La AKT activada por preacondicionamiento controla la tolerancia neuronal a la isquemia a través de la vía MDM2-p53Ⅰ

Abstracto

Uno de los mecanismos más importantes de la neuroprotección mediada por el precondicionamiento es la atenuación de la apoptosis celular, lo que induce tolerancia cerebral después de una isquemia perjudicial posterior. En este contexto, la vía de señalización antiapoptótica PI3K/AKT juega un papel clave en la regulación de la diferenciación y supervivencia celular.

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Se sabe que la AKT activa aumenta la expresión de double minute-2 murino (MDM2), una E3-ubiquitina ligasa que desestabiliza p53 para promover la supervivencia de las células cancerosas. En neuronas, recientemente demostramos que la interacción MDM2-p53 es potenciada por el precondicionamiento farmacológico, basado en la estimulación subtóxica del receptor de glutamato NMDA, que previene la apoptosis neuronal inducida por isquemia.

Sin embargo, se desconoce si este mecanismo contribuye a la tolerancia neuronal durante el precondicionamiento isquémico (IPC). Aquí, mostramos que IPC indujo la fosforilación de AKT mediada por PI3K en Ser473, que a su vez fosforiló a MDM2 en Ser166. Esta fosforilación desencadenó la estabilización nuclear de MDM2, lo que condujo a la desestabilización de p53, lo que impidió la apoptosis neuronal tras una agresión isquémica. La inhibición de la vía PI3K/AKT con wortmannin o por silenciamiento de AKT indujo la acumulación de MDM2 citosólico, anulando la neuroprotección inducida por IPC.

Por lo tanto, IPC mejora la activación de la vía de señalización PI3K/AKT y promueve la tolerancia neuronal al controlar la interacción MDM2-p53. Nuestros hallazgos proporcionan una nueva vía mecánica involucrada en la neuroprotección inducida por IPC a través de la modulación de la señalización de AKT, lo que sugiere que AKT es un objetivo terapéutico potencial contra la lesión isquémica. Palabras clave: AKT; MDM2; p53; PI3K; tolerancia isquémica; preacondicionamiento

1. Introducción

En humanos, la existencia de un ataque isquémico transitorio (AIT) se ha revelado como un estado precondicionado endógeno con los beneficios de los resultados funcionales en pacientes con accidente cerebrovascular [1-3]. La neuroprotección endógena inducida por un estímulo isquémico subtóxico breve, conocido como preacondicionamiento isquémico (IPC), se considera una estrategia en el campo emergente de la neuroprotección contra la lesión isquémica [4-6].

La evidencia muestra que la neuroprotección promovida por IPC depende de la transcripción, traducción y mecanismos postraduccionales, lo que altera la función de proteínas clave después de la isquemia [6–11]. Sin embargo, el mecanismo involucrado en la tolerancia isquémica (IT) inducida por IPC no se ha aclarado completamente en el cerebro humano [12,13].

El desarrollo de nuevos enfoques experimentales para comprender la neuroprotección mediada por IPC representa una herramienta poderosa para descifrar los mecanismos endógenos subyacentes a la TI cerebral [6], que tienen el potencial de revelar nuevos objetivos terapéuticos destinados a minimizar el daño cerebral en pacientes con accidente cerebrovascular. En las últimas dos décadas, la muerte de células neuronales por apoptosis se ha posicionado como un mecanismo esencial involucrado en la lesión isquémica cerebral [14-16]. En este sentido, la proteína quinasa B o AKT, una serina/treonina quinasa que requiere una fosfoinositido quinasa funcional (PI3K) para activarse, se ha considerado un objetivo esencial para las terapias neuroprotectoras después de la isquemia [17,18].

Recientemente, demostramos que la inhibición de la vía de señalización PI3K/AKT aumenta la susceptibilidad neuronal a la excitotoxicidad [19]. AKT participa en una red de señalización antiapoptótica compleja [20], cuyos componentes pueden estar presentes en diferentes ubicaciones subcelulares según el tipo de tejido [21,22]. En el corazón, la AKT ha estado implicada en la cardioprotección promovida por el preacondicionamiento [23].

La evidencia también muestra que la AKT fosforilada promueve la supervivencia neuronal al inicio de la isquemia cerebral [24]. Aunque la activación de AKT puede contribuir a la inducción de TI en el cerebro [25], el mecanismo exacto que implica su activación mediada por IPC sigue siendo difícil de determinar. En las células tumorales, la activación de la vía de señalización PI3K/AKT conduce a la fosforilación de MDM2 en Ser166/186, lo que promueve la translocación nuclear de MDM2 [26,27] y mejora su actividad de ubiquitinación [28].

En el núcleo, MDM2 se une a p53 y promueve su ubiquitinación y posterior degradación proteasómica, lo que inhibe la función de p53 [29]. En condiciones de estrés, p53 también podría desencadenar la sobreexpresión de MDM2, que por el contrario suprime la activación de p53 en un bucle de retroalimentación negativa [30]. La inhibición de PI3K previene la activación de AKT [31] y la fosforilación de MDM2 en el corazón precondicionado [32].

En este contexto, encontramos previamente que el preacondicionamiento cerebral in vivo redujo el volumen del infarto después de la oclusión transitoria de la arteria cerebral media (tMCAO) al aumentar la expresión del nivel de proteína MDM2. En consecuencia, el complejo MDM2-p53 atenuó la activación inducida por isquemia de la vía de señalización p53/PUMA/caspasa-3 en las neuronas corticales primarias [33].

Aquí, profundizamos en el papel de la vía de señalización PI3K/AKT en la tolerancia neuronal mediada por IPC frente a una lesión isquémica posterior, así como en el mecanismo subyacente, y nos centramos principalmente en el vínculo potencial entre la activación de AKT y el complejo MDM2-p53. .

2. Resultados

2.1. Neuroprotección promovida por IPC

Está mediado por la fosforilación de AKT en Ser473, la fosforilación de MDM2 en Ser166 y la desestabilización de p53. Anteriormente describimos el impacto de la interacción MDM2-p53 en la susceptibilidad neuronal a la isquemia [34] y la TI [33]. Aquí, exploramos el papel potencial de AKT en la neuroprotección mediada por IPC como candidato para participar en la vía MDM2-p53.

Primero, confirmamos que la isquemia promovió la activación de AKT en las neuronas, como lo demuestra la fosforilación de AKT en Ser473. Como se muestra en la Figura 1A, la OGD corta (20 min) indujo significativamente la expresión de p (Ser473) AKT y MDM2, mientras que los niveles de proteína AKT permanecieron inalterados (Figura S1A). Sin embargo, no se observó la fosforilación de AKT cuando las neuronas se sometieron a OGD prolongada (90 min). Además, los niveles de proteína MDM2 fueron más bajos, lo que es consistente con la mayor expresión de proteína p53 como se muestra en la Figura 1A.

La regulación positiva dependiente del tiempo de la expresión de Mdm2 después de OGD (Figura 1B) confirma que la isquemia subaguda puede ser importante para inducir mecanismos que previenen la estabilización de p53 después de OGD, como se describió anteriormente [33]. Utilizamos OGD corto (20 min) seguido de 2 h de reoxigenación como modelo de IPC (Figura S1B) [33]; así, analizamos extractos neuronales recolectados a las 4 h de reoxigenación después de OGD (OGD/R) o después de OGD precedida por el protocolo IPC (IPC más OGD/R). Paralelamente, las neuronas se incubaron en entornos de normoxia (Nx) o preacondicionamiento (IPC) (Figura S1B).

Como se muestra en la Figura 1C y la Figura S1C, IPC indujo la activación temprana de AKT, como lo revela la fosforilación en Ser473 [35], seguida de la estabilización y fosforilación de la proteína MDM2 en Ser166. IPC también impidió la estabilización de p53 inducida por OGD/R (Figura 1C). Curiosamente, las imágenes de inmunofluorescencia que se muestran en la Figura 1D revelaron que IPC promovió la fosforilación de AKT en Ser473 en las neuronas, que predominantemente se acumuló en el núcleo, y disminuyó la estabilización de p53 después de OGD/R (IPC más OGD/R) en comparación con neuronas no preacondicionadas (OGD /R).

En consecuencia, IPC evitó la apoptosis neuronal y la activación de caspasa-3 causada por OGD/R, según lo medido por citometría de flujo (Figura S1D) y ensayos de fluorimetría (Figura S1E), respectivamente. Para confirmar el papel de p53 en la neuroprotección mediada por IPC, utilizamos neuronas que expresan (tipo salvaje; wt) o no (knockout; ko) la proteína p53. Nuestros resultados muestran que las neuronas que carecen de p53 (Figura S1F) fueron más resistentes a la apoptosis inducida por OGD que las neuronas p53 wt.

Además, los niveles de apoptosis en las neuronas p53KO fueron similares a los observados en las neuronas wt preacondicionadas (IPC más OGD/R) (Figura S1G), lo que confirma el papel clave de la desestabilización de p53 en la neuroprotección mediada por IPC [33]. Nuestros resultados muestran que IPC indujo neuroprotección contra un insulto isquémico a través de un mecanismo que implica la fosforilación de AKT en Ser473, la estabilización y fosforilación de MDM2 en Ser166 y la desestabilización de p53.

2.2. IPC desencadena la fosforilación de MDM2 en Ser166 a través de la vía PI3K/AKT

La vía de señalización PI3K/AKT está implicada en la TI neuronal tanto in vitro [36] como in vivo [37]. Sin embargo, el papel de la activación de la vía PI3K/AKT mediada por IPC en la regulación del complejo MDM2-p53 sigue sin explorarse. Para aclarar esto, las neuronas se incubaron con el inhibidor irreversible y específico de la vía PI3K/AKT, wortmannin [19].

Como se muestra en la Figura 2A, la wortmanina anuló la fosforilación de AKT (Ser473) mejorada por IPC y la desestabilización de p53, como se muestra en la Figura 1D. Estos resultados sugieren un vínculo directo entre la activación de AKT y la inhibición de la apoptosis neuronal mediada por p53-(Figura S1D) y la activación de caspasa-3 (Figura S1E) inducida después de OGD/R. El principal regulador de la estabilización de p53, MDM2, es un objetivo de AKT [26], que fosforila MDM2 en Ser166 y Ser186 [26]. La inhibición de PI3K con wortmannin impidió la fosforilación de (Ser473) AKT y (Ser166) MDM2 inducida por IPC (Figura 2B).

La fosforilación específica mediada por Akt de MDM2 en Ser166 inducida por IPC se confirmó mediante el uso de un pequeño ARN de interferencia (siRNA) diseñado específicamente contra la proteína AKT1 (siAkt), altamente expresada en neuronas corticales, y cuya actividad es esencial para la supervivencia neuronal después de la isquemia. 38]. Como se muestra en la Figura 3, siAkt redujo los niveles totales de proteína AKT y p(Ser473)AKT en el día 3 después de la transfección, tanto en células HEK-293T (Figura 3A) como en neuronas corticales (Figura 3B).

Además, la caída de AKT (siAkt) impidió la fosforilación de (Ser166) MDM2 (Figura 3B). Estos resultados demuestran que la vía de señalización de PI3K/AKT activada por IPC promueve la fosforilación de MDM2 en Ser166, que puede ser responsable de la estabilización de MDM2 y la consiguiente desestabilización de p53 después de una lesión isquémica.

2.3. La AKT activada por IPC desencadena la estabilización de la proteína MDM2 nuclear después de la isquemia

La activación de AKT ha estado involucrada en la translocación nuclear de MDM2 en células tumorales [26]. Teniendo en cuenta la relevancia de la estabilización nuclear de MDM2 para la supervivencia neuronal después de la isquemia [34] y, más específicamente, su papel neuroprotector en IPC [33], decidimos investigar más a fondo la relevancia de la vía de señalización PI3K/AKT en la regulación de la localización subcelular de MDM2 proteína.

Por lo tanto, las neuronas o células HEK-293T se transfectaron con proteína marcada con MDM2-humana (MDM2-GFP). En la Figura 4A y la Figura S1H se muestran transferencias representativas de células T HEK-293transfectadas e imágenes de neuronas que expresan ectópicamente la proteína MDM2 humana después de cuatro condiciones experimentales diferentes (Nx, IPC, OGD/R e IPC más OGD/R). , respectivamente.

La expresión ectópica de MDM2- GFP confirmó que IPC promueve la acumulación nuclear de MDM2 en comparación con las neuronas isquémicas (OGD/R) o normóxicas (Nx) no precondicionadas (Figura 4A, B), según lo revelado por la cuantificación de la proporción de fluorescencia nuclear/citosólica (Figura S2B) e intensidad de fluorescencia nuclear de MDM2-GFP (Figura S2C).

2.4. IPC promueve la interacción de p(Ser473)AKT y MDM2, lo que mejora la estabilización de MDM2 en el núcleo y reduce la apoptosis neuronal inducida por isquemia

Tras la demostración del papel de la activación mejorada por IPC de la vía PI3K/AKT en la estabilización nuclear de MDM2, investigamos más a fondo si p(Ser473)AKT y MDM2 interactuaban dentro del núcleo (Figura 6A). La inmunoprecipitación de MDM2 a partir de extractos de proteínas nucleares, seguida de inmunotransferencia contra MDM2 y p(Ser473)AKT, reveló que IPC promovió la interacción entre p(Ser473)AKT y MDM2, después de OGD/R, evitando así la estabilización de p53 nuclear inducida por OGD/R. como se muestra en la entrada del núcleo (Figura 6A).

Por último, estudiamos el efecto perjudicial de la interrupción de la vía PI3K/AKT en la apoptosis neuronal (Figura 6B). La inhibición de AKT contrarrestó el efecto protector de IPC antes de OGD, lo que confirma el papel neuroprotector de AKT-MDM2 en el contexto de TI. Nuestros resultados, por lo tanto, demuestran que IPC induce la fosforilación y activación de AKT, lo que promueve la fosforilación de MDM2 en Ser166 y la translocación nuclear, donde interactúa con p (Ser473) AKT. Este mecanismo puede contribuir a mejorar la estabilización nuclear de MDM2, que desempeña un papel esencial en la tolerancia isquémica inducida por IPC.

¿Cómo protege Cistanche a las neuronas?

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Continuará...

Emilia Barrio 1,†, Rebeca Vecino 1,2,†, Irene Sánchez-Morán 1, Cristina Rodríguez 1,2,3, Alberto Suárez-Pindado 1, Juan P. Bolaños 1,2,3,4, Ángeles Almeida 1, 2,3 y María Delgado-Esteban 1,2,3,*

1 Instituto de Biología Funcional y Genómica, Universidad de Salamanca, CSIC, 37007 Salamanca, España; emibg7@gmail.com (EB); rebecavecino@usal.es (RV); irene_sm@usal.es (IS-M.); c.rodriguez@usal.es (CR); Alsuap77@gmail.com (AS-P.); jbolanos@usal.es (JPB); aaparra@usal.es (AA)

2 Instituto de Investigaciones Biomédicas de Salamanca, Hospital Universitario de Salamanca, Universidad de Salamanca, CSIC, 37007 Salamanca, España

3 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Salamanca, 37007 Salamanca, España 4 Centro de Investigación Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento Saludable (CIBERFES), Instituto de Salud Carlos III, 28029 Madrid, España * Correspondencia: mdesteban@usal.es ; Tel.: más 34-923-29-4908