Aislamiento preparativo y purificación de cuatro compuestos de Cistanches Deserticola YC Ma mediante cromatografía a contracorriente de alta velocidad

1. Introducción

Cistanches deserticolaYC Ma, una especie decistanchesque pertenece a laOrobancháceasfamilia, es una medicina tradicional china muy conocida para el tratamiento de la deficiencia renal, la infertilidad femenina, la leucorrea mórbida, la neuropraxia y el estreñimiento senil [1]. Es una planta parásita que se distribuye ampliamente en el noroeste de China. Hasta ahora, varios compuestos, incluidosglucósidos feniletanoides (PhG), iridoides y lignanos se han aislado de esta especie [2]. Se ha informado que algunos de los PhG poseen actividades antioxidantes, hepatoprotectoras y neuroprotectoras [3–6]. Sin embargo, el procedimiento de aislamiento y purificación de PhG es difícil y requiere mucho tiempo. Además, los métodos clásicos de cromatografía múltiple no sólo utilizan una gran cantidad de disolventes orgánicos sino que también dan una menor recuperación de la muestra. La cromatografía a contracorriente de alta velocidad (HSCCC), una técnica cromatográfica de partición líquido-líquido sin soporte, ofrece una excelente recuperación de muestras en comparación con algunos métodos convencionales y se ha utilizado ampliamente para la separación y purificación de diversos productos naturales [7–9]. . Aunque se han purificado varios PhG decistanchesgénero y otros por HSCCC [10-14], ningún artículo ha informado sobre la purificación de acteosido, isoacteosido, siringalida A 3'- -L-ramnopiranósido y 2'-acetilactósido en un sistema bifásico.

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En este artículo, presentamos un método simple para la separación y purificación de cuatro PhG de C. deserticola. Finalmente, en una separación de un solo paso se obtuvieron 30.9 mg de acteósido, 13,0 mg de isoactósido, 12,5 mg de siringalida A 3'- -L-ramnopiranósido y 7,2 mg de 2'-acetilactósido. a partir de 297 mg de fracción con purezas del 99%, 95%, 99% y 98%, respectivamente. Sus estructuras se caracterizaron basándose en datos espectrales de 1 H y 13 C-NMR y espectros HR-MS. Las estructuras de los cuatro PhG identificados en esta investigación se muestran en la Figura 1.

2. Resultados y Discusión

2.1. Análisis por HPLC del extracto crudo

La fracción constituyente enriquecida del extracto de n-butanol de C. deserticola se analizó mediante HPLC-UV. La columna utilizada fue una Accurasil C18 (250 mm × 4,6 mm, id 5 μm) (Thermo-Fisher Scientific Instruments, ciudad, abreviatura de estado, EE. UU.), la fase móvil fue metanol-agua (30:70, v/v). El caudal fue de 1 ml/min. La longitud de onda del detector se fijó en 254 nm. El cromatograma de HPLC se muestra en la Figura 2. Los picos 1 a 4 corresponden a actósido (1), isoactósido (2), siringalida A 3'- -L-ramnopiranósido (3) y 2'-acetilactósido (4), respectivamente. .

2.2. Selección del sistema solvente de dos fases

La separación exitosa mediante HSCCC depende en gran medida de la selección de un sistema solvente de dos fases adecuado; el sistema solvente de dos fases se seleccionó de acuerdo con los valores del coeficiente de partición (K) de cada componente objetivo y un rango óptimo de K debe ser de {{ 2}}.5 a 2.

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En el experimento, los valores de K para los componentes objetivo de varios sistemas de disolventes de dos fases se muestran en la Tabla 1 (aunque un poco más altos para el pico 4, los resultados demostraron ser aceptables). Entre ellos, acetato de etilo-n-butanol-etanol-agua (40:6:6:50, v/v/v/v) dieron coeficientes de partición adecuados para los compuestos objetivo. Finalmente, se utilizó el sistema disolvente compuesto de acetato de etilo-n-butanol-etanol-agua (40:6:6:50, v/v/v/v) para aislar y purificar cuatro compuestos de C. deserticola, como se muestra en Figura 3. Como se muestra en la Figura 2, el análisis por HPLC de cada fracción de HSCCC reveló que cuatro PhG puros (actósido, 99 %; isoactósido, 95 %; siringalida A 3′- -L-ramnopiranósido 99 % y 2′- acetilactósido 98%) se pudo obtener a partir de la fracción cruda.

3. experimentales

3.1. Aparato El HSCCC

El equipo empleado en el presente estudio fue un sistema de cromatografía en contracorriente de alta velocidad TBE{{0}}B (Shanghai Tauto Biotech Co., Shanghai, China) con tres columnas preparativas de separación de bobinas multicapa conectadas en serie (diámetro de tubo=2.6 mm, volumen total=300 ml) y un bucle de muestra de 2{{10}} ml. El radio de revolución o distancia entre el eje del soporte y el eje central de la centrífuga (R) fue de 5 cm, y el valor varió de 0,5 en el terminal interno a 0,8 en el terminal externo (= r/R, donde r es la distancia desde la bobina al eje del soporte). Se utilizó un implemento de circulación de temperatura constante HX 105 (Beijing Changliu Lab Instrument Company, Beijing, China) para controlar la temperatura en el experimento. El sistema HSCCC estaba equipado con una bomba de flujo constante de presión media modelo TBP-5002, un detector UV modelo TBP-2000 que operaba a 254 nm y una estación de trabajo modelo V4.0 (Jinda Bio-chemistry Instrument). Compañía, Shanghái, China).

El equipo de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) utilizado fue un sistema Agilent 1200 que consta de una bomba binaria G1312A, un muestreador automático G1329A, un detector de longitud de onda variable (VWD) G1314A, un compartimento de columna termostatizado G1316A, un desgasificador G1379B y una estación de trabajo LC Agilent. . Se utilizó un ELSD alltech 3300 para la detección de las purezas. Se utilizaron espectrómetros de RMN 500-Agilent 6520 Q-TOF y Bruker AVANCE III para la identificación estructural de los compuestos. Los espectros de RMN de 1H y 13C (a 500 y 125 MHz, respectivamente) se midieron a temperatura ambiente (22 grados/295,1 K).

3.2. Reactivos y materiales

El acetato de etilo, el n-butanol y el etanol eran de calidad analítica y el metanol era de calidad HPLC. Todos los disolventes se compraron en Tianjin Concord Technology Company (Tianjin, China). Se utilizó agua Milli-Q (18,2 MΩ) (Millipore, Bedford, MA, EE. UU.) para todas las soluciones y diluciones. El rizoma de C. deserticola se recolectó en la provincia de Mongolia Interior, República Popular China, en junio de 2009. La planta fue identificada por el Prof. Lijuan Zhang y se depositó en nuestro laboratorio un espécimen comprobante (Nº 20091001).

3.3. Preparación de muestra cruda

Tallos carnosos en polvo secados al aire de C. deserticola (1 kg) se sometieron a reflujo dos veces con etanol acuoso (8 l, 60 % v/v) durante 2 h cada vez. El extracto se evaporó a presión reducida y a una temperatura de 60 grados hasta la evaporación total del etanol. El residuo se suspendió en agua y se extrajo sucesivamente tres veces con cloroformo, acetato de etilo y n-butanol, proporcionando 5,16 g de extracto de n-butanol después de la evaporación hasta sequedad bajo presión reducida. Luego se separó el extracto n-butanoico en una columna de gel de sílice (malla 200–300) usando elución en gradiente progresivo (CHCl3–MeOH, 10:1→1:1) para dar ocho fracciones. Se usó la fracción 6 (297 mg) para aislamiento y separación adicionales de HSCCC.

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3.4. Selección de los sistemas de disolventes bifásicos.

Los sistemas disolventes de dos fases se seleccionaron de acuerdo con el coeficiente de partición (K) de los componentes objetivo en la fracción de C. deserticola. Los valores de K se determinaron mediante análisis LC de la siguiente manera: se disolvió una cantidad adecuada de polvo de extracto crudo (fracción 6) en la fase inferior del sistema disolvente y se analizó mediante HPLC. Las áreas de los picos se registraron como A1. Luego se añadió un volumen igual de la fase superior a la solución y se mezcló completamente para alcanzar el equilibrio de partición. A continuación se analizó de nuevo la fase inferior mediante HPLC. Las últimas áreas de pico se registraron como A2. Los valores K se calcularon de acuerdo con la siguiente ecuación: K=(A1 - A2)/A2 [15,16].

3.5. Preparación de un sistema solvente de dos fases y una solución de muestra

En el presente estudio, se utilizó el sistema disolvente de dos fases compuesto de acetato de etilo-n-butanol-etanol-agua (40:6:6:50, v/v/v/v) para la separación HSCCC. Cada disolvente se añadió a un embudo de decantación y se equilibró completamente a temperatura ambiente. La fase superior y la fase inferior se separaron y desgasificaron mediante sonicación durante 30 minutos poco antes de su uso. La solución de muestra se preparó disolviendo 297 mg de la Fracción 6 en 15 ml de la fase inferior de acetato de etilo-n-butanol-etanol-agua (40:6:6:50, v/v/v/v).

3.6. Procedimiento de separación de HSCCC

HSCCC se realizó de la siguiente manera. La columna en espiral multicapa se llenó primero con la fase estacionaria orgánica superior. Luego se bombeó la fase móvil acuosa inferior al extremo de cabeza de la columna a un caudal de 1,5 ml/min y, al mismo tiempo, se hizo funcionar el aparato HSCCC a una velocidad de revolución de 900 rpm. Después de que se estableció el equilibrio hidrodinámico, como lo indica una fase móvil clara que eluyó en la salida de la cola (aproximadamente dos horas después), se inyectó a través de la válvula de inyección una solución de muestra de 15 ml que contenía 297 mg del extracto crudo (fracción 6). El efluente de la columna se controló continuamente a 254 nm. Se recogieron cuatro fracciones máximas según el cromatograma y luego se evaporaron a presión reducida. La temperatura del aparato se fijó en 25 grados.

3.7. Análisis por HPLC e identificación de fracciones máximas de HSCCC

Las fracciones máximas de HSCCC se analizaron mediante HPLC-ELSD. La columna utilizada fue una Accurasil C18 (250 mm x 4,6 mm, d.i. 5 μm) y la fase móvil fue metanol-agua (30:70, v/v). El caudal fue de 1 ml/min. ELSD se hizo funcionar en las siguientes condiciones: temperatura 45 grados, gas 1,6 l/min. La identificación estructural de las cuatro fracciones máximas de HSCCC se llevó a cabo mediante espectroscopia HR-ESI-MS, 1 H y 13 C-NMR.

3.8. La identificación estructural

Fracción I: HR-ESI-MS observada a m/z 623,2001 (M-H)-, calculada para C29H35O15, 623,1981. RMN 1H (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 de ramnosa), 2,79 (2H, t, J=7 }.5 Hz, Ar- CH2-), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 de glucosa), 5,18 (1H, d, J=1 Hz, H{{34 }} de ramnosa), 6,27 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,1 (6H, H aromático). RMN 13C (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C-2), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,4 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C-), 36,6 (C-), 127,7 (Caf-1), 115,3 (Caf{{89 }}), 146,9 (Caf-3), 149,8 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf-), 114,8 (Caf-), 148,1 (Caf-), 104,3 (G-1), 76,1 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,5 (Glc-4 ), 76,3 (Glc-5), 62,4 (Glc-6), 103,1 (Rha-1), 72,3 (Rha-2), 72,1 (Rha-3 ), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,5 (Rha-6). En comparación con los datos proporcionados en la literatura [17], la fracción I correspondió al actósido.

Fracción II: HR-ESI-MS observada a m/z 623,1987 (M-H)-, calculada para C29H35O15, 623,1981. RMN 1H (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,25 (3H, d, J=6.5 Hz, CH3 de ramnosa), 2,78 (2H, t, J= 7 Hz, Ar-CH2-), 4,33 (1H, d, J=8 Hz, H-1 de glucosa), 5,17 (1H, d, J { {33}} Hz, H-1 de ramnosa), 6,28 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,56 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,0 (6H, H aromático). RMN 13C (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C-2), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,5 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C-), 36,7 (C-), 127,8 (Caf-1), 115,2 (Caf{{89 }}), 146,8 (Caf-3), 149,7 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 169,2 (Caf-), 115,0 (Caf-), 147,3 (Caf-), 104,5 (G-1), 75,5 (Glc-2), 84,2 (Glc-3), 70,1 (Glc-4 ), 75,7 (Glc-5), 64,7 (Glc-6), 102,8 (Rha-1), 72,4 (Rha-2), 72,4 (Rha-3 ), 74,1 (Rha-4), 70,5 (Rha-5), 17,9 (Rha-6). Los datos espectrales de 1 H-NMR y 13C-NMR coincidieron con los del isoacteosido como se informa en la literatura [18].

Fracción III: HR-ESI-MS observada a m/z 6{{108}}7,2032 (M-H)-, calculada para C29H35O14, 607,2032. RMN 1H (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 de ramnosa), 2,84 (2H, t, J=7 }.5 Hz, Ar- CH2-), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 de glucosa), 5,19 (1H, d, J=1.5 Hz, H{ {35}} de ramnosa), 6,27 (1H, d, J=16 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=16 Hz, Ar- CH=CH-), 6,6–7,1 (7H, H aromático). RMN 13C (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 130,8 (C-1), 116,2 (C-2), 130,9 (C-3), 156,8 (C-4 ), 130,8 (C-5), 116,2 (C-6), 72,4 (C-), 36,4 (C-), 127,8 (Caf-1), 114,8 (Caf{{88 }}), 149,8 (Caf-3), 146,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf-), 115,4 (Caf-), 148,0 (Caf-), 104,3 (G-1), 76,3 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,4 (Glc-4 ), 76,1 (Glc-5), 62,5 (Glc-6), 103,0 (Rha-1), 72,3 (Rha-2), 72,2 (Rha-3 ), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,4 (Rha-6). Según la literatura [18], la fracción III correspondió a siringalida A 3'- -L-ramnopiranósido.

Fracción IV: HR-ESI-MS observada a m/z 665,21{{20}} (M-H)-, calculada para C31H37O16, 665,2087. RMN 1H (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,09 (3H, d, J=6.5 Hz, CH3 de ramnosa), 2,00 (3H, s, OAc), 2,72 (2H, t, J=7.5 Hz, Ar-CH2-), 4,55 (1H, d, J=8 Hz, H-1 de glucosa), 4,90 (1H, d, J=1 Hz, H-1 de ramnosa), 6,29 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,62 (1H, d , J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,0 (6H, H aromático). RMN 13C (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131,9 (C-1), 117,3 (C-2), 146,1 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,4(C-5), 121,4 (C-6), 72,7 (C-), 36,4 (C-), 127,7 (Caf-1), 115,4 (Caf{{93 }}), 146,9 (Caf-3), 149,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,1 (Caf-), 114,7 (Caf-), 148,2 (Caf-), 101,8 (G-1), 75,3 (Glc-2), 80,3 (Glc-3), 70,8 (Glc-4 ), 76,2 (Glc-5), 62,3 (Glc-6), 103,3 (Rha-1), 72,0 (Rha-2), 71,8 (Rha-3 ), 73,7 (Rha-4), 70,8 (Rha-5), 18,5 (Rha-6), 171,5 (C=O), 20,9 (ACO). Los datos espectrales de 1 H-NMR y 13C-NMR coincidieron con los del 2'-acetilactósido [17].

4. Conclusiones

Se estableció un método HSCCC para la separación preparativa y purificación de actósido, isoactósido, siringalida A, 3'- -L-ramnopiranósido y 2'-acetilactósido de Cistanches deserticola YC Ma. El presente estudio indica que HSCCC es una técnica muy poderosa para la separación preparativa y purificación de componentes bioactivos de materiales vegetales. Además, los compuestos pueden aislarse a una escala suficientemente grande con purezas elevadas y luego pueden usarse como sustancias de referencia para cromatografía o estudios de bioactividad. El método es una técnica factible, económica y eficiente para el aislamiento preparativo rápido de productos naturales complicados.

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