Efectos protectores de la nueva decocción de Wenshen Shengjing sobre el deterioro inducido por ciclosporina de la síntesis de testosterona y la apoptosis espermatogénica
Mar 03, 2022
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XIAOYAN PAN, XIYAN WANG, XUENAN WANG, WANSHENG ZHANG4, ZHANXUAN SUN1, XUAN XUAN LIANG, XUE ZHANG, WENJUN LI y ZHIXIN LI
Resumen
El presente estudio tuvo como objetivo investigar los posibles efectos protectores de la nueva decocción Wenshen Shengjing (nueva WSSJD; que incluye Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, Cynomorium solarium,Cistanche desertica, Radix Astragali, Epimedium brevicornum y Angelica Sinensis) sobre el deterioro inducido por la ciclosporina de la síntesis de testosterona y la apoptosis espermatogénica en ratones. Un total de 90 ratones Kunming machos adultos se dividieron en los siguientes 6 grupos: Control (sin intervención), dimetilsulfóxido (DMSO; recibió solo DMSO), ciclosporina A (CSA), citrato de clomifeno (CC; CsA más CC, 15 mg/kg /día), WSSJD (CsA más WSSJD, fármaco bruto 12 g/kg/día) y WSSJD nuevo (CsA más WSSJD nuevo, fármaco bruto 12 g/kg/día). Todos los ratones fueron tratados durante 30 días mediante sonda oral. Posteriormente, los testículos se fijaron y tiñeron con hematoxilina y eosina para evaluar el desarrollo del epitelio seminífero. Se utilizaron técnicas inmunohistoquímicas para detectar la expresión del receptor de la hormona luteinizante (LHR) y la escisión de la cadena lateral P450 (P450scc) en células testiculares de Leydig. Además, la apoptosis de las células espermatogénicas en los testículos se detectó mediante un ensayo de marcaje de extremos de muescas dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal, y se utilizó citometría de flujo para analizar la tasa de supervivencia y la apoptosis temprana de los espermatozoides en el epidídimo. En comparación con los grupos CsA y CC, la nueva administración de WSSJD aumentó significativamente los niveles de testosterona sérica y las expresiones de LHR y P450scc en células testiculares de Leydig (P<0.05), while="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" seminiferous="" tubules="" and="" early="" apoptosis="" of="" mature="" sperm="" were="" significantly="" decreased=""><0.05). these="" results="" suggest="" that="" new="" wssjd="" may="" ameliorate="" csa-induced="" spermatogenic="" damage="" in="" male="" mice="" by="" enhancing="" testosterone="" synthesis="" and="" the="" secretion="" of="" testicular="" leydig="" cells,="" and="" by="" reducing="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="">
Introducción
La ciclosporina A (CSA) es un agente inmunosupresor de uso común que se dirige específicamente a las células T e inhibe la secreción de interleucina-2, y aumenta drásticamente la tasa de éxito de los trasplantes de hígado, riñón y córnea, así como la tasa de supervivencia de destinatarios (1-3). Sin embargo, la inmunosupresión inducida por el uso prolongado de CsA aumenta significativamente el riesgo de enfermedades cardiovasculares, infecciones y tumores malignos (4). Eid et al (5) informaron que la concentración y la motilidad de los espermatozoides se correlacionaron negativamente con la concentración de CsA en suero en receptores masculinos de trasplante de riñón, lo que sugiere que la CsA puede inducir una disfunción del sistema reproductivo en receptores masculinos. Además, se ha documentado que la CsA puede ser responsable de la alteración de la espermatogénesis y del daño al sistema reproductivo masculino (6).
Estudios previos han demostrado que la CsA disminuyó los niveles de testosterona sérica al influir en la biosíntesis y secreción de testosterona en los testículos. He et al (7) observaron que las ratas tratadas con 40 mg/kg/día de CsA exhibieron niveles significativamente más altos de hormona luteinizante (LH) y niveles significativamente más bajos de testosterona en el suero, lo que condujo a un deterioro del desarrollo testicular. Ali et al (8) informaron que el tratamiento con CsA disminuyó la expresión del receptor de LH (LHR) en la membrana de las células de Leydig, lo que posteriormente disminuyó la síntesis de testosterona mediada por LH y la secreción de las células de Leydig. Otro estudio realizado por Seethalakshmi et al (9) informó que la CsA disminuyó los niveles de testosterona al inhibir la actividad de la 17 alfa-hidroxilasa de manera no cooperativa y la actividad de la 17 -hidroxiesteroide deshidrogenasa de manera competitiva durante la biosíntesis de testosterona, y el sitio principal para la inhibición de la CsA fue la adenosina cíclica interrumpida estimulación con monofosfato. Además, este informe indicó que la disminución de la secreción de testosterona inducida por CsA en las células de Leydig influyó directamente en el desarrollo del sistema reproductivo masculino y el mantenimiento de la capacidad reproductiva. Seethalakshmi et al (10) inyectaron testosterona exógena en ratas tratadas con CsA para aumentar los niveles de testosterona endógena. Se observó que las dosis elevadas de testosterona exógena restauraron significativamente el peso de los órganos reproductores, los niveles séricos de la hormona estimulante del folículo (FSH) y aumentaron el recuento de células germinales, lo que indica que el deterioro de la espermatogénesis inducido por CsA puede prevenirse parcialmente con la testosterona exógena. administración de testosterona (10). Sin embargo, se encontró que la testosterona exógena era insuficiente para reparar el tejido testicular dañado, ya que la secreción de testosterona y la espermatogénesis todavía estaban influenciadas por la CsA, y se observaron altas tasas de apoptosis en el esperma y las células espermatogénicas (10).
Wenshen Shengjing Decoction (WSSJD) consta de 15 hierbas medicinales, principalmente Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, Cynomorium solarium,Cistanche desertica, Radix Astragali, Epimedium brevicorneum y Angelica Sinensis (11). Se ha demostrado que WSSJD alivia la apoptosis espermatogénica inducida por ciclofosfamida (11). Para mejorar aún más el efecto terapéutico de WSSJD, el presente estudio desarrolló un nuevo WSSJD basado en el mecanismo de daño del tejido testicular inducido por CsA ajustando la dosis de los componentes de WSSJD. Estudios farmacológicos modernos han demostrado que el terciopelo de asta en WSSJD puede funcionar como una hormona sexual (12); Radix Astragali puede mejorar la proliferación y el suministro de nutrientes de las células testiculares de Sertoli (13), y Panax ginseng puede disminuir los niveles de hiperóxido testicular e inhibir la apoptosis espermatogénica (14). Los medicamentos mencionados anteriormente también pueden aumentar la función renal y estimular el desarrollo de células espermatogénicas (12-14). Se ha demostrado que el citrato de clomifeno (CC) ejerce un efecto terapéutico sobre la infertilidad masculina en estudios clínicos previos (15,16). Además, CC se ha asociado con mejores parámetros de testosterona y semen, y los mecanismos protectores de CC pueden ser similares a los de WSSJD (15,16). Además, en un estudio realizado por Wang et al (17), se utilizó CC como control de tratamiento para investigar el efecto de la medicina china Shengjing en las alteraciones de la espermatogénesis en ratones. En base a esto, CC se utilizó como control positivo en el presente estudio.
En el presente estudio, se investigó el mecanismo subyacente al efecto protector del nuevo WSSJD en tejidos testiculares para determinar la eficacia terapéutica del medicamento modificado. Esclarecer el mecanismo de protección puede proporcionar una base para el uso de nuevos WSSJD para mejorar el daño espermatogénico inducido por CsA.
Efectos de Cistanche deserticola: Prevenirdaño espermatogénico
materiales y métodos
animales El Changchun Institute of Biological Products Co., Ltd. (Changchun, China) proporcionó un total de 90 ratones Kunming machos (8-semanas de edad; 35-40 g). El presente estudio se realizó con la aprobación del Comité de Ética de la Universidad Médica de Jilin (Changchun, China). Los ratones se alojaron a 21±3˚C y 55-65 por ciento de humedad relativa bajo un ciclo de luz oscura de 12 h. A los ratones se les dio libre acceso a una dieta estándar para ratones de laboratorio y agua esterilizada.
Preparación de WSSJD. Los 15 componentes de la medicina china de WSSJD, incluidos Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, Cynomorium solarium,Cistanche desertica, Radix Astragali, Epimedium brevicornum y Angelica Sinensis (11), se adquirieron de Tongrentang (Beijing, China). Estos materiales fueron decocidos según el método tradicional de decocción medicinal china (18). En resumen, se pesaron los ingredientes de acuerdo con la receta y se agregó un total de 250 ml de agua destilada para sumergir las hierbas. Las hierbas se remojaron durante 30 min y posteriormente se calentaron. Primero se hirvieron las hierbas durante 10 min y luego se redujo el fuego a fuego lento durante 20 min. Después de 30 min de calentamiento, la decocción líquida se separó de las hierbas, que se sometieron a una decocción adicional con 200 ml de agua destilada a 80 °C durante otros 30 min. Este proceso se repitió y el volumen final del líquido de decocción se filtró a través de 4-5 capas de gasa. El líquido también se exprimió de las hierbas en la decocción filtrada. Posteriormente, la decocción se calentó a 80 ºC en baño maría durante 6‑7 h hasta alcanzar una concentración de 2 g de fármaco crudo/ml, y la decocción se almacenó a 4 ºC antes de su uso. El nuevo WSSJD se preparó en base a la formulación de WSSJD con pequeños ajustes en las dosis de Panax ginseng, Cynomorium solarium, Radix Astragali y Epimedium brevicornum. El método de decocción fue el mismo que el de WSSJD. nuevo WSSJD compuesto por lo siguiente: Panax ginseng, 6 g; Cynomorium solarium, 9 g; Radix Astragali, 12 g; Epimedium brevicornum, 6 g; Cornu Cervi Nippon Parvum, 1 g;Cistanche desertica, 9 gramos; Angélica Sinensis, 6 g; Semilla de Milkvetch de tallo plano, 9 g; Rhizoma Dioscoreae, 15 g; Rizoma de Atractylodes de cabeza grande, 6 g; Ligusticum wallichii, 3 g; Radix Paeoniae Alba, 6 g; canela casia, 1 g; Costustoot, 1,5 g, y Fructus Foeniculi, 3 g.
Las concentraciones de extractos de fármaco crudo se determinaron de la siguiente manera: Peso del material crudo/volumen final. Este método de cálculo es muy utilizado en el estudio de la medicina tradicional china (19-21).Administración de medicamentos. Los ratones se dividieron al azar en 6 grupos (15 ratones por grupo) y se les administró medicamento por vía intragástrica. Los grupos fueron los siguientes: Control (solución salina normal); dimetilsulfóxido (DMSO); CsA; CC; WSSJD; y nuevo WSSJD. A los ratones de los grupos CsA, CC, WSSJD y WSSJD nuevos se les inyectaron por vía intraperitoneal (ip) 15 mg/kg/día de CsA (Shanxi Powerdone Pharmaceutics Co., Ltd., Datong, China) durante 30 días, como se describió anteriormente (8). ). Los ratones en los grupos de control y DMSO se sometieron a una inyección ip diaria con un volumen igual de solución salina normal o solvente DMSO, respectivamente, durante el período experimental de 30-días. La concentración de DMSO diluido en solución salina normal fue del 3,25 por ciento (v/v). Al grupo de CC se le administró 21,6 mg/kg/día de CC (GKH Pharmaceutical, Ltd., Guangzhou, China) como se describió anteriormente (13), que también se diluyó en 3,25 por ciento (v/v) de DMSO (pH{{14} }.2). A los ratones de los grupos WSSJD y WSSJD nuevo se les administraron 12 g de fármaco bruto/kg/día de WSSJD y WSSJD nuevo, respectivamente.Tinción con hematoxilina y eosina (H&E). Los testículos de los ratones se recolectaron y se fijaron inmediatamente en paraformaldehído al 4 % (pH=7.2) a temperatura ambiente durante 24 h, seguido de deshidratación con etanol, tratamiento con xileno para eliminar el etanol, incrustación de cera y corte. Se obtuvieron secciones histológicas (5 µm) utilizando un micrótomo rotatorio. Estos se fijaron a portaobjetos de vidrio para la tinción con H&E. Las secciones testiculares se observaron mediante microscopía histopatológica de realce para evaluar el desarrollo de los túbulos seminíferos y obtener datos histométricos. El desarrollo de los túbulos seminíferos se evaluó mediante el sistema de puntuación de Johnsen (22).
ELISA. El día 30 de tratamiento, los ratones se anestesiaron con hidrato de cloral al 10 por ciento (Shanghai Guoyao Chemical Reagent Co., Ltd) a 0,004 ml/g de peso corporal ip antes de la eutanasia con CO2. Se recogió sangre del tronco y el suero se separó y almacenó a -20˚C. Brevemente, la sangre se recogió en tubos de 1,5 ml y se almacenó a 4 °C durante la noche. A continuación, el tubo se centrifugó a 1300 xga 4 °C durante 6 min y se recogió el suero. Se utilizaron kits ELISA (Shanghai Elisa Biotech Co., Ltd., Shanghai, China) para determinar los contenidos séricos de testosterona (cat. no. EIA-2380) y LH (cat. no. EIA-2385 ) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La densidad óptica (DO) se determinó utilizando un lector de microplacas Modelo 680 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU.), y los niveles de testosterona y LH se determinaron con base en la curva estándar.
Inmunohistoquímica. Los tejidos testiculares se fijaron en formaldehído al 4 por ciento a temperatura ambiente durante 24 h y se incluyeron en parafina. Las secciones de parafina se cortaron en secciones de 5 µm y posteriormente se desparafinaron. La recuperación del antígeno se logró incubando las secciones en 0.0tampón de citrato 1 M (pH=6.0) a 95-98 ˚C durante 5 min. Posteriormente, las secciones se bloquearon con albúmina de suero bovino al 5 % (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Alemania; A3675) a temperatura ambiente durante 1 hora. Después del bloqueo, las secciones se incubaron con anticuerpos policlonales de conejo contra LHR (n.º de cat. L6792; Sigma-Aldrich; Merck KGaA; 1:200) o la escisión de la cadena lateral de P450 (P450scc; n.º de cat. ab75497; Abcam, Cambridge, Reino Unido). ; 1:200) a 4˚C durante la noche en la oscuridad. Se utilizó el método del complejo estreptavidina-biotina (SABC) para detectar la expresión de LHR y P450scc utilizando un kit SABC (SA2010; Boster Biological Technology, Pleasanton, CA, EE. UU.), según el protocolo del fabricante. Para los tejidos aislados de ratones de control negativo, el anticuerpo primario se reemplazó con PBS. Las células de Leydig con tinción amarilla o marrón en la membrana o el plasma se consideraron células positivas para LHR. Se obtuvieron cinco portaobjetos de cada muestra y se seleccionaron al azar cinco campos en las áreas de tejido de Leydig y se evaluaron bajo un microscopio de fluorescencia (aumento, x400). La DO media de células positivas en las áreas de tejido de Leydig se obtuvo utilizando el software Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, EE. UU.). Las expresiones de LHR y P450scc fueron proporcionales a los valores de OD, con valores de OD más altos que representan expresiones de proteínas más altas.
Ensayo de marcado de extremo de muesca de dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) (TUNEL). Los testículos de los ratones se diseccionaron, se incluyeron en cera y se seccionaron. A continuación, las secciones (5- µm de grosor) se tiñeron con el kit de ensayo TUNEL (MK1024; Boster Biological Technology), según el protocolo del fabricante. En resumen, los tejidos testiculares del control (solución salina normal), DMSO, CsA, CC, WSSJD y los nuevos grupos WSSJD se tiñeron usando una dilución 1:100 de anticuerpo de digoxina marcado con biotina durante 30 minutos a 37 °C. Se usó tejido epitelial intersticial de rata teñido (provisto en el kit) como control positivo, y muestras incubadas con PBS en lugar de anticuerpo de digoxina marcado con biotina se usaron como control negativo. La frecuencia de células positivas para TUNEL que presentaban tinción nuclear verde se evaluó utilizando un microscopio confocal de barrido láser. Se evaluaron un total de 10 campos aleatorios con gran aumento (x400) y se contaron las células positivas. Se calculó el número medio de células positivas por campo.
Tinción con yoduro de propidio (PI) o isotiocianato de fluoresceína con anexina V (FITC) y análisis de citometría de flujo. La cola del epidídimo se recogió el siguiente sacrificio y la epidermis se cortó con una cuchilla para liberar el esperma del epidídimo en 2 ml de PBS a 37ºC para obtener suspensiones de epidídimo. Posteriormente, las suspensiones se incubaron a 37 °C durante 10 min para permitir que los espermatozoides salieran nadando. Se desecharon los agregados de esperma y las muestras de esperma restantes se aislaron y resuspendieron en PBS para dar una concentración de 106 células/ml. La apoptosis de los espermatozoides se analizó utilizando un kit de detección de apoptosis de Annexin V-FITC (Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, China), de acuerdo con el protocolo del fabricante. En resumen, 1 ml de suspensión de esperma se tiñó con 10 µl de PI o con 500 µl de tampón de unión y 5 µl de anexina V-FITC en la oscuridad durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se analizaron inmediatamente mediante citometría de flujo Epics XL (Beckman Coulter, Inc.) y utilizando un sistema TetraONE™ (6915050; Beckman Coulter, Inc.). Las células en las primeras etapas de la apoptosis se identificaron mediante tinción positiva para anexina V y las células necróticas mediante tinción positiva para PI.
Análisis estadístico. El análisis de datos se realizó con el software SPSS 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EE. UU.) y se expresó como la media más o ± la desviación estándar, según se indica. Se evaluó la significación de las diferencias entre los grupos mediante un análisis de varianza de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey. PAGS<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Cistanche desertica
Resultados
Efectos de la nueva WSSJD en el desarrollo de los túbulos seminíferos testiculares. Para investigar el posible efecto protector del nuevo WSSJD en el desarrollo de túbulos seminíferos testiculares de ratón, se comparó la morfología de los testículos de ratón teñidos con H&E bajo microscopía óptica. Los túbulos seminíferos de los ratones de los grupos CsA y CC exhibieron una contracción de la franja del túbulo, diámetros de túbulos disminuidos y capas reducidas de epitelio seminífero testicular en comparación con el control. Además, las células espermatogénicas exhibieron una disposición desordenada, el número de células espermatogénicas se redujo y se observaron pocos espermatozoides maduros en la luz (Fig. 1). En ratones de los grupos DMSO, WSSJD y WSSJD nuevos, se observaron más capas de epitelio seminífero testicular y la franja de túbulos seminíferos se integró sin encogerse ni colapsarse (Fig. 1). Las puntuaciones de Johnsen no difirieron significativamente entre el grupo DMSO y los grupos de control, o entre los grupos CC y DMSO. Sin embargo, la puntuación de Johnsen disminuyó significativamente en el grupo CsA y el grupo WSSJD en comparación con el grupo de control, y las puntuaciones de los grupos WSSJD y WSSJD nuevo aumentaron significativamente en comparación con el grupo CC o CsA (P<0.05; table="" i).="" these="" results="" indicated="" that="" new="" wssjd="" and="" wssjd="" promoted="" the="" development="" of="" seminiferous="" epithelium="" following="" csa="">
Efectos del nuevo WSSJD sobre la testosterona sérica y la LH. Posteriormente se midieron los niveles de testosterona y LH en el suero. Los niveles séricos de testosterona y LH no se vieron afectados después de la administración de DMSO. Por el contrario, la testosterona sérica se reguló significativamente a la baja y la LH se reguló significativamente al alza en ratones tratados con CsA, en relación con los controles (P<0.05; fig.="" 2),="" and="" new="" wssjd="" administration="" significantly="" restored="" testosterone="" to="" near="" control="" levels=""><0.05; fig.="" 2).="" for="" serum="" lh,="" the="" protective="" effects="" of="" wssjd="" were="" similar="" to="" that="" of="" cc;="" however,="" new="" wssjd="" decreased="" serum="" testosterone="" to="" a="" significantly="" lower="" level="" than="" that="" observed="" with="" cc="" and="" wssjd=""><0.05; fig.="" 2),="" suggesting="" a="" superior="" protective="" effect="" of="" new="" wssjd="" over="" cc="" or="">
Efectos del nuevo WSSJD sobre las expresiones de LHR y P450scc. Las expresiones de P450scc y LHR se evaluaron en células testiculares de Leydig mediante inmunohistoquímica (Figs. 3 y 4). En el grupo de control, LHR se expresó en las membranas externas de las células de Leydig entre los túbulos seminíferos (Fig. 3A), y P450cc se expresó en el citoplasma de las células de Leydig testiculares (Fig. 4A). El tratamiento con DMSO no tuvo un efecto significativo sobre las expresiones de LHR y P450scc. Por el contrario, el tratamiento con CsA disminuyó significativamente las expresiones de LHR y P450scc en comparación con los ratones de control (P<0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" turn,="" the="" expressions="" of="" lhr="" and="" p450scc="" were="" significantly="" increased="" by="" treatment="" with="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" compared="" with="" the="" csa="" group=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" addition,="" levels="" of="" lhr="" and="" p450scc="" in="" testicular="" leydig="" cells="" were="" significantly="" higher="" in="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" mice="" compared="" with="" cc="" mice=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b),="" and="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" upregulation="" than="" wssjd=""><0.05; figs.="" 3b="" and="">
Efecto del nuevo WSSJD sobre la apoptosis de células espermatogénicas. La apoptosis de las células espermatogénicas en los testículos de ratón se analizó mediante un ensayo TUNEL. Los núcleos de células apoptóticas se observaron principalmente en las espermatogonias y espermatocitos primarios (Fig. 5A). Las espermatogonias son más grandes que los espermatocitos y se ubican más cerca de la membrana basal (23). El tratamiento con DMSO no tuvo un efecto significativo sobre el número de células espermatogénicas apoptóticas en los testículos. Por el contrario, el tratamiento con CsA aumentó significativamente el número de células espermatogénicas apoptóticas en comparación con los grupos control y DMSO (P<0.05; fig.="" 5b).="" in="" turn,="" administration="" of="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" significantly="" reduced="" csa-induced="" apoptosis=""><0.05; fig.="" 5b).="" furthermore,="" the="" number="" of="" apoptotic="" testicular="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" groups="" was="" significantly="" reduced="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05), and="" new="" wssjd="" was="" significantly="" more="" effective="" than="" wssjd=""><0.05; fig.="">
Efectos del nuevo WSSJD sobre la supervivencia y la apoptosis temprana de los espermatozoides. Para verificar los efectos protectores de la nueva WSSJD frente a la apoptosis espermática inducida por CsA, se determinaron la supervivencia y la apoptosis temprana de los espermatozoides en el epidídimo. Los espermatozoides del epidídimo se tiñeron con PI o anexina V y se analizaron mediante citometría de flujo (Figs. 6 y 7). Siguiendo los resultados antes mencionados, el tratamiento con CsA redujo significativamente el porcentaje de espermatozoides vivos y aumentó significativamente el porcentaje de espermatozoides apoptóticos tempranos (P<0.05; figs.="" 6b="" and="" 7b),="" while="" dmso="" treatment="" had="" no="" effect.="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" significantly="" increased="" the="" percentage="" of="" live="" sperm=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" reduced="" the="" percentage="" of="" early="" apoptosis="" sperm=""><0.05; fig.="" 7b)="" compared="" with="" csa="" treatment.="" the="" percentages="" of="" live="" and="" early="" apoptotic="" sperm="" in="" wssjd="" and="" cc="" mice="" did="" not="" differ="" significantly,="" while="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" increase="" in="" live="" sperm="" percentage="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" significantly="" decreased="" the="" percentage="" of="" early="" apoptotic="" sperm="" compared="" with="" the="" cc="" and="" wssjd="" groups=""><0.05; fig.="">
Discusión
Se ha documentado previamente que el uso a largo plazo de CsA como agente inmunosupresor afecta la capacidad reproductiva (6). Xu (24) informó que la morfología y vitalidad de los espermatozoides en pacientes tratados con CsA fue significativamente menor que en un grupo no tratado, como se observó en las muestras de semen de 26 receptores de trasplante renal tratados con varias dosis de CsA y 12 voluntarios sanos. También se observó que las tasas de deformidad de la cabeza de los espermatozoides eran significativamente más altas en los receptores tratados con CsA(24). Estos resultados sugirieron que la CsA tenía un efecto dependiente de la dosis sobre los parámetros del semen. Por lo tanto, se justifican estudios para identificar nuevos agentes farmacológicos capaces de aliviar el daño testicular inducido por CsA y mejorar la capacidad reproductiva masculina después del trasplante de órganos.
El microambiente específico de los testículos promueve la espermatogénesis y, por lo tanto, el deterioro de la estructura y función testicular puede conducir a la detención de la espermatogénesis(25). Monteiro et al(26) trataron ratas Wistar con CsA a una dosis de 15 mg/kg por día durante 56 días y observaron una mayor proporción volumétrica de tejido conectivo y una disminución de la proporción volumétrica de células de Leydig en ratas tratadas con CsA. También se observó que la CsA causaba la degeneración del epitelio seminífero, lo que resultaba en la vacuolización de las células de Sertoli, espermátides redondas y alargadas anormales y la acumulación de citoplasma residual en el borde del epitelio adyacente a la luz (26). En el presente estudio, los ratones Kunming fueron tratados con 15 mg/kg de CsA diariamente durante 30 días, lo que condujo a la contracción y disminución del diámetro de los túbulos seminíferos, reducción de las capas del epitelio seminífero, disposición desordenada de las células seminíferas, disminución de la madurez espermatozoides en la luz y una puntuación de Johnsen significativamente disminuida.
Además, el tratamiento con CsA dañó severamente la estructura testicular. El presente estudio también evaluó los efectos protectores del nuevo WSSJD, como una nueva medicina china, en los testículos de ratones tratados con CsA. Se observó que las capas epiteliales seminíferas testiculares y la disposición de las células seminíferas se restauraron después del tratamiento con WSSJD nuevo. Además, los ratones del nuevo grupo WSSJD exhibieron túbulos seminíferos integrados sin encogimiento ni colapso y tuvieron una puntuación de Johnsen significativamente más alta en comparación con los ratones tratados con CsA. Estos resultados sugirieron que WSSJD reparó significativamente el daño testicular inducido por CsA, lo que indica que este compuesto de medicina herbal puede ser un tratamiento eficaz en la prevención del daño testicular inducido por CsA. Si esta reparación celular depende o no del nicho dentro del epitelio también es una pregunta importante, que debe investigarse en estudios futuros.
El eje hipotálamo-pituitario-testicular desempeña un papel importante en la regulación de la actividad genital (27). El desarrollo y la funcionalidad de los órganos genitales masculinos están regulados por hormonas del hipotálamo y la hipófisis (28). Krueger et al (29) trataron ratas Sprague Dawley con 25 mg/kg/día de CsA o 40 mg/kg/día de CsA durante 6 días y observaron que los niveles séricos de LH y FSH aumentaron 2-4 veces, mientras que la expresión de P450scc disminuyó al 30 por ciento de la del grupo de control. Además, los niveles de testosterona en suero se redujeron significativamente en los ratones tratados con CsA, lo que resultó en una alteración de la espermatogénesis (29). En el presente estudio, se demostró que el tratamiento con CsA disminuyó significativamente la expresión de LHR en células de Leydig. Aunque la LH sérica aumentó, la expresión disminuida de LHR puede haber afectado la recuperación de la biosíntesis de testosterona mediada por LH y disminuyó la expresión de P450scc, como la enzima limitante de la velocidad de la biosíntesis de testosterona (30), afectando así la biosíntesis de testosterona por parte de las células de Leydig. Los nuevos ingredientes del nuevo WSSJD, como la cornamenta pilosa, presentan efectos similares a los de las hormonas sexuales (12), que pueden mejorar los niveles séricos de testosterona y disminuir los niveles séricos de LH, aumentando así la expresión de LHR y p450scc en las células de Leydig. En particular, los presentes resultados indicaron que el nuevo WSSJD estimuló la biosíntesis y secreción de testosterona en las células de Leydig para promover la espermatogénesis.
El estrés oxidativo inducido por CSA y el daño testicular inducen la displasia de los espermatozoides y las células espermatogénicas (31). Se ha informado que el tratamiento a largo plazo con CsA daña el sistema antioxidante en los tejidos testiculares de los animales, lo que lleva a una disminución de los niveles de glutatión, glutatión peroxidasa y peróxido de hidrógeno y a un aumento de los niveles de dialdehído malónico en los testículos (31). Por lo tanto, los niveles excesivos de especies reactivas de oxígeno en los tejidos testiculares no se pueden eliminar, lo que lleva a la peroxidación de los lípidos de la membrana espermática, daño al ADN y disminución de la vitalidad de los espermatozoides. En el presente estudio, se observó que el tratamiento con CsA aumentó significativamente la rotura del ADN y la tasa de apoptosis de las células espermatogénicas en los túbulos seminíferos. La tasa de supervivencia de los espermatozoides en el epidídimo también disminuyó, mientras que el porcentaje de espermatozoides apoptóticos tempranos aumentó, lo que indica que la actividad espermatogénica de los testículos se vio significativamente dañada. Türk et al (32) documentaron que el efecto protector del ácido elágico sobre el daño testicular inducido por CsA se asoció con el estrés oxidativo en ratas macho. El nuevo WSSJD utilizado en el presente estudio contiene varios componentes antioxidantes, incluido el medicamento a base de hierbas Ginseng, que se ha demostrado previamente que reduce significativamente los niveles de hiperóxido en los testículos (14).
En el presente estudio, se investigaron los efectos del nuevo WSSJD sobre el deterioro de la síntesis de testosterona y la apoptosis espermatogénica inducido por CsA, y se observó que el nuevo WSSJD disminuyó significativamente las tasas apoptóticas de las células espermatogénicas y los espermatozoides, y por lo tanto reparó el daño a las células seminíferas testiculares. epitelio. La morfología de los túbulos seminíferos testiculares y la apoptosis de las células espermatogénicas y los espermatozoides se investigaron mediante histoquímica y citometría de flujo. Aunque la distribución del ciclo celular y la producción diaria de espermatozoides no se investigaron, serán el foco de futuros estudios de nuestro grupo.
WSSJD aumentó significativamente los niveles de testosterona en los testículos y disminuyó la apoptosis de las células espermatogénicas y los espermatozoides, lo que reparó eficazmente el daño testicular inducido por CsA. Estos resultados indican que el nuevo WSSJD puede ser un agente farmacológico útil en el tratamiento y prevención del daño testicular inducido por CsA.
Cistanche deserticola raíces enteras
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