ARESUMEN

Fondo:Se aisló un bis resorcinol como principal constituyente del tronco de las Heliciopsis terminales (Proteaceae). Recientemente, el resorcinol se aplica como agente blanqueador activo en varios productos cosméticos. Debido a la imitación estructural del resorcinol, en este estudio se demostraron los beneficios del bisresorcinol como antagonista de la enzima del envejecimiento.

Según estudios relevantes, la cistanche es una hierba común conocida como "la hierba milagrosa que prolonga la vida". Su principal componente es el cistanosido, que tiene diversos efectos como antioxidante, antiinflamatorio y promotor de la función inmunológica. El mecanismo entre la cistanche y el blanqueamiento de la piel radica en el efecto antioxidante de los glucósidos de cistanche. La melanina en la piel humana se produce por la oxidación de la tirosina catalizada por la tirosinasa, y la reacción de oxidación requiere la participación de oxígeno, por lo que los radicales libres de oxígeno en el cuerpo se convierten en un factor importante que afecta la producción de melanina. Cistanche contiene cistanosido, que es un antioxidante y puede reducir la generación de radicales libres en el cuerpo, inhibiendo así la producción de melanina.

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Métodos:El bisresorcinol se purificó a partir del extracto etanólico crudo del tronco de H. terminales mediante extracción con solventes y cromatografía preparativa, respectivamente. La actividad inhibitoria sobre colagenasa, elastasa y tirosinasa del compuesto se investigó usando una técnica espectroscópica diferente. Se realizó acoplamiento molecular para predecir posibles interacciones de la sustancia alrededor de los sitios activos de la enzima.

Resultados:Los valores de IC50 en la colagenasa del bis resorcinol y del ácido cafeico fueron 156,7 ± 0,7 y 308,9 ± 1,6 µmol L−1, respectivamente. Para la actividad de elastasa, se determinó la IC50 de 33,2 ± 0,5 y 34,3 ± 0,3 µmol L-1 para el bis resorcinol y el ácido ursólico, respectivamente. El bisresorcinol fue inhibidor de la tirosinasa al exhibir un IC50 de 22,8 µmol L-1, y de 78,4 µmol L-1 para la -arbutina. El bisresorcinol se unió a colagenasa, elastasa y tirosinasa con energías de enlace respectivas de −5,89, −5,69 y −6,57 kcal mol−1. Estas energías de unión estaban en los mismos rangos que los inhibidores probados. Los grupos fenol aromáticos en la estructura fueron responsables del principio, así como de apoyar las interacciones de unión con las enzimas. La unión de hidrógeno debido a los grupos hidroxilo y las fuerzas de atracción relacionadas con π de uno o más anillos aromáticos proporcionaron versatilidad de unión al bis resorcinol.

Conclusión:El bisresorcinol purificado de H. terminales podría ser útil para su inclusión en productos cosméticos como antagonista de enzimas de envejecimiento.

Asignaturas Bioquímica, bioinformática, biología celular, dermatología, minería de datos y aprendizaje automático

Palabras claveHeliciopsis terminales, bisresorcinol, colagenasa, elastasa, tirosinasa, propiedad antienvejecimiento, acoplamiento molecular, inhibición enzimática

INTRODUCCIÓN

A bisresorcinol, (8′Z)-3,5-dihidroxi-1-[16′-(3″, 5″-dihidroxi fenil)-8′-hexadecen{{ 11}}'-il] benceno, se ha aislado como un componente abundante del tronco de Heliciopsis terminales (Kurz) Sleumer, que es una planta de la familia Proteaceae y ha sido utilizada por personas étnicas en Vietnam por su efecto hepatoprotector. Hasta la fecha, los beneficios médicos de este compuesto como agente antiinflamatorio, inhibidor de la producción de malondialdehído (MDA) y hepatoprotector han sido aclarados in vitro e in vivo (Giang et al., 2019). Es evidente que una molécula de bis resorcinol contiene dos moléculas de resorcinol (EC No 203-585-2), unidas entre sí con un enlace meta-C7H14C=CC7H14 (Fig. 1A). El resorcinol se aplica recientemente en forma de suero concentrado facial para la terapia blanca. Según el Comité Científico sobre Seguridad del Consumidor, Bruselas, Bélgica (SCCS 1270/09, Comisión Europea, Comité Científico sobre Seguridad del Consumidor, 2010), el resorcinol ha sido regulado como oxidante en productos destinados a teñir las pestañas en rangos de concentración de hasta 1,25 %. o en lociones para el cabello y champús en rangos de concentración de hasta 0.5 por ciento. Las aplicaciones cosméticas del resorcinol son, por tanto, diversas. Para los agentes blanqueadores, se ha supuesto la inhibición de la síntesis de melanina por parte de los melanocitos que residen en la capa de células basales de la epidermis. La tirosinasa (EC 1.14.18.1) es una enzima clave para catalizar la melanogénesis en la que se utiliza L-tirosina como sustrato. Aunque la melanina ayuda a proteger la piel del daño de los rayos UV, la producción excesiva de melanina puede causar hiperpigmentación, pecas y manchas de la edad. Además del resorcinol, se ha demostrado que varios compuestos sintéticos y naturales con distintas estructuras químicas presentan actividad antitirosinasa (Dobos et al., 2015).

La radiación UV es un factor externo importante que causa el envejecimiento de la piel. En cambio, las pieles pueden envejecer con el tiempo por las especies reactivas de oxígeno (ROS) y los peróxidos de lípidos que se producen internamente después de la exposición a los rayos UV. Los productos secundarios del metabolismo de los peróxidos de lípidos pueden dañar las fibras de elastina y colágeno de las matrices extracelulares (ECM). Por lo tanto, la exposición a los rayos UV puede provocar deshidratación, pérdida de elasticidad y arrugas en la piel. Hasta donde sabemos, las MEC se remodelan periódicamente para mantener estructuras tisulares normales junto con que las proteínas tisulares caducadas se degraden adecuadamente por metaloproteinasas de matriz, como colagenasas, y serina proteasas como elastasas (Thring, Hili & Naughton, 2009). Además, tanto las cantidades como las actividades de las enzimas de envejecimiento se han incrementado por el estrés oxidativo, lo que lleva a una degradación extensa de la ECM y al envejecimiento progresivo (Sherratt et al., 2019). Por lo tanto, se prevé que los compuestos que pueden formar complejos con iones metálicos inhiban las colagenasas, las elastasas y la tirosinasa (Selvaraj et al., 2014). Este proyecto tiene como objetivo determinar los efectos biológicos del bis resorcinol sobre la tirosinasa, la colagenasa y la elastasa in vitro, y se llevó a cabo una técnica de acoplamiento para aclarar sus interacciones a nivel molecular. Es esperanzador retrasar el proceso de envejecimiento y mejorar la apariencia de la piel con bis resorcinol.

MATERIALES Y MÉTODOS

productos químicos e instrumentos

Purificación, identificación y ratificación de compuestos

El extracto crudo en etanol del tronco de H. terminales se obtuvo generosamente del profesor PM Giang, Facultad de Química, Universidad Nacional de Vietnam, Hanoi, Vietnam, con número de muestra de comprobante HNIP-18473. Luego, se repartió en metanol/n-hexano tres veces. La capa de metanol se evaporó hasta casi secarse y posteriormente se repartió en acetato de etilo/1-butano. La capa de acetato de etilo se vaporizó hasta que su volumen se redujo en un 80 por ciento. El líquido viscoso resultante se purificó luego en una columna de gel de sílice utilizando elución en gradiente de cloroformo/metanol de la siguiente manera: 100 por ciento de cloroformo, 30:1, 20:1, 10:1, 7:1, 5:1, 3:1, 3 :2 y 2:1 de cloroformo/metanol y 100 por ciento de metanol, respectivamente. El eluyente del disolvente mixto 5:1 se recogió y se evaporó hasta un cuarto del volumen, seguido de la separación en la columna ODS usando un gradiente de elución de metanol y acetona. El compuesto deseado, es decir, bis resorcinol (Fig. 1), se obtuvo a partir de eluyentes que contenían 70 por ciento de acetona y se confirmó mediante espectroscopías de MS, NMR e IR con respecto a los datos de la biblioteca instrumental. Se utilizó cromatografía en capa fina para la estimación de su pureza.

Ensayos de actividad biológica

Los experimentos in vitro que consistieron en ensayos de inhibición enzimática de colagenasa, elastasa y tirosinasa para bisresorcinol e inhibidores conocidos se llevaron a cabo como sigue.

Inhibición de la colagenasa

El reciente ensayo anti-colagenasa se modificó a partir del descrito previamente por Widyowati et al. (2016). En resumen, se utilizó como diluyente tamponante 50 mmol L-1 de tampón tricina pH 7,5 complementado con 400 mmol L-1 de NaCl y 10 mmol L-1 de CaCl2. Se disolvió colagenasa de Clostridium histolyticum (EC.3.4.24.3) en el tampón a una concentración de 1 mg L−1. La enzima-sustrato, MOCAc-PRO-Leu-Gly-Leu-A2pr (Dnp)-Ala-Arg-NH2, se disolvió previamente en DMSO y posteriormente se diluyó en el tampón a una concentración de 1 mmol L-1. Una muestra disuelta en DMSO se diluyó a diferentes concentraciones utilizando el tampón. Se incubó una solución de muestra de 2- µl con 100 µl de solución de enzima a 37 ○C durante 10 min. Luego, se añadió 50-µl de sustrato y se mezcló completamente. La emisión de fluorescencia (F) a 405 nm se registró inmediatamente y se controló continuamente durante 30 min utilizando una longitud de onda de 320 nm para la excitación. Se utilizó ácido cafeico como control de posición (Fig. 1). El control negativo se realizó con agua. El porcentaje de inhibición (porcentaje) se calculó a partir de la siguiente ecuación:

porcentaje de inhibición {{0}}{1 - (Fsam; 30 - Fsam; 0) ÷ (Fcont; 30 - Fcont; 0)} ×100.

Inhibición de elastasa

Se aplicó el ensayo según Abhijit & Manjushree (2010) con algunas modificaciones. Brevemente, el sistema tampón era 0tampón Tris-HCl 0,2 mM (pH 8,0). Se preparó una solución de 1 µg mL−1 de elastasa pancreática porcina (EC.3.4.21.36) en agua estéril. El sustrato de la enzima, N-succinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida (SANA), se disolvió en el tampón hasta una concentración de 80 mmol L−1. Una muestra disuelta en DMSO se diluyó a varias concentraciones utilizando el tampón. Se mezcló una solución de muestra de 100- µl con 50 µl de solución de enzima y se incubó durante 15 min. Después de eso, se añadieron 50 µl de la solución de enzima-sustrato y se mezcló completamente. La DO410 se midió inmediatamente (0 min) y después de la incubación durante la noche (o/n) a 37 grados usando un lector de microplacas. Se utilizó ácido ursólico como control positivo (Fig. 1) y agua como control negativo. El porcentaje de inhibición ( por ciento ) se calculó mediante la siguiente ecuación:

porcentaje de inhibición {{0}} {1 - [(Asam; o/n - Asam; 0)÷(Acont; o/n - Acont; 0)]} ×100:

Inhibición de la tirosinasa

El ensayo inhibidor de tirosinasa utilizado se adaptó del método descrito anteriormente (Jiratchayamaethasakul et al., 2020). En resumen, el ensayo se llevó a cabo en 0.05 mol L-1 tampón de fosfato pH 6.8. La tirosinasa de hongos (EC.1.14.18.1) se disolvió en el tampón a una concentración de 100 unidades mL−1. Se preparó L-tirosina, un sustrato enzimático, a una concentración de 0,25 mg mL−1 en el tampón. Se diluyó un compuesto de prueba disuelto en DMSO a concentraciones que oscilaban entre 0,625 y 10 mg mL−1. En un pocillo de 96-placas de pocillos, se mezclaron 10 µl de muestra y 40 µl de solución de L-tirosina y se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente. Después de eso, se inocularon 50 µl de solución de enzima y se mezclaron completamente. Posteriormente se detuvo la reacción mediante incubación en hielo durante 1 min. La DO475 se midió utilizando un lector de microplacas. -Arbutina y agua se utilizaron como control positivo (Fig. 1) y contraparte negativa, respectivamente. El porcentaje de inhibición (porcentaje) se calculó mediante la siguiente ecuación:

ESTUDIO DE ACOPLAMIENTO MOLECULAR

Preparación de ligandos y receptores

Las estructuras tridimensionales (3D) de bis resorcinol (CID 8917124) y los compuestos de referencia, incluidos sustratos e inhibidores, se descargaron de la base de datos PubChem para el estudio de acoplamiento molecular. Se preparó una estructura de ligando en un archivo de formato de banco de datos de proteínas (PDB) utilizando el traductor SMILES en línea y el generador de archivos de estructura. Las estructuras cristalinas de las enzimas, como la colagenasa (PDB ID 2Y6I), la elastasa (PDB ID 1BRU) y la tirosinasa (PDB ID 2Y9X) se obtuvieron de la base de datos de proteínas RCSB. El agua y las moléculas unidas se diseccionaron de todas las estructuras proteicas seleccionadas. Mientras tanto, AutoDockTools 1.5.6 agregó átomos polares de hidrógeno a las estructuras de proteínas cristalizadas. Los archivos de proteínas diana y otros compuestos utilizados se guardaron en formato PDBQT antes de realizar el acoplamiento molecular.

Selección de residuos del sitio activo y acoplamiento molecular

Los protocolos de cuadrícula y acoplamiento de las predicciones del sitio activo se prepararon utilizando AutoDockTools 1.5.6. Los sitios de cuadrícula se establecieron con un espaciado de 0.375 Å. Las dimensiones xyz se establecieron en 126-135-160 Å3 para la colagenasa, 130-120-126 Å3 para la elastasa y 80-80-80 Å3 para la tirosinasa. Los centros de los cuadros de cuadrícula (con valores de desplazamiento en AutoDockTools) fueron 31.869 (5.000), −19,41 (−25.{{20}}) y 17,815 para la colagenasa , 30.048 (−0.972), 51.253 (−2.722), 17.6 para elastasa, y −8.407 (−1.000), −23.795 (−0.250), −36.019 (−3.500 ) para tirosinasa, respectivamente. La estructura de la proteína se usó como una entidad rígida, mientras que el compuesto ligando se estableció como una molécula flexible. El estudio de acoplamiento se realizó utilizando el algoritmo genético Lamarckian (GA) implementado por AutoDock4 versión 4.2. El número de corridas de GA fue 50 con un tamaño popular de 200. La energía de enlace (ΔGbind) fue analizada por ADT. Las interacciones se visualizaron utilizando BIOVIA Discovery Studio (BIOVIA, 2020). La interacción molecular entre el compuesto y un receptor de proteína se analizó y visualizó utilizando el software BIOVIA Discovery Studio (BIOVIA, 2020). La estructura del compuesto del sitio de unión a la proteína se visualizó usando el paquete Visual Molecular Dynamics (VMD) (Humphrey, Dalke & Schulten, 1996).

análisis estadístico

RESULTADOS

Se purificó con éxito un componente principal del tronco de H. terminales utilizando técnicas de extracción con solventes y HPLC de fase inversa, respectivamente. Los espectros de 1H-NMR y 13C-NMR adquiridos se compararon con los de las sustancias de referencia a través de SciFinder (https://scififinder.cas.org/) y se encontró que se correspondían con (8′Z)-1,{ {6}}dihidroxi-5- [16′-(3″,5″-dihidroxifenil)-8′-hexadecen-1′-il] benceno (Chaturvedula et al., 2{{ 23}}02). Fue clasificado como uno de los bisresorcinoles. Este bisresorcinol reciente tenía la fórmula molecular de C28H40O4 con un peso molecular de 463,2819 Dalton. El rendimiento de extracción se calculó en 0,086 por ciento, con base en el peso seco del tronco. Su pureza fue superior al 98 por ciento, con respecto a los espectros de 1H y 13C-NMR adquiridos (véanse las Figs. S1 y S2).

Análisis de bioactividad in vitro

Los efectos antagónicos del bisresorcinol sobre las enzimas del envejecimiento, como la colagenasa, la elastasa y la tirosinasa, se determinaron in vitro utilizando un método espectroscópico distinto. Los resultados se resumen en la Tabla 1 y la Fig. 2. Para la inhibición de la colagenasa, se prepararon muestras de prueba en un rango de 50–550 µmol L−1 usando MOCAc-PRO-Leu-Gly-Leu-A2pr (Dnp)-Ala Arg-NH2 como sustrato enzimático y ácido cafeico como inhibidor enzimático. Se indicó que el bisresorcinol a una concentración de 156,7 µmol L−1 disminuyó la actividad enzimática en un 50 por ciento (IC50). En cambio, la IC50 del ácido cafeico fue de 308,9 ± 13,7 µmol L−1. Por lo tanto, la actividad anticolagenasa del bisresorcinol fue significativamente más fuerte que la del ácido cafeico.

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