Beneficio terapéutico potencial de la cistanche en dosis bajas en el síndrome de fatiga crónica

Síndrome de fatiga crónica(EM/CFS) es un debilitante multisistémicocondición crónica de etiología desconocida clasifífied como una disfunción inmuneSíndrome y trastorno neurológico. El descubrimiento del transitorio ampliamente expresadoReceptor Potencial Melastatina 3 (TRPM3) como un canal nociceptor dirigido sustancialmentepor ciertos receptores opioides, y su implicación en el calcio (Ca2 másAsesino natural dependiente de )(NK) funciones inmunes de las células ha planteado la posibilidad de que TRPM3 puede serdirigido farmacológicamente para tratar los síntomas característicos de la EM/SFC. naltrexonaclorhidrato (NTX) actúa como un antagonista de la mu (m)-receptor opioide negando asísu función inhibitoria sobre TRPM3. Basado en los beneficiosreportado por los pacientes en susíntomas, dosis baja de NTX (LDN, 3.0–5.0 mg/día) el tratamiento parece ofrecer algún beneficio potenciallo que sugiere que su efecto puede estar dirigido hacia el mecanismo patológico de ME /SFC. Como no hay literatura que confirmela eficaciade LDN para pacientes con EM/SFCin vitro, este estudio investiga el efecto terapéutico potencial de la LDN en pacientes con EM/SFC. TRPM3la actividad del canal iónico se midió después de la modulación con sulfato de pregnenolona (PregS) y ninguno enCélulas NK en 9 pacientes con EM/SFC que tomaban LDN y 9 emparejados por edad y sexocontroles sanos usando la técnica patch-clamp de células enteras. Informamos que los pacientes con EM/SFCtomando LDN han restaurado TRPM3-como corrientes iónicas en las células NK. Pequeñas corrientes iónicas conTRPM típico3-como rectificación externase midieron después de la aplicación de PregS, unTRPM3-agonista, en células NK de pacientes que toman LDN. Además, el iónico evocado por PregScorrientes a través de TRPM3 fueron significativamentemodulado por none in, un TRPM3-antagonista,en células NK de pacientes con EM/SFC que toman LDN. Estos datos apoyan la hipótesis de queLDN puede tener potencial como tratamiento para ME/SFC al caracterizar el subyacente mecanismos reguladores del tratamiento de LDN que involucran TRPM3 y receptores opioides en NKcélulas. Finalmente, este estudio puede servir para la reutilización de medicamentos comercializados, así como para apoyarla aprobación de estudios clínicos prospectivos aleatorizados sobre el papel y la dosis de NTX entratamiento de pacientes con EM/SFC.

Palabras clave:cistanche en dosis bajas, receptor potencial transitorio melastatina 3, calcio, receptor opioide, miálgicoencefalomielitis/síndrome de fatiga crónica, células asesinas naturales, electrofisiología patch-clamp de células enteras

INTRODUCCIÓN

Encefalomielitis miálgica/Síndrome de fatiga crónica(YO/CFS) es una condición multisistémica severa caracterizada porfatiga debilitante persistente acompañada de una variedad desíntomas incapacitantes que incluyen malestar post-esfuerzo, sueñodisfunción, dolor generalizado, así como trastornos neurocognitivos,autonómico, cardiovascular, neuroendocrino e inmunológicomanifestaciones (1, 2). Hay una gravedad variable de EM/SFC(leve a muy severo) (3), donde sea significativoy consistentedisfunción inmune y anomalías en Natural killer (NK)Se han informado funciones celulares en función de la gravedad (4). Sin queuna prueba diagnóstica clínicamente establecida, el diagnóstico es complejo yimpreciso. Actualmente, el diagnóstico se basa en diferentes métodos basados ​​en los síntomas.definiciones de casos, conocido como los Criterios de Consenso Canadiense(CCC, 2003) y el International Case Criteria (2011), queabordar las características clínicas de la EM/SFC (2, 5, 6). losetiología y especificidadfisiopatología de la afección, queAfecta a 17 a 24 millones de personas en todo el mundo (7), siguen siendo desconocidos.ME/CFS potencialmente se desarrolla debido a la deficiencia enCatión no selectivo de potencial de receptor transitorio (TRP)canales causados ​​por factores genéticos o adquiridos (8–13). Estudios previos sugirieron la importancia de TRP Melastatin 3(TRPM3), un calcio ampliamente expresado (Ca2 más)-permeablecanal catiónico no selectivo, en la fisiopatología de la EM/SFC(8–10). Recientemente, investigaciones electrofisiológicas independientesdemostró una pérdida de función del canal iónico TRPM3 despuésestimulación con dos potentes agonistas de TRPM3-, pregnenolonasulfato (PregS) y nifedipino, e inhibición con un selectivoy potente bloqueador, la desoxibezoína ononetina, en las células NK detres cohortes diferentes de pacientes con EM/SFC (11–13). TRPM3 ha sido previamente identificadocomo quimio ycanal nociceptor termosensible en el somatosensorialsistema y está implicado en la detección de calor nocivo y inflamatoriohiperalgesia por calor, así como en la transmisión del dolor(14). La literatura reciente sugiere que las vías de señalizaciónasociado con la activación de ciertas proteínas G acopladas(GPCR), llamados receptores opioides, pueden inhibir TRPM3actividad del canal iónico por unión directa del Gbgsubunidad de laproteínas G triméricas al canal iónico (15–18). Fisiológicamente,Los receptores opioides son activados por péptidos opioides endógenos paramodular los mecanismos del dolor y la inflamacióncaminos (19). Las drogas opioides u opiáceos producen tanto analgesia comoefectos secundarios indeseables al unirse a los mismos GPCR (19). La evidencia indica que los receptores opioides no solo se expresanpor el sistema nervioso central (SNC), pero están ampliamente distribuidosen tejidos y sistemas de órganos fuera del SNC, como elcélulas inmunes (20). Activación de los receptores opioides de los leucocitosconduce a la secreción de péptidos opioides endógenos, queactivar posteriormente los receptores opioides neuronales y aliviardolor (21). También se demostró que los opioides tienen efectos inmunosupresoresefectos sobre el sistema inmunitario innato y adaptativo (22). YO/La patología del SFC se puede considerar como un trastorno del canal de iones ocanalopatía (8–13) así como una disfunción inmunesíndrome y trastorno neurológico (23, 24). Así, es vitalpara investigar los mecanismos reguladores que subyacen a laTRPM3-interacción con el receptor opioide en células NK de EM/SFCpacientes para comprender mejor la patogenia.El descubrimiento de TRPM3 como canal nociceptordirigido sustancialmente por ciertos receptores opioides, así como suimplicación en Ca2 más-funciones inmunitarias de células NK dependientessugiere que el canal iónico TRPM3 puede ser farmacológicamentedirigido a tratar ME/SFC. El clorhidrato de naltrexona (NTX) es unantagonista opioide de larga duración específicamenteapuntando al mu-opioidereceptor (MOR) y, en menor medida, el delta-opioidereceptores (dO) (25, 26). La unión de NTX enmORs niegala función inhibitoria de estos receptores opioides en TRPM3 (15, 17, 18, 26). Anteriormente hemos informado quein vitrotratamientode células NK de pacientes con EM/SFC con NTX durante 24 horas, restaurala actividad del canal iónico TRPM3 (13). Restauración del ion TRPM3la actividad del canal a su vez restableció el Ca apropiado2 másseñalización yper secélulas NK' funciones de activación y efectoras(13). NTX se usa comúnmente en el tratamiento de opioides ydependencia del alcohol en una dosis de 50-100 mg/día (25). en altodosis, se cree que NTX bloquea los sentimientos eufóricos de las beta-endorfinasque están involucrados en los circuitos de recompensa natural ypor lo tanto puede sostener la adicción (27). Una dosis baja (3.0–5.0 mg/día,dosis bajas de NTX, LDN) parece tener un efecto opuesto,potenciando el efecto de las endorfinas para reducir el dolor y potenciarPlacer (28). Se cree que estotienen relevancia en enfermedadescomo ME/CFS, cuando sea insuficientesecreción endógenaLos péptidos opioides afectan la respuesta inmune o el control del dolor (29, 30), o la liberación de proinflamatorioscitocinas (25, 31). Un recienteestudio informó que LDN es seguro y eficaz para aliviar ME / CFSsíntomas por examen retrospectivo del paciente clínicoregistros de 218 pacientes con EM/SFC a los que se les administró LDN (27). Incluso sinueva evidencia indica que la LDN puede mejorar la función diaria ycalidad de vida en pacientes con EM/SFC, ademásin vitrola investigación esnecesarios para comprender los mecanismos reguladores subyacentesinvolucrando TRPM3 y receptores opioides en las células NK para ayudarcomprender el mecanismo patológico de la EM/SFC e identificardianas terapéuticas.Este estudio actual investigó el efecto terapéutico potencialde LDN en pacientes con EM/SFC mediante la restauración del canal iónico TRPM3funcionan en células NK utilizando técnicas de pinzamiento de parche de células enteras.Nuestros resultados indican que los pacientes con EM/SFC que toman LDN tienenTRPM restaurado3-como corrientes iónicas en células NK. Restauración deSe requiere la función TRPM3 para promover Ca2 másremodelación de señalesen células NK yper seActivación de células NK y funciones efectoras.Este es el primeroestudio para reportar la eficaciade LDN para EM/SFCpacientesin vitro, por lo que se confirmasu potencial de uso comotratamiento para la enfermedad.

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MATERIALES Y MÉTODOSReclutamiento de participantes

Nueve pacientes con EM/SFC y nueve sanos de la misma edad y sexocontroles (HC) fueron reclutados utilizando el Centro Nacional dePaciente de Neuroinmunología y Enfermedades Emergentes (NCNED)base de datos entre septiembre de 2019 y febrero de 2021.Los participantes tenían entre 18 y 60 años. Todo EM/SFClos pacientes habían recibido previamente una confirmacióndiagnostico medicoy fueron evaluados mediante un cuestionario en línea completocorrespondiente a los Centros para el Control de Enfermedades yDefiniciones de casos de prevención (CDC), CCC e ICC. Los nueve YO/Los pacientes con SFC se definieronpor el CCC. Los nueve pacientes con EM/SFCfueron reclutados por NCNED ya que anteriormente habían comenzado LDNtratamiento (3.0–5.0 mg/día) durante al menos 4 semanas como parte de suplan de manejo después de la prescripción de su médico general.HC no reportó incidencia de fatiga y gozaba de buena saludsin evidencia de enfermedad. Los participantes fueron excluidos de esteestudio si estaban embarazadas o amamantando, o informaron unantecedentes de tabaquismo, abuso de alcohol o enfermedad crónica(por ejemplo, enfermedades autoinmunes, enfermedades cardiovasculares,diabetes, síndrome metabólico, enfermedad de la tiroides, neoplasias malignas,insomnio, fatiga crónica y trastornos psicológicos primarios)o eran obesos (IMCMayor qué o igual a30). Ningún participante informó el uso de opioideso cualquier otro analgésico en los 3 meses anteriores, así comoagentes farmacológicos que directa o indirectamente influyen TRPM3 o Ca2 másseñalización. A los participantes se les proporcionó laopción de cesar cualquier conflictomedicamentos por un mínimo de 14días antes de la donación de sangre con la aprobación de su médico.Todos los participantes completaron un cuestionario en línea para proporcionarantecedentes sociodemográficos, historial médico, medicamentos yhistorial de síntomas para pacientes con EM/SFC (tabla 1). El 36-elementoencuesta de salud abreviada (SF-36) y Organización Mundial de la Salud(OMS) Se utilizó el Programa de Evaluación de la Discapacidad (DAS) paradeterminar el nivel de discapacidad y la calidad de vida (Tabla 2) (32, 33). Finalmente, se pidió a los pacientes con EM/SFC que autoinformaran la gravedad desíntomas antes y después de tomar LDN (Tabla 3). Esteinvestigación fue aprobada por el Griffithhumano universitarioComité de Ética de la Investigación (GU2019/1005) y Gold CoastComité de Ética de Investigación Humana del Hospital Universitario(HREC/2019/QGC/56469).

Célula mononuclear de sangre periféricaAislamiento y aislamiento de células asesinas naturales

Se recolectó un total de 85 ml de sangre total entubos de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)a través depunción venosapor un calificadoflebotomista de cada participante entre las 8:30 amy 10:30 a. m. en lugares de recolección, incluido GriffithUniversidad,Royal Brisbane y mujeres's Hospital, Hospital Robina, SunshineHospital Universitario de la Costa, Hospital Calvary John James,

Hospital Real de Melbourne, Australia. Análisis de sangre completo de rutinase realizó dentro de las cuatro horas de la recolección de glóbulos rojosrecuento, recuento de glóbulos blancos y recuento de células de granulocitos para cadaparticipante en el Gold Cost University Hospital o Royal MelbourneHospital, Australia.Se proporcionaron muestras al laboratorio y se anonimizaron.usando uncódigo único por un recolector de sangre independiente. Sangre periféricaSe aislaron células mononucleares (PBMC) de 80 ml desangre por centrifugación sobre un medio de gradiente de densidad (FicollPaquete Premium; GE Healthcare, Uppsala, Suecia) como anteriormentedescrito (34, 35). Las PBMC se tiñeron con azul tripán(Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) para determinar el recuento de células yviabilidad celular. Las PBMC se ajustaron a unfíficoncentración final de5x107 células/ml para el aislamiento de células NK.Las células NK se aislaron por selección inmunomagnética utilizando unKit de aislamiento de células NK humanas negativas EasySep (células madre)Technologies, Vancouver, BC, Canadá). Purificación de células NK se determinó utilizandoflflcitometría de flujo. Las células NK se incubarondurante 20 minutos a temperatura ambiente en presencia de CD56FITC ({{0}}.25µg/5µl) y CD3 PE Cy7 (0.25µg/20µl) monoclonalanticuerpos (BD Bioscience, San Jose, CA, EE. UU.) como anteriormentedescrito (10). 7-amino-actinomicina (7-AAD) (2,5 µl/prueba) (BDBioscience, San José, CA, EE. UU.) se utilizó para determinar laviabilidad. Las células se lavaron y resuspendieron en 200ml detampón de tinción (BD Bioscience, Nueva Jersey, EE. UU.) y adquirióen 10,000 eventos usando LSRFortessa X-20 (BD Biosciences,San Diego, CA, EE. UU.). Utilizando la dispersión frontal y lateral, lala población de linfocitos se controló mientras se adquiría la muestra.Luego se identificó la población de células NKcomo CD3− CD56máscélulas.

Grabación de electrofisiología de células enteras

Los registros electrofisiológicos se realizaron con borosilicatoelectrodos capilares de vidrio con un diámetro exterior de 1,5 mm y unadiámetro interior de 0.86 mm (Harvard Apparatus, Holliston, MA,EE.UU). Resistencia de la pipeta cuando está llenacon solución de pipeta fue 8-12 MW. Las pipetas se montaron en un head-stage CV203BU(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE. UU.) conectado a una 3-víamanipulador grueso y un micromanipulador (Narishige, Tokio,Japón). Las señales eléctricas se amplificarony grabado usando unAmplificador Axopatch 200By el software PClamp 10.7 (MolecularDevices, Sunnyvale, CA, EE. UU.). Los datos fueron filtradosa 5kHz ymuestreado digitalmente a 10 kHza través deun Digidata 1440A analógico aconvertidor digital (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE. UU.). losEl protocolo de rampa de voltaje estaba a un paso de un potencial de retención de más 10mV a−90 mV, seguido de una rampa de 0,1 s hasta más 110 mV, antesvolviendo a más 10 mV (repetido cada 10 s). la union liquidapotencial entre la pipeta y las soluciones de baño (−10mV) fuecorregido No se restó un componente de corriente de fuga delas corrientes registradas. Se llenó el electrodocon el intracelularsolución de pipeta que contiene 30 mM CsCl, 2 mM MgCl2, 110 mmÁcido L-aspártico, EGTA 1 mM, HEPES 10 mM, ATP 4 mM,0.1 mM GTP, pH ajustado a 7.2 con CsOH y osmolalidad de

290 mOsm/L con D-manitol. La solución de la pipeta se filtró usando un 0.22mfiltro de membrana m(Sigma-Aldrich, St. Louise, MO,USA), dividido en alícuotas y almacenado en−20 grados. Solución de bañocontenía: NaCl 130 mM, CsCl 10 mM, MgCl 1 mM2, 1,5 mmCaCl22H2O, HEPES 10 mM, pH ajustado a 7,4 con NaOH yosmolalidad 300 mOsm/L con D-glucosa. Todos los reactivos fueroncomprados a Sigma-Aldrich, excepto ATP y GTP quese adquirieron de Sapphire Bioscience. TRPM3 iónicocorrientes en las células NK se estimularon mediante la adición de 100mM Embarazadas(Tocris Bioscience, Bristol, Reino Unido) a la solución de baño, mientras queLas corrientes TRPM3 inducidas por PregS se bloquearon agregando 10mM ononetina (Tocris Bioscience, Bristol, Reino Unido). Para cada participante,Se realizaron 10 grabaciones diferentes. Por lo tanto, N se refiere al número departicipantes en cada grupo (pacientes con EM/SFC o HC) y n, alnúmero de lecturas o tamaño de la muestra. Todas las medidas fueronrealizado a temperatura ambiente. Los autores eliminaron elposibilidad de participación de corriente de cloruro en TRPM3evaluación mediante el uso de ácido L-aspártico en la pipeta intracelularsolución. También se excluyeron las celdas que tienen corrientes inestables.del análisis.Análisis estadísticoSe identificaron poblaciones de linfocitospor compañerocitometría utilizandodiagramas de puntos de dispersión frontal y lateral. La pureza de CD3- CD56másse determinaron los linfocitos. Los datos de citometría se exportaron desdeFacsDiva v8.1 y analizado con SPSS v24 (IBM Corp, versión24, Armonk, NY, EE. UU.) y GraphPad Prism v7 (GraphPadSoftware Inc., Versión 7, La Jolla, CA, EE. UU.). electrofisiológicoLos datos se analizaron utilizando el software pCLAMP 10.7 (MolecularDevices, Sunnyvale, CA, EE. UU.). Origen 2018 (OriginLabCorporation, Northampton, MA, EE. UU.) y GraphPad Prismv7 (GraphPad Software Inc., Versión 7, La Jolla, CA, EE. UU.) fueronSe utiliza para el análisis estadístico y la presentación de datos. visuales ySe utilizaron métodos computarizados para determinar la normalidad dedatos independientes.

Específicamente, los gráficos de histogramas y laSe utilizó la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk, asimetría y curtosis.para determinar la distribución de los datos y la normalidad. Dependientesobre la normalidad, se realizó una comparación estadística mediante elPrueba U de Mann-Whitney no paramétrica independiente, oPrueba t paramétrica independiente. Se utilizó la prueba exacta de Fisher paradeterminar la sensibilidad de las células NK a la ononetina. Significadose establecióen p<0.05 and="" the="" data="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" sem="" unless="">se indique lo contrario.RESULTADOSCaracterísticas de los participantes yParámetros de sangreSe incluyeron dieciocho participantes emparejados por edad y sexo paraesta investigacion Los datos demográficos de los pacientes sonresumido entabla 1. No hubo significativodiferencia enedad o sexo entre pacientes con EM/SFC y HC. El SF-36 ySe utilizaron encuestas de WHODAS para determinar la salud de los participantes.calidad de vida relacionada (Tabla 2) (36, 37). 

Como era de esperar, hubo un importantediferencia en las puntuaciones de SF-36 y WHODAS entrePacientes con EM/SFC y HC. Además, el hemograma completoSe midieron los parámetros para cada participante sano yPacientes con EM/SFC (Tabla 2). Si bien reportamos un importante diferencia de eosinófilos entre participantes sanos y ME/Pacientes con SFC, todos los resultados estuvieron dentro de lo especificadoreferenciarangos proporcionados por el Hospital Universitario de Gold CoastUnidad de Patología, laboratorio acreditado por la NATA. No significativo se informaron diferencias en otros parámetros. Finalmente, EM/SFClos pacientes informaron una mejoría en el pensamiento deteriorado,concentración y sobrecarga cognitiva, así como otros sistemas inmunológicossíntomas de alteraciones (dolor de garganta, linfa agrandada o sensible)ganglios linfáticos y susceptibilidad a los resfriados/influenza) después del tratamiento conNDT (Tabla 3), como se describió antes (27, 38). 

Pureza de células asesinas naturales

célula NKpureza (CD3- /CD56más) fue 92.42 por ciento ± 1.849 para HC y82,20 por ciento ± 9,409 para pacientes con EM/SFC que toman LDN según lo determinadoporflflcitometría de flujo (Figura 1A). No hubo significativo diferencia en la pureza de las células NK en pacientes con EM/SFC que toman LDNen comparación con HC (Figura 1B).

Actividad del canal iónico TRPM3 despuésEstimulación de pregnenolona en células NKDe pacientes con EM/SFC que toman LDNEn comparación con las células NK de HC

La actividad del canal iónico TRPM3 se registró en NK humano aisladocélulas de pacientes con EM/SFC que toman LDN (3.0–5.0 mg/día) yen comparación con las células NK humanas aisladas de la misma edad y sexoHC, usando la técnica de patch-clamp de células enteras.La función del canal de iones TRPM3 endógeno fue rápida yactivado reversiblemente por la aplicación de 100mM Embarazadas, unaesteroide neuronal. Estimulación con medición habilitada para PregSde una pequeña corriente de rectificación hacia el exterior bajo voltaje-abrazaderacondiciones y observación de una forma típica del TRPM3 corriente-tensiónrelación (I–V) (Figura 2). Nosotros por lo tanto,midió una pequeña corriente iónica con un TRPM típico3-comorectificación externaen células NK aisladas de HC después de laadición de PregS (Figuras 2A, B). Curiosamente, PregSaplicación en células NK de pacientes con EM/SFC que toman LDNimitó el aumento inducido por PregS en las células NK de HC(Figuras 2C, D). Por lo tanto, la estimulación de PregS indujo un aumentode lo exteriormente rectificadoamplitudes de corriente en las células NK dePacientes con EM/SFC que toman LDN al mismo nivel que las células NK deHC (Figura 2E). Además, las corrientes evocadas por PregS presentan unatípicoI–V de TRPM3 (Figura 2D). Los datos sugieren que ME/Los pacientes con SFC que toman LDN ya no tienen un deterioroActividad del canal TRPM3 como se informó anteriormente (11–13), ypor lo tanto, la LDN puede tener un beneficio terapéutico potencialporla patología

Modulación de PregS- Corrientes EvocadasCon ononetina en células NK de EM/SFCPacientes que toman LDN en comparación con NKCélulas de HC

Ca inducido por PregS2 más-afluenciay corrientes iónicas a través de TRPM3Los canales iónicos pueden ser inhibidos efectivamente por un compuesto natural,desoxibezoína ononetina (39). Por lo tanto, para confirmarque TRPM3actividad está involucrada en las corrientes iónicas evocadas por PregS en las células NK, nosotrossiguiente usado 10mMononetina para modular el canal iónico TRPM3actividad (figura 3). Como se mostró anteriormente (11–13), el iónicocorrientes evocadas por la aplicación de PregS fueron efectivamenteinhibido por la aplicación simultánea de ninguno en aisladoCélulas NK de HC (Figuras 3A–C). Además, elI–V deLas corrientes sensibles a la ononetina se rectificaron externamente.y típicopara TRPM3 (Figura 3B). Curiosamente, las corrientes iónicas evocadaspor la aplicación de PregS también fueron inhibidos efectivamente poraplicación simultánea de 10mMononetina en NK aisladocélulas de pacientes con EM/SFC que toman LDN (Figuras 3D–G). De hecho, la corriente iónica dependiente de TRPM3-ha sido previamentereportado como resistente a la ononetina en células NK aisladas dePacientes con EM/SFC (11–13). Sin embargo, las células NK de ME/SFClos pacientes que toman LDN son sensibles a la ononetina en el mismo rangocomo células NK de HC (Figura 3G). Además, elI–V de ononetinacorrientes sensibles fue rectificado exteriormentey típico para TRPM3

(Figura 3E). Finalmente,Figura 3Hinformes TRPM3 actualamplitudes después de la estimulación de PregS y la modulación de ononetinadentro del HC y ME/CFS tomando grupos LDN y solo elSe han incluido registros sensibles a la ononetina. Un significante Se informó una disminución de la amplitud de corriente TRPM3 después demodulación con ononetina en pacientes con EM/SFC que tomanGrupos LDN (p=0.0336) y HC (p=0.0205). Este gráfico confirmaEl canal iónico TRPM3 funciona de manera similar en ME/CFSpacientes que toman LDN en comparación con HC como la misma corrientese reportan los rangos de amplitud (Figura 3H). Colectivamente, estoslos resultados confirmanque los pacientes con EM/SFC que toman LDN no tienen unalteración de la actividad del canal iónico TRPM3, que se informa que escaracterística de la enfermedad (11–13). En conclusión, el tratamientocon LDN permite restaurar la función del canal iónico TRPM3 en ME/pacientes con SFC y tiene, por lo tanto, un potencial efecto terapéutico.

DISCUSIÓN

En el presente estudio, utilizamos el patch-clamp de células enterastécnica para medir el canal iónico TRPM3 endógenofuncionan en las células NK de pacientes con EM/SFC que toman LDN. Nosotrosinforme por primeratiempo que los pacientes con EM/SFC que toman LDN tienenTRPM restaurado3-como corrientes iónicas en células NK. De hecho, elaplicación de PregS permitió la medición de pequeños iónicoscorrientes con un TRPM típico3-como rectificación externaen NKcélulas de pacientes que toman LDN. Además, la energía iónica evocada por PregScorrientes a través de TRPM3 fueron significativamentemodulado porononetina en células NK de pacientes con EM/SFC que toman LDN comodescrito de manera similar en HC. Estos resultados reflejannuestros hallazgos anterioresinformando una restauración de la función del canal iónico TRPM3en células NK de pacientes con EM/SFC despuésin vitrotratamiento conNTX (13). Estos resultados también son consistentes con nuestro anteriorinvestigaciones que sugieran que ME/CFS puede ser considerado como uncanalopatía inducida por pérdida de función de TRPM3 ycaracterizado por una disminución de las corrientes iónicas inducidas por PregSasí como una resistencia a la ononetina en las células NK de ME/CFSpacientes (8–13). La pérdida de función TRPM3 puede ser responsablepor deficiencia de Ca2 másseñalización y Ca2 más-funciones celulares mediadas,incluidas las funciones inmunitarias de las células NK (11–13). Nuestro presente estudio novedoso es el primero in vitroestudio que confirma la eficaciay beneficio terapéuticode LDN para pacientes con EM/SFCmediante la caracterización de los mecanismos reguladores subyacentes de LDNtratamiento que involucra TRPM3 y la interacción del receptor opioideen células NK. Se ha informado previamente que LDN es beneficiosoPara eltratamiento de una variedad de enfermedades, como la esclerosis múltiple,Crohn'enfermedad de s, fibromialgia, cáncer, inflamatoriointestinoenfermedad y EM/SFC (40–44). Más específicamente, en elestudio preliminar realizado por Polo et al. sobre la seguridad yefectividad del tratamiento con LDN, 73.9 por ciento de los pacientes con EM/SFCinformaron una respuesta positiva al tratamiento (27). La mayoría de los pacientesexperimentó una mejor vigilancia/estado de alerta y una mejoría físicay rendimiento cognitivo. Algunos pacientes también informaron menos dolor.y fiebre, lo que demuestra que la LDN puede mostrar cierto potencial paraaliviar un amplio espectro de síntomas de EM/SFC (27). Similarmente,Bolton y otros. describió tres informes de casos compilados por ME/CFSpacientes que tomaban LDN e informaron el rango de respuestas,desde un cambio de vida hasta una reducción en algunos síntomas solamente (38).

Basado en los beneficiosinformados por los pacientes sobre sus síntomas,El tratamiento de LDN puede usarse como un tratamiento potencial y puedecentrarse en el mecanismo patológico de la EM/SFC.Se desconoce la patogenia de la EM/SFC, pero el ion anormalcanales y más concretamentela función TRPM3 deteriorada tienerecientemente apareció como un rasgo característico de la enfermedad (8–13). Anteriormente informamos la pérdida de función de TRPM3 después demodulación con potentes TRPM3-agonistas y antagonistas en NKcélulas de tres cohortes diferentes de pacientes con EM/SFC (11–13). Se ha descrito que TRPM3 es un actor central de Ca2 más- vías de señalización dependientes, tanto excitables como no excitablescélulas, donde Ca2 másseñales impulsan los diferentes celularesprocesos (45). Papanikolaou et al, identificadoTRPM3 comocomponente importante de la'California2 máscaja de herramientas' que sustenta el funcionamiento de la tiendaCalifornia2 másentrada y la sostenibilidad de Ca2 másseñalización enGlía de la sustancia blanca del SNC (46). De manera similar, se demostró que TRPM3 conducea un aumento de Ca2 más afluenciaen las células beta del páncreas dando como resultadoposterior liberación de insulina (47). Cada tipo de célula presenta una únicafenotipo de señalización capaz de entregar estrechamente reguladoCa espaciotemporal2 másseñales para modular su función particular(48). En consecuencia, cualquier desregulación sutil de Ca2 máslas señales puedenaltamente impactan las funciones celulares y resultan en enfermedades (48, 49). Las células NK también requieren Ca2 máspara eficienteestimulación yfunciones que incluyen la citotoxicidad de las células NK (50–53). ComprometidoLa función citotóxica de las células NK es un bien documentado y consistentecaracterística de ME/SFC (54). Por lo tanto, la pérdida de función TRPM3 puedecontribuir a la sintomatología de EM/SFC al afectarCalifornia2 másseñalización y Ca2 más-funciones celulares mediadas, incluyendo NKfunciones inmunitarias de las células.Una función bien caracterizada de TRPM3 en la literatura es supapel en la detección de calor nocivo (dolor agudo), así como inflamatoriahiperalgesia (dolor agudo y crónico) (14). Los opioides endógenos se sintetizanen vivopara modular elrespuestas analgésicas fisiológicas en procesos inflamatoriosydolor neuropático. Los opioides endógenos y exógenos se unen alos OR, que se encuentran en la periferia, en los niveles presináptico y postsinápticositios en el asta dorsal de la médula espinal y en el tronco encefálico,tálamo y corteza, en lo que constituye el dolor ascendentesistema de transmisión (55). Estudios recientes han informado queLos receptores opioides también son expresados ​​por las células inmunitarias para realizaranalgesia opioide mediada por células inmunitarias mediante la producción endógenapéptidos opioides, que involucran Gai/o–Gbg–fosfolipasa C(SOCIEDAD ANÓNIMA)–receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R)– intracelularCalifornia2 másruta. Los péptidos opioides liberados activan posteriormentereceptores opioides neuronales periféricos y aliviar el dolor (21). También se demostró que los opioides modulan directamente las funciones delinfocitos y otras células implicadas en la defensa del huésped yinmunidad que resulta en efectos inmunosupresores (56, 57). Más específicamente, activación de OR por alcaloides opioides ypéptidos como la morfina y los péptidos endógenos,incluyendo la beta-endorfina y los péptidos de dinorfina, lo que lleva a unanúmero reducido de macrófagos, leucocitos reducidosproliferación y migración a procesos inflamatoriossitios, disminuidoactividad fagocítica de los macrófagos, disminución de la quimiotaxis yproducción de superóxido por neutrófilos y macrófagos,apoptosis acelerada de macrófagos, debilitamiento microbiológicoprotección, y reducción de la adhesión de leucocitos y endotelialcélulas (58). También se han descrito otros efectos negativos enrelación con mastocitos, células dendríticas y células NK con unreducción de la citotoxicidad de las células NK y la producción de citoquinas (22, 56, 59, 60). Las células inmunitarias, la glía y las neuronas forman, por lo tanto, unred integrada que coordina las respuestas inmunitarias ymodula la excitabilidad de las vías del dolor (61). Apuntando alLos receptores opioides en las células inmunitarias pueden provocar cambios enrespuestas inmunitarias para promover la resolución deflflamación comoasí como la modulación del dolor en pacientes con EM/SFC.Curiosamente, las moléculas que se unen y activan los opioidesreceptores significativamentereducir el dolor dependiente de TRPM3-. Enrespuesta a la activación aguda por agonistas, receptores opioidespareja a la gi/o proteínas, que se disocian en Gai/o y Gbgsubunidades para interactuar con efectores intracelulares (62). TRPM3la actividad es fuertemente inhibida por la activación de µOR a través dela interacción directa con Gbgcomo Ca dependiente de TRPM3-2 máslas entradas se inhiben fuerte y reversiblemente cuando la célulala membrana esflflbañado con purificado Gbg(15–18). NTX es un duraderoantagonista opioide específicamenteinhibiendomOR, por lo tantonegando la función inhibitoria de este receptor opioide enTRPM3 (22, 26). En nuestro estudio anterior, hemos informado quein vitroel tratamiento con NTX restaura el canal iónico TRPM3actividad en células NK aisladas de ME/SFC (13). Del mismo modo, enel estudio actual, las células NK aisladas de pacientes que tomaban LDN nono exhibir ninguna actividad alterada del canal iónico TRPM3. NDTel tratamiento en pacientes con EM/SFC parece restaurar el ion TRPM3función del canal en las células NK, lo que resulta en Ca2 másseñalesremodelación para contribuir a la restauración de la integridady la estabilidad de la célula NK específicasistemas de señalización (10–13). Curiosamente, se ha informado que el efecto de antagonismo deNTX enmO también interrumpe la regulación de retroalimentación negativa endO, aumentando asídfunción O.

Mejora dedOla actividad promueve la citotoxicidad de las células NK en respuesta a las beta-endorfinas in vitroen esplenocitos de rata, lo que sugiere el potencialuso de NTX en el tratamiento de la inmunodeficiencia (63). El mecanismo subyacente a la LDN'eficaciapor fatiga,Crohn'enfermedad de s, fibromialgia, y la esclerosis múltiple, por lo tanto,consiste en el bloqueo intermitente de los receptores opioides seguido deCalifornia2 más producción dependientey regulación al alza de endógenosopioides Luis et al. informó que el suero [Met5 ]-encefalinalos niveles fueron más bajos en humanos con esclerosis múltiple en relación conpacientes sin esclerosis múltiple y LDN restauraron sus niveles.De manera similar, en ratones con encefalomielitis autoinmune experimental,[Reunió5 Los niveles de encefalina estaban deprimidos antes de la apariciónde enfermedad clínica y fueron restaurados con tratamiento LDN(28). Por lo tanto, parece que el tratamiento de LDN da como resultado lamejora de los efectos analgésicos y puede ser relevante enEM/SFC, cuando sea insuficienteLa secreción de péptidos opioides afectarespuesta inmune o control del dolor (29, 30), o la liberación de proinflamatorioscitocinas (25, 31). De hecho, las beta-endorfinas reducidasla concentración ha sido reportada en ME/CFSpacientes que sufren de desregulación de la termorregulaciónrespuestas y dolor generalizado intenso o prolongado (64). En conclusión, este estudio por primeratiempo evaluado e identificadoel efecto de LDN en la función del canal iónico TRPM3 enCélulas NK en pacientes con EM/SFC. Este novedoso estudio reporta larestauración subyacente del canal del receptor opioide TRPM3-interacción en células NK de pacientes con EM/SFC que toman LDN.Además, la amplia distribución de los canales iónicos TRPM3 en elcuerpo sugiere que su función comprometida puede contribuir asignos y síntomas de EM/SFC y, por lo tanto, tratamiento conLDN puede tener un papel terapéutico. Finalmente, este estudio sirve paraapoyar la planificación y aprobación de prospectivos aleatorizadosestudios clínicos sobre el papel y la dosis de NTX en el tratamiento de EM/pacientes con SFC.