Marcadores de calidad de Cistanches Herba basados ​​en la relación espectro-efecto antioxidante

Abstracto

Objetivo: Establecer un método de investigación de los marcadores de calidad (Q-markers) deCistanches Herba(CH)basado en elrelación espectro-efecto antioxidante, proporcionando una base para el estudio de sus sustancias farmacológicas y control de calidad. Métodos: Se utilizó cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UPLC) para establecer perfiles de huellas dactilares para 10 lotes de CH. Se estableció un modelo de daño oxidativo celular utilizando H2O2 y se determinó la capacidad antioxidante del CH con base en la concentración inhibidora media máxima de especies reactivas de oxígeno, así como los niveles de superóxido dismutasa y catalasa como indicadores farmacológicos. La relación espectro-efecto se construyó mediante análisis de componentes principales, análisis de correlación de Pearson y análisis de regresión de mínimos cuadrados parciales. Los componentes activos fueron sometidos a validación farmacológica. Resultados: Se establecieron perfiles de huellas dactilares para CH mediante UPLC, identificando 17 picos comunes. Sobre la base del análisis de correlación espectro-efecto, se seleccionaron nueve componentes. Los resultados de la validación farmacológica indicaron que el ácido geniposidico, el ácido 8-epilogánico,echinacósido, acteosido,isoactósido, ytubulosido Aexhibió actividad antioxidante de manera dependiente de la concentración. Conclusión: Este estudio exploró los marcadores Q para CH basándose en la relación espectro-efecto, proporcionando información de referencia para su fundamento de sustancia farmacológica y mejora del estándar de calidad.

Palabras clave:Cistanches Herba; marcador Q;relación espectro-efecto; antioxidante

EXTRACTO DE CISTANCHE ORGÁNICO CON 30% DE EQUINACOSIDO Y 12% ACTEÓSIDO PARA LA FUNCIÓN RENAL

cistanchees el tallo carnoso seco con hojas escamosas de Cistanche deserticola YCMa o Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, planta perteneciente al género Cistanche de la familia Orobanchiaceae. Se registró por primera vez en la "Materia Médica de Shen Nong" y figura como de grado superior [1]. Es de naturaleza cálida, de sabor dulce y salado; regresa a los meridianos del riñón y del intestino grueso; tiene los efectos de nutrir el yang del riñón, reponer la esencia y la sangre, humedecer los intestinos y ser laxante, y es un medicamento importante para tonificar los riñones y reponer la esencia [2-3]. Los riñones almacenan esencia, y la esencia y la sangre provienen de la misma fuente. Si la esencia y la sangre son deficientes, afectarán las actividades vitales generales del cuerpo humano; la médula productora de esencia se almacena en los huesos y el cerebro es el mar de médula. Si la esencia del riñón es insuficiente, los huesos perderán su nutrición y el cerebro será deficiente, lo que provocará cambios degenerativos en los huesos, como textura flácida, pérdida de dientes, pérdida de memoria, demencia y disminución de la función inmune [4-6]. Cistanche deserticola contiene glucósidos de feniletanol, iridoides, lignanos y otros componentes estructurales, incluidos equinácea, verbascósido, isorbascósido, ácido genipínico y ácido 8-epistrianico. , tubulina A, etc. [7]. El control de calidad actual de Cistanche deserticola en la edición de 2020 de la "Farmacopea de la República Popular China" solo estipula el contenido de equinácea y verbascósido, que no pueden reflejar completamente las características de acción de múltiples componentes y múltiples objetivos de la medicina tradicional china. , lo que no favorece su control de calidad y evaluación.

Para mejorar el nivel de control de calidad de la medicina tradicional china y optimizar la evaluación de la calidad de la medicina tradicional china, el académico Liu Changxiao propuso el nuevo concepto de marcador de calidad (marcador Q) de la medicina tradicional china [8]. Entre ellos, la "efectividad" es el elemento central de los "Cinco principios" del marcador Q [9] y también es el núcleo de la evaluación de la calidad de las medicinas tradicionales chinas.

En vista del estado actual de la investigación sobre la escasa correlación entre los estándares de calidad y la eficacia de los medicamentos, explorar los marcadores Q de las medicinas tradicionales chinas y establecer estándares de calidad más científicos y razonables es de gran importancia para mejorar la calidad de las medicinas tradicionales chinas. La relación espectro-efecto consiste en vincular los picos cromatográficos de huellas dactilares de la medicina tradicional china con datos farmacodinámicos específicos para encontrar las sustancias efectivas de la medicina tradicional china, reflejando así la calidad inherente de la medicina tradicional china [10]. El establecimiento de un modelo matemático de eficiencia espectral puede aclarar el QMarker de la medicina tradicional china desde una perspectiva de "visión holística", proporcionando más referencias para el control de calidad posterior de la medicina tradicional china, la formulación de estándares de calidad y la detección de ingredientes activos. Este estudio utiliza huellas dactilares combinadas con la tasa de media inhibición de especies reactivas de oxígeno (ROS IC50), los contenidos de superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT) para estudiar la relación espectro-efecto de la medicina tradicional china y utiliza análisis de componentes principales. (PCA), análisis de correlación de Pearson (PCC) y análisis de regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS) para analizar exhaustivamente el marcador Q de Cistanche deserticola y proporcionar una base para su control de calidad.

1 material

1.1 Muestra

Cistanche deserticolase cosechó en el condado de Yutian, Xinjiang y en la base de plantación de Buenas Prácticas Agrícolas (GAP) de Cistanche deserticola en Mongolia Interior. Fue identificado por el investigador Zhang Tiejun del Tianjin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. como Cistanche tubulosa (Schenk) Wight y Cistanche deserticola.

YC Ma, la información detallada se muestra en la Tabla 1.

1.2 Medicina de prueba

La equinácea (número de lote: 111670-201907, pureza: 91,8 %) y el verbascósido (número de lote: 111530-201914, pureza: 95,2 %) se compraron en el Instituto de Control de Alimentos y Medicamentos de China; isorescosida (número de lote: 61303-13 -7), salidrosida (número de lote: 10338-51-9), ácido 8-epistricnoico (número de lote: 82509-41-9), ácido genipínico (número de lote: Z24A10X95926) , tuberosina B (Número de lote: 112516-04-08), 2-glicósido de acetil eugenol (Número de lote: 94492-24-7) se adquirieron de Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., pureza mayor o igual a 98%; El glucósido A de cistanche (número de lote: MUST -20062806, pureza: 98,51 %) y vasculina A (número de lote: MUST19110102, pureza: 98,57 %) se adquirieron de Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd.; acetonitrilo y ácido fórmico cromatográficamente puros se adquirieron de Tianjin Concord Technology Co., Ltd. Company; Agua purificada (Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd.). vitamina E (VE, V8010, Beijing Solarbio Company);

dimetilsulfóxido (DMSO, D2660-100ML, Sigma Company, EE.UU.); kit de detección de proliferación celular en solución única CellTiter 96® AQueous (G3580, Promega Company, EE. UU.); El kit de detección CAT (S0051), el kit de detección de actividad SOD S0101M) y el kit de detección ROS (S0033S) se adquirieron de Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.

1.3 Instrumentos

cromatógrafo líquido de ultra alto rendimiento Waters H-class-PDA (Waters Company, EE. UU.); Balanza electrónica Sartorius BT25S (Compañía Sartorius, Alemania); centrífuga de escritorio de alta velocidad H1650 (Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.); EspectroMax M5

Lector de microplacas (Meigu Molecular Instrument Co., Ltd.); Microscopio biológico WYS-41XDY (Tianjin Micro-Instrument Optical Instrument Co., Ltd.).

1,4 celdas

En este experimento se utilizaron células de riñón embrionario humano HEK 293 y se adquirieron del banco de células de la Academia de Ciencias de China.

2 métodos

2.1 Establecimiento de mapa de huellas dactilares

2.1.1 Preparación de la solución de prueba: Pesar 2 g de material medicinal Cistanche deserticola, agregar 10 veces la cantidad de agua, calentar y refluir 3 veces, 1 h cada vez, centrifugar a 1.0 ×105r·min-1 durante 15 min (el radio de centrífuga es de 300 mm), combinar los sobrenadantes y concentrar para hacer una solución madre con una concentración másica de 100 mg·mL-1, diluirla 10 veces. y filtrarlo a través de una membrana filtrante microporosa de 0,22 µm para obtenerlo.

2.1.2 Preparación de solución de referencia mixta

Tome ácido 8-epistríchnico, salidrosida, equinácea, cistanche glucósido A, ácido genipínico, verbascósido, antocianósido A, isorbascósido y 2'-acetil eugenol. La sustancia de referencia de glucósido y angiósido B se midió en cantidades apropiadas y se pesó con precisión. Agregue una solución de metanol al 50% para disolverla y prepare una solución de sustancia de referencia mixta con una concentración másica de 20 µg·mL–1.

2.1.3 Condiciones cromatográficas

columna ACQUITY UPLC®BEH C18 (100 mm × 2,1 mm, 1,7 µm); la fase móvil es acetonitrilo (A) ~ 0.Solución de ácido fórmico al 1 % (B), programa de elución en gradiente (0 ~ 6 min, 5 % ~ 8 % A; 6 ~ 10 min, 8 % ~ 15 % A 10~13 min, 15%~19%A, 13~20 min, 19%~25%A); la longitud de onda de detección es de 237 nm; el caudal es de 0,4 ml·min –1; la temperatura de la columna es de 40 grados; El volumen de inyección es de 3 µL.

2.1.4 Selección del pico de referencia

En el cromatograma de cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) de Cistanche deserticola, se seleccionó como pico de referencia del espectro de huellas dactilares el pico con la mayor relación de área de pico, tiempo de retención moderado y buena separación.

2.1.5 Revisión metodológica

Prueba de precisión: Tome la muestra T1 y prepare la solución de prueba según el método descrito en 2.1.1. Inyecte la muestra 6 veces seguidas y registre la huella dactilar. Los resultados muestran que el área de pico relativa RSD de cada pico es 0.10%~4,61%, y el tiempo de retención relativo RSD es 0,08%~1,32%, lo que indica que el instrumento tiene buena precisión.

Prueba de repetibilidad: Tome la muestra T1 y prepare 6 muestras de la solución de prueba en paralelo de acuerdo con el método descrito en 2.1.1, e inyecte la muestra continuamente. Los resultados muestran que el área de pico relativa RSD de cada pico cromatográfico es 1,35%~4,80%, y el tiempo de retención relativo RSD es 0,10%~1,80%, lo que cumple con los requisitos de la huella digital y muestra que la repetibilidad del instrumento es bueno.

Prueba de estabilidad: tomar la muestra T1 y preparar la solución de prueba de acuerdo con el método descrito en 2.1.1, inyectar muestras para la prueba a las 0, 2, 4, 8 y 12 horas y registrar la huella digital. La RSD calculada del área relativa del pico de cada pico cromatográfico es 0.53%~4,82%, y la RSD del tiempo de retención relativo es 0.09%~2,17%, lo que cumple con los requisitos. de la huella dactilar e indica que el producto de prueba es estable dentro de las 12 horas.

2.2 Investigación sobre el efecto antioxidante de Cistanche deserticola

2.2.1 Preparación del licor madre Cistanche deserticola

Tomar las aguas madre del punto 2.1.1, filtrarlas, esterilizarlas y diluirlas con medio de cultivo hasta la concentración requerida antes de usarlas.

2.2.2 Cistanche deserticola y control positivo

El efecto de VE sobre la viabilidad de las células HEK 293 se estableció como grupo normal (suspensión celular), grupo de administración de Cistanche deserticola (25, 50, 100, 200, 400 µg·mL–1), grupo VE (20, 40, 60 , 80, 100 µmol·L–1), coloque 6 pocillos duplicados para cada concentración, cultive durante 24 h, agregue 20 µL de reactivo de solución única CellTiter 96® AQueous a cada pocillo para detectar la viabilidad celular, continúe cultivando durante 2 h. y utilizar un lector de microplacas para detectar la viabilidad celular a 490 nm. El valor de absorbancia (OD) de cada pocillo se utilizó para calcular la tasa de supervivencia celular según la fórmula (1). Tasa de supervivencia (%)=(grupo experimental de OD/grupo en blanco de OD) × 100 % (1)

2.2.3 Cistanche deserticola sobre inducción de H2O2

Efecto de ROS sobre células HEK 293. Las células se dividieron en un grupo normal (suspensión celular) y un grupo de administración de Cistanche deserticola (6,25, 12,5, 25, 50, 100 µg·mL–1 Cistanche deserticola y 60 µm·L–1 H2O2) y se cultivaron durante 24 h. Siga los pasos del kit de detección de ROS para operaciones posteriores, observe directamente la tinción celular a través de un microscopio y utilice un lector de microplacas para detectar la intensidad de fluorescencia de cada grupo. La configuración de los parámetros utilizó una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de emisión de 525 nm. El experimento se repitió tres veces.

2.2.4 Pareja de Cistanche deserticola

Efecto del H2O2 sobre la SOD en células HEK 293. Las células se dividieron en grupo normal (suspensión celular), grupo modelo (60 µm·L–1 H2O2), grupo VE (60 µm·L–1 VE y 60 µm·L–1 H2O2), grupo de administración de Cistanche deserticola (100 µg·mL–1 Cistanche deserticola y 60 µm·L–1 H2O2), recoger las células después de 24 h de cultivo, agregar solución de preparación de muestra de SOD para lisar las células y centrifugar a 4 grados y 12000 r·min{{22} } min (el radio de centrifugación es de 300 mm), tomar el sobrenadante como muestra a analizar y seguir los pasos del kit de detección de SOD para operaciones posteriores. El experimento se repitió tres veces.

2.2.5 Cistanche deserticola sobre inducción de H2O2

Los efectos de CAT en las células HEK 293 se trataron según el método descrito en 2.2.4 y se agruparon en grupos. Después del tratamiento, agregue la solución de lisis, centrifugue a 4 grados y 12000 r·min-1 durante 10 min (el radio de centrífuga es de 300 mm), tome el sobrenadante y siga los pasos del kit de detección CAT para operaciones posteriores. . El experimento se repitió tres veces.

2.2.6 Análisis estadístico

Para el análisis estadístico se utilizó el software SPSS 26.0. Cada grupo de datos estuvo representado por (±±(). Se realizó un análisis de varianza unidireccional en los datos que se ajustaban a la distribución normal. Si las varianzas eran iguales, se utilizó el método de diferencia menos significativa. Si las varianzas eran desigual, se utilizó el método T3 de Dunnett para graficar GraphPad Prism 8 y P.<0.05 was considered as a statistically significant difference.

2.3 Análisis de correlación espectro-efecto del antioxidante Cistanche deserticola

2.3.1 PCA Las áreas de los picos comunes de 10 lotes de Cistanche deserticola que han establecido huellas dactilares se normalizaron mediante el valor Z y se convirtieron en una matriz de datos de orden de 10×17, que se importó al software SPSS 26.0. para PCA.

2.3.2 PCC

Se utilizó SPSS 26.0 para realizar análisis bivariados para estudiar la relación de eficiencia espectral entre las huellas dactilares de Cistanche deserticola y los antioxidantes. La prueba de significancia se realizó mediante una prueba bilateral (T), con P<0.05 as the standard for statistically significant differences.

2.3.3 PLS

Importe los resultados experimentales del área de pico estandarizada y el antioxidante de Cistanche deserticola en el software SIMCA-P 14.1, establezca el área del pico como la variable X y establezca el índice farmacodinámico como la variable Y para realizar PLS.

2.4 Verificación de la actividad antioxidante del marcador Q de Cistanche deserticola

2.4.1 Preparación de la solución madre de principios activos. Pese con precisión cantidades adecuadas de ácido genipínico, ácido 8-epistrícnico, equinácea, verbascósido, isorebascósido y antocianósido A, y agregue DMSO para disolverlos en una solución de referencia de 10 mmol·L-1.

2.4.2 Efecto de los ingredientes activos sobre la citotoxicidad de HEK 293.

Después de incubar células HEK 293 durante 24 horas, agregue diferentes concentraciones de soluciones de ingrediente activo según 2.4.1 a cada pocillo (0.781, 1,563, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 µmol·L–1 ) 100 µL, estimulación continua

Después de que las células se incubaron durante 24 horas, se añadió el reactivo de solución única CellTiter 96® AQueous para detectar la viabilidad celular.

2.4.3 El efecto del daño antioxidante de los ingredientes activos en las células HEK 293 inducidas por H2O2-.

Las células se agrupan de la siguiente manera: grupo normal, grupo modelo y grupo VE se agrupan según 2.2.4. Grupo experimental (0.781, 1.563, 3.125 µm·L–1 composición de actividad y 60 µm·L–1 H2O2), cultivado durante 24 h. Determinar los niveles de ROS intracelular, el contenido de enzimas SOD y CAT de acuerdo con los métodos descritos en 2.2.3, 2.2.4 y 2.2.5 respectivamente.

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