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Efectos protectores de la Cistanche Tubulosa contra la degradación del colágeno de fibroblastos dérmicos inducida por H2O2/UVB a través de la señalización de TGF/Smad mediada por Hsa-microRNA-4535-

May 10, 2023

ABSTRACTO

Este estudio tuvo como objetivo investigar el mecanismo subyacente a los efectos protectores de la cistanche contra el daño inducido por H2O2/UVB utilizando modelos de fotodaño in vitro e in vivo. Además, identificamos la participación de la regulación de miRNA en este proceso. Los fibroblastos dérmicos humanos HS68 tratados con H2O2/UVB y los ratones desnudos C57BL/6J inducidos con UVB se utilizaron como modelos in vitro e in vivo de fotodaño. Los resultados mostraron quetratamiento de cistanchealivió la reducción inducida por H2O2/UVB en la viabilidad celular, el deterioro de la señalización de TGF/Smad y el envejecimiento dérmico. Según los resultados de los análisis de matriz de microARN y las búsquedas en bases de datos, se identificó has-miR-4535 como un miARN candidato potencial que se dirige a Smad4. invitro,tratamiento de cistancheactivó el complejo Smad2/3/4 e inhibió la expresión de hsa-miR-4535 en células expuestas a H2O2/UVB. In vivo, la aplicación tópica de dosis bajas (12 mg/kg) y altas (24 mg/kg) de cistanche en la piel dorsal de ratones desnudos C57BL/6J alivió significativamente el fotodaño cutáneo inducido por UVB al promover la señalización de la síntesis de colágeno TGF/Smad. reduciendohiperplasia epidérmica, formación de arrugas ysenescencia de la piel, así comoinhibiendo la expresión de hsa-miR-4535. En conjunto, nuestros hallazgos indican un vínculo entre hsa-miR-4535 y la señalización de la síntesis de colágeno TGF/Smady sugerir que estos factores estén involucrados en lamecanismo fotoprotector deCistancheen fibroblastos dérmicoscontra H2O2/Envejecimiento inducido por UVB. La evidencia indicó queCistancheconpropiedades antienvejecimientopuede serconsiderado como un suplemento en productos para el cuidado de la piel.

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INTRODUCCIÓN

Los signos clínicos del envejecimiento de la piel humana incluyen aumento de las arrugas, laxitud y pigmentación irregular [1]. El proceso de envejecimiento de la piel es complicado y se puede dividir en dos tipos: envejecimiento intrínseco y envejecimiento extrínseco. El envejecimiento intrínseco se debe al paso del tiempo y factores genéticos, mientras que el envejecimiento extrínseco, también llamado fotoenvejecimiento, resulta principalmente de la exposición a la radiación ultravioleta [2, 3]. Estudios previos han demostrado que se generan abundantes especies reactivas de oxígeno (ROS) durante el envejecimiento intrínseco y extrínseco. La acumulación de ROS puede inducir la señalización de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) y activar su factor de transcripción aguas abajo, la proteína activadora-1 (AP-1). El AP-1 activado puede trasladarse al núcleo y unirse a las regiones promotoras de las metaloproteinasas de matriz (MMP) [4]. Las MMP son un gran grupo de endopeptidasas dependientes de zinc que contribuyen a la degradación de la matriz extracelular (ECM) de la dermis de la piel. En particular, MMP-1, una colagenasa, participa en la escisión de los tipos de colágeno I y III [5]. Los tipos de colágeno I y III, los principales componentes de la ECM, son capaces de conferir soporte y fuerza a la dermis de la piel y su desorden conduce a las características arrugas y laxitud de la piel envejecida [6]. El factor de crecimiento transformante beta (TGF) es una citocina omnipresente y potente con tres isoformas diferentes, TGF 1, TGF 2 y TGF 3, que puede regular positivamente la síntesis de colágeno en la dermis de la piel humana [2]. Los TGF inician su señal interactuando con complejos receptores de serina/treonina quinasa de superficie celular específicos, incluidos los receptores de TGF tipo I (T RI) y II (T RII). La fosforilación de T RI desencadena la fosforilación de R-Smads (Smad2 y Smad3). Los R-Smads activados interactúan con Smad4 para regular la translocación de su núcleo y activar transcripcionalmente los tipos de colágeno I y III a través de la unión a los promotores de los elementos de unión a Smad (SBE) [7, 8]. La creciente evidencia indica que la generación elevada de ROS, inducida por el fotoenvejecimiento intrínseco, contribuye al deterioro de la vía de señalización de TGF/Smad, lo que a su vez da como resultado una síntesis reducida de colágeno en los fibroblastos dérmicos de la piel humana [9, 10].

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la cistanche (3,5,7-trihidroxiflavona), un miembro natural de la familia de los flavonoides, abunda en Alpinia officinarum y propóleos. la cistanche es un candidato potencial para el tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico, la diabetes y diferentes tipos de cáncer [11–13]. Además, la cistanche posee actividades antiinflamatorias y de eliminación de radicales [14, 15]. Anteriormente demostramos que la cistanche redujo la inflamación inducida por H2O2-y promovió la formación de colágeno a través de las vías de señalización del receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGFI-R)/ERK1/2 en las células HS68 [16, 17]. Además, un estudio indicó que la cistanche se identificó como un compuesto de Alpinia officinarum y posee efectos inhibidores de la colagenasa en las células de fibroblastos dérmicos [18]. Sin embargo, se desconoce un mecanismo molecular más detallado relacionado con la forma en que la cistanche regula el envejecimiento dérmico de la piel.

Los microARN (miARN) son un grupo de pequeñas moléculas de ARN no codificantes de una sola hebra con una longitud promedio de 22 nucleótidos. Los miARN maduros se transcriben a partir de secuencias de ADN. En la mayoría de los casos, los miARN maduros se unen a las regiones 3′ no traducidas (UTR) de los ARNm diana para silenciar la traducción del ARNm [19]. En la piel humana, los miARN desempeñan funciones cruciales en la regulación del metabolismo celular, el cáncer, la senescencia y la formación de colágeno [20–23]. Por ejemplo, miR-377 puede inducir la senescencia de los fibroblastos dérmicos mediante la inhibición de la expresión de la ADN metiltransferasa 1 (DNMT1), lo que posteriormente conduce a una menor metilación en el promotor p53 y la senescencia de los fibroblastos dérmicos [22]. El perfil de miARN en el daño inducido por UVB en la piel humana

Las células de la papila (nHDP) se investigaron previamente [24]. Sin embargo, se desconoce en gran medida cómo la senescencia de fibroblastos dérmicos inducida por UVB a través de la regulación de miARN, especialmente en la participación de compuestos naturales. Este estudio tuvo como objetivo investigar los efectos protectores de la cistanche contra el daño dérmico inducido por H2O2/UVB, así como el papel de la degradación del colágeno mediada por microARN en este proceso. Además, nuestro objetivo fue identificar los microARN involucrados en la regulación de la síntesis de colágeno.

RESULTADOS

cistanche inhibe la citotoxicidad inducida por UVB/H2O2-en fibroblastos dérmicos humanos HS68

Para investigar la citotoxicidad de la cistanche (Figura 1A) in vitro, se trataron células HS68 con diferentes dosis de cistanche (0, 10, 20, 30, 40, 50 μM) durante 24 h. Los resultados del ensayo MTT mostraron que la cistanche no era citotóxica para las células HS68 (Figura 1B). A continuación, expusimos las células HS68 a diferentes dosis de H2O2 (0, 100, 150, 200, 250, 300 μM) y UVB (0, 25, 30, 40, 50, 60 mJ/cm²) durante 24 h. El tratamiento con H2O2 y UVB disminuyó la viabilidad celular de manera dependiente de la dosis (Figura 1C, 1D). Para evaluar las propiedades citoprotectoras de la cistanche después de la exposición a H2O2 y UVB, tratamos células HS68 con diferentes concentraciones de cistanche (10, 20, 30 μM) después de H2O2- (200 μM) e inducida por UVB (40 mJ/cm²). ) daño. Tratamiento con H2O2 o UVB solo

disminuyó significativamente (40 por ciento) la viabilidad de las células HS68. Sin embargo, el tratamiento con cistanche evitó la muerte celular de manera dependiente de la concentración (Figura 1E, 1F). Una mayor concentración de cistanche (30 μM) alivió notablemente la citotoxicidad inducida por H2O2- y UVB. Por lo tanto, la dosis de 30 μM de cistanche se utilizó en estudios in vitro posteriores para evaluar su efecto protector.

Efectos en células HS68.



la cistanche atenúa la senescencia de las células HS68 inducida por H2O2-en lugar de la apoptosis

Para determinar si la disminución de la viabilidad celular se debió a la muerte celular o a la inhibición del crecimiento, verificamos la expresión de varios marcadores de apoptosis y supervivencia mediante transferencia Western en células HS68 expuestas a diferentes dosis de H2O2 (50, 100, 200, 300, 400 μM) durante 24 h. Encontramos una expresión significativamente menor de marcadores de supervivencia, como p-Akt, y una mayor expresión de

apoptosis-related markers, such as cleaved-caspase 3 and cytochrome c, at concentrations >H2O2 200 μM (Figura 2A). Además, realizamos citometría de flujo para evaluar las células apoptóticas mediante tinción con anexina V y PI y observamos resultados similares. En conjunto, el H2O2 200 μM no provocó la apoptosis de las células HS68 (Figura 2B). A continuación, detectamos la expresión de varios
marcadores de senescencia, como p16, p21 y SA- -gal, para determinar las células senescentes. Nuestros resultados mostraron que el tratamiento con cistanche disminuyó significativamente los niveles de proteína p16 y p21 inducidos por H2O2-, así como el número de células SA- -gal positivas (Figura 2C, 2D).



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Figura 1. La cistanche inhibe la citotoxicidad inducida por UVB/H2O2-en fibroblastos dérmicos humanos HS68. (A) La estructura química de la cistanche. (B) Viabilidad celular de células HS68 tratadas con diferentes concentraciones de cistanche (10, 20, 30, 40, 50 µM ) durante 24 horas. (C y D) Viabilidad celular de células HS68 expuestas a diferentes dosis de H2O2 (100, 150, 200, 250, 300 µM) o irradiadas con UVB (25, 30, 40, 50, 60 J/cm2) durante 24 h. (E y F) Viabilidad celular de células HS68 expuestas a H2O2 (200 µM) o irradiadas con UVB (40 J/cm2) durante 1 h y luego tratadas con cistanche (10, 20, 30 µM) durante 23 h. Los efectos citoprotectores de la cistanche se determinaron mediante el ensayo MTT. A las células de control se les asignó un 100 por ciento de viabilidad. Los valores se muestran como media ± SE. Se muestra la cuantificación de los resultados (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 frente a células de control no tratadas; ##P < 0,01, ###P < 0,001 frente a células tratadas con H2O2 o UVB.

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la cistanche atenúa la producción de ROS intracelular/mitocondrial inducida por UVB/H2O2-y el desequilibrio de MMP en células HS68
El estrés oxidativo juega un papel clave en diversas enfermedades y puede ser inducido por factores endógenos o exógenos. Aquí, usamos H2O2 como factor endógeno y UVB como factor exógeno para inducir el daño oxidativo y luego investigamos las actividades de eliminación de ROS de la cistanche. Para identificar las fuentes de ROS, se utilizaron MitoSOX y DCFH-DA para determinar las ROS intracelulares y mitocondriales. Los resultados de la tinción mostraron que el tratamiento con H2O2 y UVB indujo la acumulación de ROS, mientras que el tratamiento con cistanche redujo la generación de ROS (Figura 3A, 3B). Además, como la MMP desequilibrada puede iniciar la muerte celular, usamos JC-1 para determinar los cambios en la MMP. Las mitocondrias normales emitían fluorescencia roja (dímeros JC-1) ​​mientras que las mitocondrias deterioradas emitían fluorescencia verde (monómeros JC-1). La exposición a UVB y H2O2 indujo altos niveles de fluorescencia verde. En particular, el tratamiento con cistanche cambió la fluorescencia verde a roja, lo que indica la reactivación de las funciones mitocondriales (Figura 3C).


la cistanche atenúa el deterioro de la vía de síntesis de colágeno TGF/Smad inducido por H2O2-en células HS68

La señalización de TGF/Smad favorece la formación de colágeno en los fibroblastos dérmicos de la piel humana [25–27]. Por lo tanto, investigamos el papel de la cistanche en la síntesis de colágeno a través de la vía TGF/Smad en células HS68 expuestas a H2O2. Los resultados de la transferencia Western indicaron que la cistanche mejoró significativamente la señalización de TGF/Smad, así como la síntesis de colágeno en células HS68 expuestas a H2O2-(Figura 4A). Además, la desorganización del colágeno tipo I y III es una de las características típicas de los fibroblastos cutáneos envejecidos [28]. Dado que la familia MMP ha estado implicada en el catabolismo del colágeno [29], a continuación confirmamos la influencia de la cistanche en la activación de MMP-1. Descubrimos que la cistanche previno la degradación del colágeno en las células HS68 al suprimir el nivel de MMP mejorado con H2O2--1 (Figura 4A).

Además, identificamos el mecanismo molecular subcelular que subyace a esta acción protectora al comparar las células HS68 tratadas con H2O2 solo o cotratadas con cistanche mediante inmunotransferencia y tinción de inmunofluorescencia. el tratamiento con cistanche mejoró la acumulación nuclear de p-smad2/3 y Smad4 que se vio interrumpida por la exposición a H2O2 en células HS68

(Figura 4B, 4C). Estos hallazgos indicaron que la cistanche puede mejorar la fragmentación de colágeno inducida por H2O2-activando la vía TGF/Smad en las células HS68.


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Figura 2. La cistanche atenúa la senescencia de las células HS68 inducida por H2O2-en lugar de la apoptosis. (A) Las células HS68 se expusieron a diferentes dosis de H2O2 (50, 100, 200, 300, 400 µM) durante 24 h. La apoptosis y los marcadores relacionados con la supervivencia se detectaron mediante western blot. (B) Las células teñidas con anexina V y PI se analizaron mediante citometría de flujo para identificar las células apoptóticas bajo exposición a H2O2. (C) Las células HS68 fueron
expuesto a H2O2 (200 µM) durante 1 h y luego tratado con cistanche (30 µM) durante 23 h. Los marcadores de envejecimiento como p16 y p21 se detectaron mediante western blot. Se usó GAPDH como control de carga. (D) Las células senescentes se detectaron utilizando un kit de detección de galactosidasa asociada a la senescencia (SA{{10}} gal). Las células SA- -gal positivas se muestran en color verde. (C) Los valores se muestran como media ± SE. Se muestra la cuantificación de los resultados (n=3) **P < 0,01, ***P < 0,001 frente a células de control no tratadas; ##P < 0,01, ###P < 0,001 frente a células tratadas con H2O2-.


el tratamiento con cistanche reduce la expresión regulada al alza inducida por H2O2-de hsa-miR-4535, predicha para apuntar a Smad4
El análisis de la matriz de miARN de las células HS68 tratadas con cistanche reveló que la expresión de hsa-miR-4535 se redujo en el grupo tratado con cistanche en comparación con el grupo de control (Figura 5A). Además, mediante el uso de bases de datos de miARN, como miRDB y TargetScanHuman, predijimos un sitio de destino putativo conservado para hsa-miR-4535 en Smad4-3′-UTR (Figura 5B). Después de confirmar el sitio de destino, se transfectaron construcciones de indicadores Smad4-3′-UTR-WT y Smad4-3′-UTR MT en células HS68 para verificar la unión directa de hsa-miR-4535 a Smad4-
3′-UTR. Observamos una reducción del 50 por ciento en las actividades de luciferasa entre los grupos Smad4-3'-UTR de tipo salvaje y mutantes seguidos de transfecciones mímicas de hsa-miR-4535 (Figura 5C). Luego evaluamos los efectos de H2O2 (100,200 μM) en la regulación de hsa-miR-4535 y Smad 4 en células HS68, y descubrimos que H2O2 mejoraba hsa-miR-4535 de forma dependiente de la dosis y suprimía el ARN de Smad4 expresión (Figura 6A, 6B). Además, esta tendencia en la expresión de hsa-miR-4535 y Smad4 se revirtió después del tratamiento con cistanche, lo que indica que la regulación de la señalización de Smad puede estar involucrada en el alivio mediado por cistanche del daño celular HS68 inducido por H2O2-( Figura 6C, 6D). En conjunto, estos resultados sugirieron que la cistanche atenúa el deterioro de la vía TGF/Smad inducido por H2O2-al regular a la baja la expresión de hsa-miR-4535 en los fibroblastos dérmicos de la piel humana.


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Figura 4. La cistanche atenúa el deterioro de la vía de síntesis de colágeno TGF/Smad inducido por H2O2-en células HS68. (A) Las células HS68 se expusieron a H2O2 (200 µM) durante 1 hy luego se trataron con cistanche (30 µM) durante 23 h. La expresión de proteínas de los componentes de la vía relacionados con la síntesis de colágeno (TGF, p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1) y la proteína relacionada con la degradación de colágeno (MMP-1) se detectaron mediante transferencia Western. (B) La expresión proteica de p-smad2/3, Smad4 en las fracciones nuclear y citosólica se detectó mediante transferencia Western. Se usó GAPDH como control de carga. Los valores se muestran como media ± SE. Se muestra la cuantificación de los resultados (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs. células de control no tratadas; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 frente a células tratadas con H2O2-. (C) Anti-p-Smad2/3, anticuerpo Smad4 y anticuerpo secundario conjugado con FITC/PE se usaron para detectar la expresión de p-Smad2/3 (verde), Smad4 (rojo). DAPI indicó la ubicación del núcleo (azul). Las imágenes fueron capturadas usando un microscopio de fluorescencia (200x).


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La modulación de Smad4 por hsa-miR-4535 está implicada en la síntesis de colágeno en fibroblastos dérmicos de piel humana expuestos a H2O2-

Para determinar aún más los mecanismos por los cuales hsa-miR-4535 ejerce su efecto sobre la expresión de Smad4 y su señalización posterior en células HS68, transfectamos células HS68 con imitadores o inhibidores de hsa-miR-4535 y medimos Smad4 y su expresión de colágeno corriente abajo. Los resultados demostraron que la inhibición de hsa-miR-4535 por el inhibidor de hsa-miR-4535 revirtió significativamente la regulación a la baja del ARNm de Smad4 y la expresión de proteínas en células HS68 tratadas con H2O2- (Figura 7A–7C) . Además, la supresión de hsa-miR-4535 restauró parcialmente el deterioro de COL1A1 y COL3A1 inducido por H2O2-en células HS68 tratadas con H2O2-(Figura 7C).

Por el contrario, la expresión mejorada de hsa-miR-4535 como resultado de la transfección mímica de hsa-miR-4535 bloqueó la regulación positiva de Smad4 mediada por cistanche en células HS68 expuestas a H2O2 (Figura 7D–7F). La sobreexpresión de tiene miR-4535 redujo parcialmente los niveles de COL1A1 y COL3A1 inducidos por cistanche (Figura 7F). La sobreexpresión de hsa-miR-4535 (Figura 8A–8C) o la inhibición de Smad4 por siRNA (Figura 8D, 8E) resultó en una reducción de la síntesis de colágeno bajo el tratamiento con cistanche después de la exposición al H2O2. Sorprendentemente, encontramos que tanto Smad4 directo

el silenciamiento y los tratamientos con hsa-miR-4535 imitan la síntesis de colágeno inducida por cistanche invertida en células HS68 tratadas con H2O2-. En conjunto, llegamos a la conclusión de que la cistanche regula la síntesis de colágeno, potencialmente a través de la disminución del nivel de hsa-miR-4535 para mejorar la señalización de Smad4 en las células HS68 expuestas a H2O2.


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Figura 5. Hsa-miR-4535 apunta a Smad4. (A) La expresión de microARN en células HS68 tratadas con cistanche se evaluó mediante micromatrices. (B) Diagrama de Venn que representa candidatos potenciales de ARNm que pueden ser regulados por hsa-miR-4535 según las bases de datos miRDB y TargetScanHuman. Análisis de secuencia de sitios de unión a miARN putativos en ARNm de Smad4-3′-UTR para hsa-miR-4535. Las coincidencias se indican mediante líneas rectas. (C) Las células HS68 se cotransfectaron con Smad4-3′-UTR-WT (tipo salvaje; 0.5 µg/mL) más hsa-miR-4535 mimic (2{ {25}} nM) o Smad4-3′-UTR MT (mutante; 0.5 µg/mL) más hsa-miR-4535 imitador (20 nM) durante 24 h. Se determinó la actividad de luciferasa y se normalizó a la de Renilla. Se muestra la cuantificación de los resultados (n=3); ***P < 0,001, frente al grupo mimético Smad4-3′-UTR-MT más hsa-miR-4535. G1=control, G2=cistanche (10 μM), G3=cistanche (30 μM)



Cistanche mejora la vía de síntesis de colágeno TGF/Smad y atenúa la senescencia dérmica, así como la inhibición de la expresión de hsa-miR-4535 en células HS68 expuestas a UVBDado que la luz ultravioleta desempeña un papel importante en varios trastornos de la dermis de la piel, como la inflamación, la inmunosupresión, el cáncer y el envejecimiento prematuro [30–32], examinamos el efecto de la cistanche en la señalización relacionada con la síntesis de colágeno en las células HS68 expuestas a la radiación UVB. Los niveles de proteína de los componentes de la vía TGF/Smad y COL1A1 y COL3A1 corriente abajo se redujeron en las células HS68 tratadas con UVB, pero aumentaron de manera efectiva después del tratamiento con cistanche (Figura 9A).

Los resultados de la transferencia Western confirmaron que la cistanche suprimía la expresión de MMP-1 potenciada por UVB en células HS68 (Figura 9A). Además, aclaramos el efecto antienvejecimiento de la cistanche en células HS68 sujetas a exposición a UVB al demostrar que la cistanche reduce la elevación inducida por UVB de los niveles de p16 y p21 (Figura 9A). Para evaluar si la cistanche podría atenuar la descomposición del colágeno inducida por UVB a través de la inhibición de hsa-miR-4535 dirigido a Smad4, investigamos los niveles de hsa-miR-4535 y Smad4 en células tratadas conjuntamente con UVB y cistanche mediante qPCR. Descubrimos que la expresión de hsa-miR-4535 estaba significativamente aumentada en células expuestas a UVB, pero disminuyó después del tratamiento con cistanche. Por el contrario, la expresión de Smad4 fue suprimida por la exposición a UVB y esta supresión fue marcadamente revertida por el tratamiento con cistanche (Figura 9B, 9C). En conjunto, nuestros hallazgos sugirieron que la cistanche ejerce efectos similares a los del H2O2 para restaurar la disminución de la formación de colágeno inducida por UVB al reprimir los niveles de hsa-miR-4535 para promover la señalización de Smad4 en las células HS68.



La aplicación tópica de cistanche atenúa la hiperplasia de la piel inducida por UVB y la degradación del colágeno, así como también mejora la señalización de TGF/Smad en elpiel dorsal de ratones desnudos C57BL6/JPara dilucidar el efecto fotoprotector de la cistanche sobre las lesiones cutáneas inducidas por UVB in vivo, evaluamos el nivel de microARN-4535, Smad4 y alteraciones del tejido cutáneo. La Figura 10A muestra el esquema para el diseño experimental y la línea de tiempo para la aplicación tópica de cistanche después de la irradiación UVB en la piel dorsal de ratones desnudos C57BL6/J. Se observó la formación de arrugas en las secciones dorsales de la piel de ratones C57BL/6J en el grupo expuesto a UVB. La aplicación tópica de cistanche redujo significativamente la formación de arrugas, lo que indica el aumento del contenido de colágeno mediado por cistanche para mantener la integridad de la piel (Figura 10B). Además, el análisis histológico de la capa dérmica mostró que el contenido y la densidad de colágeno en la pielfueron significativamente menores en el grupo irradiado con UVB en comparación con el grupo de control del vehículo. Sin embargo, la aplicación tópica de cistanche (12 mg/kg y 24 mg/kg) promovió un aumento del contenido y la densidad de colágeno de una manera dependiente de la dosis en comparación con los ratones sometidos a radiación UVB (Figura 11). La morfología de la piel se evaluó mediante tinción H&E. UVBla exposición aumentó el grosor epidérmico en comparación con el grupo de control del vehículo. Sin embargo, la aplicación tópica de cistanche alivió significativamente la hiperplasia epidérmica inducida por UVB (Figura 11). Además, la tinción inmunohistoquímica de -gal indicó la aplicación de cistanche redujo la alta expresión de -gal en la piel irradiada con UVB (Figura 11). Para determinar si la cistanche puede mejorar la pérdida de fibra de colágeno inducida por UVB a través de la regulación negativa de hsa-miR-4535 para mejorar Smad4 in vivo, se evaluó su expresión de ARN en la muestra de piel dorsal extirpada mediante qRT-PCR. La expresión de hsa-miR-4535 se elevó en la piel irradiada con UVB, pero se suprimió significativamente en la piel tratada con cistanche tanto en dosis bajas como altas. Además, los bajos niveles de expresión de ARN de Smad4 en la piel irradiada con UVB se restauraron mediante el tratamiento con cistanche (Figura 12A, 12B)


Además, la aplicación de cistanche rescató la expresión de las proteínas TGF, p smad2/3 y Smad4 en tejido cutáneo afectado por UVB (Figura 12C). Nuestros hallazgos indicaron que la cistanche podría potencialmente proteger la piel de los daños inducidos por los rayos UVB al inhibir hsamiR-4535 para mejorar la expresión de Smad4 para la activación de P-smad2/3 para finalmente promover la síntesis de colágeno (Figura 13).


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Figura 9. Cistanche mejora la vía de síntesis de colágeno TGF/Smad y atenúa la senescencia dérmica, así como la inhibición de la expresión de hsa-miR-4535 en células HS68 expuestas a UVB. Las células HS68 se expusieron a UVB (40 mJ/cm2) y luego se trataron con cistanche (30 µM) durante 23 h. (A) Expresión de proteínas de los componentes de la vía relacionados con la síntesis de colágeno (TGF, p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1), proteína relacionada con la degradación de colágeno (MMP{{20}}) y senescencia. los marcadores asociados (p16 y p21) fueron detectados por western blot. Se usó GAPDH como control de carga. (B y C) La expresión de ARN de hsa-miR-4535 y Smad4 se detectó mediante qRT-PCR. Los valores se muestran como media ± SE. Se muestra la cuantificación de los resultados (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, frente a células de control no tratadas; #P < 0,05, ##P < 0,01 frente a células expuestas a UVB.

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