resultados

2.1. Estructura química y efectos citotóxicos de Plumbagin en células de melanoma de ratón B16F10

Antes de estudiar los efectos antimelanogénicos de la plumbagina, primero evaluamos su toxicidad en células de melanoma de ratón B16F10 productoras de melanina. La estructura química de plumbagin se muestra en la Figura 1A. Los resultados de nuestro ensayo de citotoxicidad en el que las concentraciones de plumbagina inferiores a 5 µM no afectaron la viabilidad celular en las células B16F10 se muestran en la Figura 1B.

2.2. Plumbagin suprime la síntesis de melanina inducida por MSH en células de melanoma de ratón B16F10

A continuación, investigamos los efectos inhibitorios de la plumbagina sobre la síntesis de melanina inducida por la hormona estimulante de melanocitos (-MSH) en células B16F10. Demostramos que plumbagin suprime fuertemente la acumulación de melanina inducida por -MSH en un medio de cultivo de células B16F10 (Figura 2A). Para confirmar el efecto inhibitorio de la plumbagina sobre la síntesis de melanina inducida por -MSH, determinamos el contenido de melanina extracelular o intracelular en ausencia o presencia de plumbagina en células B16F10 estimuladas con -MSH. Las Figuras 2B y C muestran que plumbagin reduce significativamente el contenido de melanina extracelular e intracelular.

2.3. Plumbagin no regula la expresión génica de la melanogénesis inducida por -MSH ni las cascadas de transducción de señales

Debido a que el factor de transcripción asociado a la microftalmía (MITF) es un factor de transcripción esencial que regula la expresión génica asociada a la melanogénesis a través del eje -MSH-PKA-CREB, investigamos si plumbagin podría regular la expresión génica mediada por MITF asociada con la melanogénesis. Primero, determinamos un punto de tiempo de máxima expresión génica de melanogénesis para MITF, tirosinasa (TYR) y proteína relacionada con tirosinasa 1 (TYRP1) bajo estimulación -MSH. MITF está fuertemente regulado después del tratamiento con -MSH durante 2 h (Figura 3A). TYR y TYRP1 aumentaron dramáticamente después de 48 h de tratamiento con -MSH (Figura 3A). Los niveles de proteína tirosinasa y MITF aumentaron en respuesta al tratamiento con -MSH y no fueron suprimidos por el tratamiento con plumbagina (Figura 3B). Consistentemente, plumbagin no inhibió los niveles de ARNm de MITF, TYR y TYRP1 después de la estimulación de -MSH, lo que sugiere que plumbagin no regula la maquinaria transcripcional relacionada con la expresión génica de melanogénesis en células B16F10 (Figura 3C). Debido a que la fosforilación y la activación de AKT, ERK1/2 y CREB (las principales cascadas de transducción de señales que regulan la melanogénesis) son necesarias para la melanogénesis [3], investigamos más a fondo si la plumbagina regula estas vías de transducción de señales asociadas a la melanogénesis. Nuestros resultados, descritos en la Figura 3D, muestran que plumbagin no altera la señalización de AKT, ERK1/2 o CREB después del tratamiento con -MSH.

2.4. Plumbagin inhibe la actividad de la tirosinasa

Debido a que los productos naturales inhibidores directos o indirectos de la tirosinasa podrían ser útiles para el desarrollo de cosméticos para blanquear la piel, a continuación investigamos el efecto inhibidor de la plumbagina sobre la actividad de la enzima tirosinasa. En este estudio, demostramos que plumbagin suprime significativamente la actividad enzimática de tirosinasa celular inducida por -MSH en células B16F10 (Figura 4A). Para comprender si plumbagin inhibe la actividad de tirosinasa directa o indirectamente, se midió la actividad de tirosinasa libre de células. Plumbagin también inhibe fuertemente la actividad de oxidación de L-DOPA de la tirosinasa derivada de hongos, lo que sugiere que plumbagin suprime la melanogénesis al inhibir directamente la actividad de tirosinasa (Figura 4B). Además, se observó un aumento significativo en las actividades de captación de radicales usando un ensayo de 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH) en muestras tratadas con vitamina C y plumbagina en concentraciones que oscilan entre 0.1 a 5 mg/mL. En consecuencia, 5 mg/ml de plumbagina exhibieron un efecto similar sobre la actividad de eliminación de radicales a los de 0,1 mg/ml de vitamina C (Figura 4C).

2.5. Plumbagin no es tóxico en queratinocitos normales y células epiteliales del cristalino

Debido a que los cosméticos como la crema para la piel son para uso externo y la citotoxicidad podría causar problemas en la piel, investigamos más a fondo si la plumbagina es tóxica para los queratinocitos normales (HaCaT) y las células epiteliales del cristalino (B3) y si puede ser útil para el desarrollo del blanqueamiento de la piel. productos cosméticos. En consecuencia, encontramos que las concentraciones más bajas de plumbagina (1–5 µM) no causan toxicidad en las células HaCaT y B3, pero son efectivas en la inhibición de la síntesis de melanina (Figura 5A). Además, plumbagin no indujo H2AX relacionado con daños en el ADN ni redujo las proteínas de poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP) y caspasa-3 relacionadas con la apoptosis celular en células HaCaT y B3 (Figura 5B), lo que sugiere que plumbagin puede ser aceptable para su uso en productos para blanquear la piel sin exhibir ninguna toxicidad dérmica.

3. Discusión

Plumbagin es un metabolito secundario derivado de plantas y muestra varias funciones biológicas, que incluyen actividades antiinflamatorias, anticancerígenas, antialérgicas y antibacterianas [8,9]. Sin embargo, no se sabía si la plumbagina tenía un efecto inhibitorio sobre la melanogénesis relacionada con la hiperpigmentación y el melanoma. En este estudio, demostramos que plumbagin suprime fuertemente la melanogénesis en las células de melanoma B16F10, y este trabajo podría brindar una oportunidad para desarrollar cosméticos para el cuidado de la piel basados ​​en las actividades antiinflamatorias, antialérgicas, antibacterianas y antimelanogénesis de plumbagin.

Debido a que la regulación positiva de la melanogénesis a menudo se observa en el melanoma maligno con niveles de tirosinasa sobreexpresados ​​en la sangre y en los tejidos tumorales, es evidente que la melanogénesis es un objetivo potencial para la quimioterapia de los melanomas malignos [1]. En el presente estudio, encontramos que la plumbagina suprime directamente la actividad de la tirosinasa independientemente de la maquinaria transcripcional asociada con la melanogénesis (Figura 6). Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que plumbagin puede ser un componente potencial de una estrategia preventiva y terapéutica para el manejo del melanoma maligno. De hecho, se han informado los efectos anti-melanoma, quimiosensibilizadores y radiosensibilizadores de la plumbagina en la terapia del melanoma [17-21].

En estudios previos sobre los efectos anticancerígenos y antiinflamatorios de la plumbagina, se utilizaron aproximadamente 5–10 µM de plumbagina (más alta que la concentración utilizada en este estudio) en modelos in vitro [17,22 ,23]. Por lo tanto, investigamos el efecto tóxico de la plumbagina en las células proliferativas, incluidos los queratinocitos normales (HaCaT) y las células epiteliales del cristalino (B3), que pueden dañarse con los cosméticos para el cuidado de la piel. Nuestros resultados demostraron que concentraciones más bajas, aproximadamente 0.5–1 µM de plumbagina, no son tóxicas para los queratinocitos normales y las células epiteliales del cristalino, pero son lo suficientemente efectivas como para reducir la actividad de la tirosinasa y la síntesis de melanina. Además, también encontramos que la plumbagina suprime la melanogénesis de manera más eficaz que la arbutina 1 mM o el ácido kójico 0,2 mM, que son agentes blanqueadores de la piel bien conocidos. Estos resultados sugieren que plumbagin es seguro para usar como componente para desarrollar cosméticos para blanquear la piel.

4. Materiales y Métodos

4.1. Reactivos y Anticuerpos

4.2. Ensayo de cultivo celular y viabilidad celular

4.3. inmunotransferencia

Las células cultivadas se lisaron usando IGEPAL al 1 por ciento (octilfenoxipolietoxietanol), NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM (pH 7,9), NaF 10 mM y un cóctel inhibidor de proteasa en tampón de lisis. Las muestras de proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE), y las proteínas separadas se transfirieron luego a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, EE. UU.). Las membranas se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios (1:1000) a 4 ◦C y luego se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (1:10 000) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las proteínas se visualizaron utilizando un kit ECL Prime (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, EE. UU.).

4.4. Medición del contenido de melanina intracelular y extracelular

El contenido de melanina se determinó y cuantificó utilizando un método descrito previamente con una ligera modificación [2,24]. Para el análisis del contenido de melanina, se cultivaron células B16F10 en DMEM sin rojo de fenol que contenía suero bovino fetal al 10 por ciento. Se cultivaron células B16F10 con tratamiento -MSH en ausencia o presencia de plumbagina durante 3 o 4 días. Las células cultivadas o los medios se recogieron y los sedimentos se disolvieron en NaOH 1N que contenía DMSO al 10 por ciento a 80 ◦C durante 1 hora. El contenido de melanina se midió usando un lector de absorbancia a 475 nm (OD475), y luego el contenido de melanina se normalizó a la concentración de proteína celular.

4.5. Aislamiento de ARN y RT-PCR cuantitativa

4.6. Ensayo de actividad de tirosinasa celular

La actividad de la tirosinasa celular se determinó usando un método previamente descrito con modificaciones [25,26]. Las células B16F10 cultivadas se incubaron con -MSH en ausencia o presencia de plumbagin, y luego las células se lavaron y lisaron con PBS que contenía 1 por ciento de desoxicolato de sodio y 0, 5 por ciento de Triton X{{8} }. Después de determinar la concentración de proteína, se incubaron 50 µg de proteína con L-DOPA 2,0 mM y PBS 0,1 M (pH 6,8) durante 1 ha 37 ◦C. La oxidación de L-DOPA se midió a 475 nm (OD475) usando un lector de absorbancia. La actividad se midió utilizando la siguiente fórmula: actividad de tirosinasa (porcentaje)=(OD475 de muestra/OD475 de control) × 100.

4.7. Ensayo de actividad de tirosinasa libre de células

4.8. Ensayo de actividad de captación de radicales DPPH

4.9. Análisis estadístico

5. Conclusiones

Referencias

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