Cuantificación de la degeneración de neuritas con mayor precisión y eficiencia en un modelo in vitro de la enfermedad de Parkinson, parte 1

Abstracto

La degeneración de las neuritas se asocia con las primeras etapas de trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson (EP) y la esclerosis lateral amiotrófica. Un método que se usa comúnmente para analizar la degeneración de neuritas implica el cálculo de un índice de degeneración (DI) luego de la utilización de la herramienta Analizar partículas de ImageJ para detectar fragmentos de neuritas en micrografías de células cultivadas. Sin embargo, los análisis DI son propensos a varios tipos de errores de medición, su realización puede llevar mucho tiempo y su aplicación es limitada.

La neurodegeneración se refiere a cambios que ocurren dentro o alrededor de las neuronas, que pueden afectar la función cognitiva, la inteligencia, las emociones, el comportamiento, etc. de los seres humanos. Mucha gente piensa que la neurodegeneración está estrechamente relacionada con el deterioro de la memoria, pero puede que este no sea el caso.

En primer lugar, la neurodegeneración no significa necesariamente que la memoria disminuya con la edad. Algunas personas pueden mantener una buena memoria e incluso ser capaces de comprender la rectitud. Esto se debe a que la memoria de una persona se ve afectada por una combinación de factores como el ejercicio, la dieta y el estilo de vida.

En segundo lugar, el cerebro humano puede restablecer nuevas conexiones neuronales y formar nuevos recuerdos, lo que se denomina plasticidad. Independientemente de la edad, el cerebro está constantemente aprendiendo y formando nuevos recuerdos. Por lo tanto, la neurodegeneración es simplemente un cambio natural en el cerebro y no significa necesariamente que la memoria se deteriore.

Por último, mantener una actitud optimista también puede mejorar la memoria de una persona. La preocupación y el estrés pueden tener efectos adversos en el cerebro y provocar pérdida de memoria. Una actitud positiva puede promover la salud del cerebro y mejorar la memoria y la capacidad cognitiva.

En resumen, la neurodegeneración no conduce necesariamente a la pérdida de memoria, y una actitud optimista ante la vida puede ayudarnos a mantener una buena memoria y capacidad cognitiva. Por lo tanto, debemos mantener una actitud optimista y fortalecer el ejercicio, la dieta y el manejo del estilo de vida para mantener la salud del cerebro y la memoria. Se puede ver que necesitamos mejorar nuestra memoria. Cistanche puede mejorar significativamente la memoria, porque Cistanche también puede regular el equilibrio de los neurotransmisores, como aumentar el nivel de acetilcolina y los factores de crecimiento. Estas sustancias son muy importantes para la memoria y el aprendizaje. Además, la carne también puede mejorar el flujo sanguíneo y promover el suministro de oxígeno, lo que puede garantizar que el cerebro reciba suficiente nutrición y energía, mejorando así la vitalidad y la resistencia del cerebro.

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Aquí, describimos un método mejorado para realizar análisis DI. La precisión de las mediciones se mejoró mediante la modificación de los criterios de selección para detectar fragmentos de neuritas, la eliminación de artefactos de imagen y materiales no neuritas de las imágenes y la optimización del contraste de la imagen. Estas mejoras se implementaron en una macro ImageJ que permite un análisis DI rápido y totalmente automatizado de múltiples imágenes. La macro presenta operaciones para la eliminación automatizada de cuerpos celulares de micrografías, ampliando así la aplicación de los análisis DI para su uso en experimentos que involucran cultivos disociados.

Presentamos hallazgos experimentales que respaldan que, en comparación con el método convencional, el método de análisis mejorado produce mediciones con mayor precisión y requiere significativamente menos tiempo para realizarlo.

Además, demostramos la utilidad del método para investigar la degeneración de neuritas en un modelo de cultivo celular de EP mediante la realización de un experimento que revela los efectos de la quinasa N-terminal c-Jun (JNK) sobre la degeneración de neuritas inducida por estrés oxidativo en células mesencefálicas humanas. Este método de análisis mejorado se puede utilizar para obtener conocimientos novedosos sobre los factores que subyacen a la degeneración de las neuritas y la progresión de los trastornos neurodegenerativos.

Palabras clave:

Degeneración axonal; índice de degeneración; degeneración de neuritas; neurodegeneración; estrés oxidativo; Enfermedad de Parkinson.

Declaración de importancia

La degeneración de las neuritas es un evento celular asociado con las primeras etapas de múltiples tipos de trastornos neurodegenerativos. Los factores moleculares que regulan la degeneración de las neuritas siguen siendo poco conocidos y los métodos existentes para estudiar la degeneración de las neuritas tienen una aplicación y eficiencia limitadas. Aquí, identificamos modificaciones a un procedimiento ampliamente utilizado para analizar la degeneración de neuritas que reduce el error de medición.

Estas mejoras metodológicas se incorporaron a una macro ImageJ, lo que facilitó un análisis rápido y completamente automatizado de la degeneración de las neuritas utilizando grandes conjuntos de micrografías. Utilizando un modelo de cultivo celular de la enfermedad de Parkinson (EP), demostramos que la macro facilita mediciones de degeneración de neuritas más precisas y eficientes al tiempo que ampliamos la idoneidad del método de análisis para experimentos que involucran cultivos disociados.

Introducción

La degeneración de las neuritas es un proceso celular en el que los axones o las dendritas sufren una disfunción progresiva y cambios morfológicos, lo que lleva a una pérdida de la integridad de las neuritas. La degeneración de las neuritas es un proceso conservado evolutivamente que es fundamental para el establecimiento adecuado de redes neuronales durante el desarrollo del sistema nervioso central (Neukomm y Freeman, 2014).

Sin embargo, el proceso también se desencadena en respuesta a diversas formas de lesión, como daños mecánicos o exposición a medicamentos utilizados para la quimioterapia (Salvadores et al., 2017). Además, la degeneración de las neuritas se asocia con la progresión de una variedad de trastornos neurodegenerativos relacionados con la edad, incluida la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Huntington y la esclerosis lateral amiotrófica.

Curiosamente, para todos estos trastornos neurodegenerativos, la evidencia acumulada sugiere que la degeneración de las neuritas es un evento clave en una etapa temprana que precede a la muerte neuronal o la aparición de síntomas clínicos (Serrano-Pozo et al., 2011; Adalbert y Coleman, 2013; Marangoni et al. ., 2014; Suzuki et al., 2020). Por tanto, los estudios que exploran los factores que regulan este proceso celular pueden revelar nuevos objetivos para tratar una variedad de afecciones neurodegenerativas.

La investigación de la degeneración de las neuritas es particularmente importante para comprender la EP, una enfermedad caracterizada por la acumulación de agregados de proteínas que contienen alfa-sinucleína, la pérdida progresiva de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra pars compacta (SNpc) y el desarrollo de una variedad de síntomas motores y cognitivos. (Aarsland et al., 2017).

La evidencia de estudios postmortem y de imágenes en humanos indica que los agregados de a-sinucleína son más abundantes en las fibras neuronales que en los cuerpos celulares, y la degradación de los axones dopaminérgicos ocurre en mayor medida que la pérdida de neuronas dopaminérgicas en el SNpc durante el período que conduce al inicio clínico. (Tagliaferro y Burke, 2016).

Si bien las interacciones moleculares que contribuyen al deterioro progresivo de las neuritas dopaminérgicas aún no se comprenden completamente, la evidencia reciente indica que la degeneración de las neuritas puede estar mediada por eventos independientes de las cascadas de señalización que subyacen a la muerte neuronal (Fukui, 2016; Geden y Deshmukh, 2016). Por lo tanto, los estudios que evalúan directamente los fundamentos fisiológicos de la degeneración de las neuritas son fundamentales para el desarrollo de terapias que impidan la progresión temprana de la EP.

En respuesta a la evidencia de un papel central de la degeneración de las neuritas en la progresión de los trastornos neurodegenerativos, se han desarrollado una variedad de métodos para medir la degeneración de las neuritas utilizando micrografías de neuronas cultivadas. Por ejemplo, se han establecido múltiples métodos diferentes para medir la degeneración de las neuritas utilizando software para detectar una disminución en el número o la longitud de las neuritas (Ofengeim et al., 2012; Johnstone et al., 2018).

Sin embargo, dado que dichos métodos no evalúan directamente la fragmentación de las neuritas, la interpretación de los resultados para determinar el impacto de una variable en la degeneración de las neuritas puede verse confundida por los efectos potenciales de la variable en el crecimiento de las neuritas. Ciertos grupos de investigación también han medido la degeneración de las neuritas puntuando subjetivamente imágenes de neuritas en función de las características morfológicas y el grado de fragmentación aparente (Zhai et al., 2003; Nakamura et al., 2016; Krishtal et al., 2017). Sin embargo, este método alternativo requiere mucho tiempo y puede introducir errores en el investigador.

Un método que facilita la medición objetiva y directa de la fragmentación de neuritas implica el uso del algoritmo Analizar partículas de ImageJ para medir el área de fragmentos de neuritas en micrografías de células cultivadas. Las mediciones se utilizan para calcular un índice de degeneración (DI), una escala entre {{0}}.0 y 1,0 que refleja el grado de degeneración de las neuritas (Sasaki et al., 2009).

Si bien los análisis DI se pueden utilizar para detectar diversos grados de fragmentación de neuritas, la precisión de las mediciones suele estar limitada por varias fuentes de error, y la aplicación del método se ha limitado principalmente a cultivos de explantes o células cultivadas en dispositivos de microfluidos compartimentados. Además, los análisis DI consumen mucho tiempo cuando se extrapolan a conjuntos de imágenes grandes. Por lo tanto, buscamos superar estas limitaciones modificando el procedimiento de análisis DI para facilitar una mayor precisión y eficiencia, al tiempo que ampliamos la aplicabilidad.

En el presente estudio, identificamos varias fuentes de error comúnmente asociadas con los análisis DI e informamos revisiones metodológicas que reducen las diversas formas de error. Incorporamos las mejoras de procedimiento en una macro de ImageJ denominada Índice de degeneración de neuritas automatizado (ANDI) para automatizar completamente los análisis DI de conjuntos de imágenes grandes. El funcionamiento de la Macro ANDI sólo requiere software y archivos de código abierto y disponibles gratuitamente. Las mediciones obtenidas con ANDI se benefician de una mayor precisión y, al mismo tiempo, reducen sustancialmente el tiempo necesario para realizar los análisis.

Además, demostramos cómo se puede aplicar el nuevo método de análisis para realizar una medición rápida y precisa de la degeneración de neuritas en un modelo de cultivo celular de EP que involucra células disociadas cultivadas sin compartimentación. En conjunto, estas mejoras metodológicas pueden conducir a conocimientos novedosos sobre los factores subyacentes a un importante proceso celular asociado con la neurodegeneración.

Materiales y métodos

Cultivo de células

Se establecieron cultivos de células mesencefálicas humanas de Lund (LUHMES) en portaobjetos de cámara de ocho pocillos Lab Tek II recubiertos con poli-L-ornitina (PLO) y fibronectina, poli-D-lisina (PDL) y laminina, los cuatro sustratos, o no. sustratos, como se indica. Para recubrir con PLO y fibronectina, los portaobjetos se incubaron durante la noche a temperatura ambiente con una solución que contenía 200 mg/ml de PLO (Sigma-Aldrich, n.º de catálogo P3655).

Después de los lavados con agua esterilizada (Avantor), los portaobjetos se incubaron con 2 mg/ml de fibronectina (Sigma-Aldrich, n.º de catálogo F0895) durante 3 horas a 37 grados. Luego se lavaron los portaobjetos con PBS estéril (Corning Life Sciences, catálogo n.°21-040-CV) y se dejaron secar al aire. Para recubrir con PDL y laminina, los portaobjetos se incubaron a temperatura ambiente con una solución que contenía 100 ng/ml de PDL (Sigma-Aldrich, n.º de catálogo P7280) y 10 mg/ml de laminina (Corning, n.º de catálogo 354232).

Después de una incubación durante la noche, los portaobjetos se lavaron con PBS estéril y se dejaron secar al aire. Para recubrir con los cuatro sustratos, los procedimientos antes mencionados se realizaron secuencialmente. Se sembraron células LUHMES (ATCC, RRID: CVCL_B056) en portaobjetos de cámara recubiertos a las densidades indicadas en un medio de diferenciación que consistía en DMEM/F12 (Invitrogen, n.º de catálogo 11330057) suplementado con glutamina 2 mM (VWR). Suplemento de N-2 al 1 % (v/v), 1 mg/ml de tetraciclina (Sigma-Aldrich, n.º de catálogo87128-25G), N6 1 mM,29-Odibutiriladenosina cAMP (db-cAMP ; Enzo Life Sciences, catálogo #BML-CN125-0100), y factor neurotrófico derivado de línea celular glial de 2 ng/ml (GDNF; R&D Systems, catálogo #212-GD-010).

Salvo que se indique lo contrario, todos los cultivos se sembraron en placas a una densidad de 115,000 células por pocillo. Se realizó un reemplazo del 50% del volumen del medio cada 48 horas hasta el tratamiento. Para evitar la deriva genética, en todos los experimentos se utilizaron reservas de células que habían sido pasadas seis o menos veces.

Los experimentos con cultivos primarios de neuronas simpáticas fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad del Este de Kentucky o la Universidad de Virginia. Se diseccionaron ganglios cervicales superiores de ratones C56Bl/6 del día posnatal 0–6, se incubaron a 37 grados en un tampón de disociación enzimática y se lavaron con medio de crecimiento para eliminar las enzimas proteolíticas y se trituraron.

Las suspensiones celulares se sembraron en placas a una densidad de 7000 células por pocillo en portaobjetos con cámara de ocho pocillos Lab Tek II. Los medios se cambiaron el día in vitro (DIV) 1, seguido del reemplazo de los medios cada dos días. Los medios se complementaron con arabinofuranósido de citosina (Ara-C, Millipore-Sigma) en DIV1-DIV3 para prevenir el crecimiento de células no neuronales, seguido de la eliminación de Ara-C de los medios durante al menos 24 h antes del tratamiento como se indica. Para experimentos realizados en la Universidad de Eastern Kentucky que involucran tratamiento con peróxido de hidrógeno, los portaobjetos de la cámara se recubrieron con 200 mg/ml de PLO (Sigma-Aldrich, n.° de catálogo P3655), 2 mg/ml de fibronectina, 100 ng/ml de PDL (Sigma-Aldrich, catálogo #P7280) y 10 mg/ml de laminina (Corning, catálogo #354232) antes de su uso, y la disociación se realizó mediante 30-incubación min en tampón que consiste en DMEM (ThermoFisher, catálogo #11960- 044) que contiene 0,025 %. tripsina (Corning Life Sciences, catálogo n.º25-053-CI) y colagenasa al 0,3 % (Worthington Biochemical, catálogo n.º LS004176).

Los medios de crecimiento para dichos experimentos consistieron en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Invitrogen, catálogo n.°26140-079), L-glutamina 2 mM (Corning, catálogo n.°25-005-CI) y 40 ng/ml. factor de crecimiento nervioso (Fisher Scientific, catálogo n.°13-257-019); Se usó Ara-C 5 mM (Sigma-Aldrich) para la eliminación de células no neuronales.

Para los experimentos realizados en la Universidad de Virginia que implicaban la retirada de NGF, las células se sembraron en portaobjetos de cámara recubiertos con 100 ng/ml de PDL (Millipore Sigma) y 10 mg/ml de laminina (Invitrogen), y la disociación se realizó mediante 20- min incubación en tampón que consiste en DMEM/F12 que contiene BSA (10 mg/ml, Sigma-Aldrich), colagenasa tipo 2 (4 mg/ml, Worthington Biochemical), desoxirribonucleasa 1 (Millipore Sigma) e hialuronidasa (Sigma-Aldrich). Los medios de crecimiento para tales experimentos consistieron en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% (Invitrogen), 1 U/ml de penicilina/estreptomicina (Invitrogen) y 45 ng/ml de NGF (purificado de glándulas salivales); Se usó Ara-C 10 mM para la eliminación de células no neuronales.

Tratamientos celulares

Las células LUHMES diferenciadas se expusieron a las concentraciones indicadas de {{0}}hidroxidopamina (6-OHDA; Sigma-Aldrich, n.º de catálogo 162957) o solución vehículo en su quinto día en el medio de diferenciación. Se prepararon reservas de 6- OHDA en PBS enfriado que contenía ascorbato al 0,02 % (Sigma-Aldrich, n.º de catálogo A5960) y se almacenaron alícuotas en viales protegidos de la luz bajo gas inerte a 80 grados. Después de 24 h de tratamiento, las células se fijaron mediante incubación en PBS que contenía paraformaldehído (PFA) al 4% durante 25 minutos a temperatura ambiente.

Para determinar el papel de la quinasa N-terminal c-Jun (JNK) en la degeneración de neuritas inducida por estrés oxidativo, los cultivos se trataron previamente durante 1 h con SP600125 10 mM (Sigma-Aldrich, n.º de catálogo S5567) o solución vehículo. antes de reemplazar completamente los medios con medios que contienen 6-OHDA 7,5 mM, 6-OHDA 7,5 mM y SP600125 10 mM, o soluciones de vehículo. Se prepararon reservas de SP600125 disolviendo el inhibidor en dimetilsulfóxido (DMSO) estéril y se almacenaron alícuotas congeladas en viales protegidos de la luz llenos de gas inerte a 20 grados. Los tratamientos se realizaron de manera que las células estuvieran expuestas a no más del 0,1% de DMSO.

Se trataron cultivos primarios de neuronas simpáticas en DIV5. Para experimentos que involucran la degeneración de neuritas inducida por peróxido de hidrógeno, los cultivos se expusieron a peróxido de hidrógeno 500 mM (Sigma-Aldrich, catálogo #H1009-100ML) o una solución vehículo que consiste en agua estéril (Cytiva, catálogo #SH30529.02). durante 24h.

Para los experimentos que implicaron la retirada de NGF, los cultivos de SCG recibieron un reemplazo de medio con medio de crecimiento o fueron sometidos a privación de NGF. Los cultivos de SCG que se iban a privar de NGF se enjuagaron tres veces con medio de crecimiento libre de NGF y luego se incubaron en medio de crecimiento libre de NGF durante 80 h sin cambios de medio. Después del tratamiento, las células se fijaron mediante incubación en PFA al 4% en PBS durante 30 minutos, seguido de la eliminación del PFA mediante enjuague con PBS.

Microscopía de tinción y fluorescencia.

Para los experimentos con células LUHMES, así como para los experimentos con neuronas simpáticas tratadas con peróxido de hidrógeno, se permeabilizaron portaobjetos de cámara de ocho pocillos que contenían células fijadas con 0.1% Triton X-100 en PBS y se bloquearon durante 1 h con suero de cabra normal al 10% en PBS que contiene Triton X-100 al 0,1%. Luego, los portaobjetos se incubaron con un anticuerpo primario específico para b I tubulina (Covance; 1:1000, RRID: AB_2313773) en una solución de bloqueo a 4 grados durante la noche. Posteriormente, los portaobjetos se lavaron con PBS, se incubaron con un anticuerpo secundario acoplado a Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_142495) durante 90 minutos a temperatura ambiente y se sometieron a lavados adicionales.

Para los experimentos que implicaban tinción con tirosina hidroxilasa (TH), los portaobjetos se sometieron a una incubación adicional en PBS que contenía 10% de suero de cabra normal, 0,1% de Triton X-100, un anticuerpo específico para TH (Sigma- Aldrich, 1:400, AB152) a 4 grados durante la noche. Luego, los portaobjetos se lavaron con PBS, se incubaron con un anticuerpo secundario acoplado a Alexa Fluor 568 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_1500889) y se sometieron a lavados adicionales con PBS.

Una vez completado el inmunomarcaje para b III-tubulina o TH, los portaobjetos se incubaron con 5 mg/ml de 49,69-diamidino-2-fenilindol (DAPI; n.º de catálogo D9542) en PBS durante 5 minutos. Luego se lavaron los portaobjetos con PBS y se montaron cubreobjetos utilizando el medio de montaje Fluoromount G (Southern Biotech, catálogo n.°0100-01).

Para experimentos con neuronas simpáticas sometidas a retirada de NGF, los portaobjetos se bloquearon durante 1 h mediante incubación a temperatura ambiente en un tampón que consistía en 5 % de suero normal de cabra (Life Technologies) y 0.0005 %. Triton X-100 en PBS, seguido de incubación en una solución de anticuerpo primario que contiene Tuj1 anti-ratón de ratón (1:1000, Covance) durante la noche a 4 grados. Posteriormente, los portaobjetos se enjuagaron con PBS, se incubaron durante 1 h en IgG anti-ratón de cabra Alexa Fluor 488 (1:800, Invitrogen) y 0,1 mg/ml de Hoechst 33342 (Invitrogen) en tampón de bloqueo, se sometieron a enjuagues adicionales con PBS y se dejaron Secar. Los portaobjetos se montaron con Fluoromount-G (Southern Biotech, catálogo n.°0100-01) y se almacenaron a temperatura ambiente.

Los portaobjetos que contenían células LUHMES se visualizaron con un objetivo 20 de un sistema de microscopio invertido Nikon Eclipse II Ti-U con una fuente de luz LED de canal Lumencor Mira 4-. 1280 1024-Las imágenes de píxeles se capturaron utilizando una cámara CCD Nikon DSQi1Mc de 5 MP y NIS Elements 3.22.15 (compilación 738). Salvo que se indique lo contrario, todas las imágenes de contraste de fase se capturaron utilizando ajustes de intensidad de luz y tiempo de exposición que produjeron una intensidad de fondo promedio de 165 en imágenes de 8-bits.

Para reducir el sombreado del fondo u otras inconsistencias, antes de cada sesión de microscopía, se capturó una imagen de un pocillo vacío y se usó para la corrección del fondo durante la obtención de imágenes de células LUHMES. Se tomaron imágenes de portaobjetos que contenían neuronas simpáticas cultivadas en la Universidad Eastern Kentucky o la Universidad de Virginia utilizando un sistema de microscopio Zeiss LSM 800 o un sistema de microscopio Zeiss LSM 980, respectivamente. Las imágenes se capturaron con 20 aumentos y una resolución de 1024 1024 utilizando el software Zen (Carl Zeiss Microscopy).

Análisis de viabilidad celular.

Se establecieron cultivos de células LUHMES diferenciadas en portaobjetos de cámara de ocho pocillos Lab Tek II que se recubrieron como se indica con varios sustratos. Se realizó un cambio de medio del 50% cada 48 horas y las células se fijaron con PFA al 4% en PBS el sexto día de diferenciación. Los portaobjetos que contenían células fijadas se sometieron a tinción con DAPI y se capturaron imágenes de tinción nuclear con un sistema de microscopio invertido Nikon Eclipse II Ti-U y una cámara CCD Nikon DS-Fi1 5 MP.

Un investigador ciego calificó las células como sanas o no saludables según la apariencia de los núcleos. Las células con área nuclear disminuida o fragmentación nuclear se calificaron como no saludables. Se puntuó el número de células sanas por imagen para al menos cinco campos de visión por condición en cada experimento.

mediciones DI

Las mediciones de DI tradicionales se realizaron utilizando un paquete Fiji Is Just ImageJ (FIJI) que contiene ImageJ 1.52p mediante un método que involucra parámetros ampliamente citados para el análisis de DI (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al., 2020; Shin y Cho, 2020). Las imágenes de ocho bits de células LUHMES diferenciadas con tractos de axones bien separados se sometieron a binarización utilizando el algoritmo de binarización predeterminado, con opciones binarias configuradas para producir una imagen con células negras en primer plano y un fondo blanco.

Se utilizó la herramienta de dibujo a mano alzada para trazar manualmente todas las regiones de la imagen que presentaban cuerpos celulares, y todos los píxeles negros se convirtieron a blancos en las regiones trazadas. Se aplicó la herramienta Medir de ImageJ para medir el área negra total de las imágenes binarizadas que presentan exclusivamente neuritas. Luego se aplicó la herramienta Analizar partículas usando una configuración de tamaño de 20–10,000 píxeles y una configuración de circularidad de 0,2–1,0 para detectar fragmentos de neuritas. Luego, el área sumada de todos los fragmentos de neuritas se dividió por el área negra total para calcular el DI de la imagen.

Para los experimentos relacionados con la optimización de los parámetros de tamaño para la identificación de fragmentos de neuritas, se utilizaron criterios de circularidad de {{0}}.2–1.00 para todas las mediciones de partículas. El complemento Particle Remover (versión 20{{10}}4/02/09), desarrollado por Wayne Rasband, se obtuvo de https://imagej.nih.gov/. Cuando se indicó, se realizó la aplicación del complemento Particle Remover utilizando parámetros de tamaño de 0 a 9 píxeles y parámetros de circularidad de 0,0 a 1,0 para eliminar objetos pequeños sin neuritas de imágenes binarizadas obtenidas de micrografías de contraste de fase.

De manera similar, se utilizaron parámetros de tamaño de {{0}}–4 píxeles y parámetros de circularidad de 0–1,0 para eliminar objetos pequeños de imágenes binarizadas obtenidas de micrografías de fluorescencia que representan la inmunotinción de tubulina b III. A menos que se indique lo contrario, antes del análisis DI, todas las imágenes de contraste de fase se sometieron a mejora de contraste utilizando ImageJ para aplicar una tabla de búsqueda (LUT) con un mínimo de 90 y un máximo de 205.

Medición de la fragmentación artificial.

Los cultivos que contenían células LUHMES sanas se fijaron con PFA al 4% en su sexto día de diferenciación y se inmunomarcaron para tubulina b III. Utilizando un objetivo de 20, se capturaron micrografías de contraste de fase de 1280 1024-píxeles y micrografías de fluorescencia, cada una de las cuales representa campos de visión idénticos, de regiones muestreadas al azar. Se capturaron un total de diez conjuntos de imágenes de nueve culturas distintas.

ImageJ se utilizó para generar copias binarizadas de las micrografías de fluorescencia y contraste de fase originales, así como copias de micrografías de contraste de fase que se binarizaron después de la mejora del contraste mediante la aplicación de un LUT con un mínimo de 90 y un máximo de 205. Para cada conjunto A partir de imágenes, un investigador ciego identificó una pequeña región de 150 150-píxeles de la micrografía de contraste de fase original que presentaba neuritas exclusivamente sanas e intactas.

Luego, el tamaño y las coordenadas de la región se almacenaron en el administrador de región de interés (ROI) de ImageJ y se usaron para realizar mediciones DI en regiones análogas de imágenes binarizadas del mismo conjunto de imágenes. Las mediciones DI se realizaron utilizando el método tradicional con parámetros de tamaño de fragmento de 20 -10,000 píxeles. Dado que todas las regiones medidas contenían exclusivamente neuronas intactas, cualquier fragmento detectado se consideró fragmento artificial.

macroandi

La macro ANDI se escribió utilizando el lenguaje de macros ImageJ. La macro presenta una serie de operaciones que permiten al usuario seleccionar rutas para tres directorios, un directorio que contiene imágenes de neuronas inmunomarcadas para un marcador neuronal como la tubulina b III, un segundo directorio que contiene las imágenes correspondientes que representan la tinción nuclear y un tercer directorio. designado para guardar archivos de resultados. Luego, las áreas de fragmentos y las áreas de neuritas totales de las imágenes en los directorios seleccionados se calculan mediante una serie de operaciones de ImageJ. En resumen, se abre una imagen que representa el etiquetado nuclear, se somete a mejora de contraste y se binariza. El complemento de eliminación de partículas se utiliza para eliminar pequeños artefactos no nucleares de la imagen binarizada, y la imagen binarizada se somete a una serie de dilataciones y erosiones.

Se abre una imagen correspondiente de células inmunomarcadas para tubulina b III (u otro marcador neuronal) y se somete a realce de contraste. La imagen binarizada que representa núcleos celulares agrandados se resta de la imagen que presenta células inmunomarcadas para tubulina b III, generando así una imagen que presenta exclusivamente neuritas. Luego, la imagen de la neurita se binariza y se somete a la eliminación de partículas de entre 0 y 4 píxeles. El área del fragmento de Neurita se calcula aplicando el algoritmo Analizar partículas para medir partículas con una circularidad entre 0.2 y 1.0 y un tamaño entre 5 y 10,0000 píxeles. El área total de neuritas se calcula aplicando la herramienta Medir para calcular el área negra total. Una imagen que representa el área de neuritas binarizada con fragmentos resaltados se guarda en un directorio designado por el usuario, junto con archivos .csv que informan el área de neuritas fragmentada y las mediciones del área total de neuritas.

Además de las operaciones antes mencionadas, se incluyen varias operaciones adicionales en la macro para facilitar el uso y limitar los errores del usuario. Estas incluyen funciones que eliminan información de escala de las imágenes y garantizan que las mediciones se obtengan en unidades de píxeles; configurar las configuraciones de color y las opciones binarias de ImageJ para la resta y binarización de imágenes apropiadas; verificar que los directorios seleccionados para imágenes de tinción con tubulina b III y tinción DAPI contengan el mismo número de imágenes; cierre las imágenes utilizadas anteriormente para mejorar el tiempo de procesamiento; resultados claros de análisis anteriores antes de realizar nuevos análisis; y evite errores asociados con la creación de archivos .ini en Windows 10.

Para experimentos que involucran análisis de neuronas simpáticas, la Macro ANDI fue revisada para incluir una operación que presenta un cuadro de diálogo que permite al usuario controlar la cantidad de veces que se dilatarán las imágenes binarizadas de núcleos. La versión de ANDI que presenta esta revisión se denominó ANDI v1.1. Cambiar el valor en el cuadro de diálogo a un número mayor aumenta el tamaño de eliminación de soma, mientras que cambiar el valor a un número menor disminuye el tamaño de eliminación de soma. El valor predeterminado es 12, que es el número de dilataciones utilizadas para todos los experimentos con células LUHMES. Se utilizó un valor de 16 para eliminar regiones del cuerpo celular más grandes durante los análisis de neuronas simpáticas.

La macro ANDI es de código abierto y está disponible gratuitamente para su uso o modificación a través de la siguiente URL: https://github. com/kraemerb/kraemerlab. El funcionamiento preciso de ANDI se ha verificado utilizando varias computadoras personales con el sistema operativo Windows 10. Un conjunto de imágenes que muestra cultivos de células LUHMES que exhiben diversos grados de degeneración de neuritas también está disponible en la dirección web antes mencionada y puede usarse para investigar la ejecución precisa de la macro por otros tipos de computadoras. La dirección web también proporciona acceso a un protocolo que describe cómo utilizar la macro.

Estimaciones de tiempo

Para evaluar el tiempo necesario para realizar mediciones DI manualmente, se utilizaron micrografías de contraste de fases que representan células LUHMES que se trataron con solución vehículo, 6-OHDA 2,5 mM, 0OHDA 5,0 mM 6-OHDA o Se sometieron 6-OHDA 7,5 mM a puntuación DI utilizando métodos previamente establecidos (Kraemer et al., 2014). Cada imagen fue sometida a mejora de contraste y binarización. Luego se utilizó la herramienta de mano alzada de ImageJ para eliminar digitalmente todos los cuerpos celulares representados de las imágenes binarizadas. La herramienta Analizar partículas se utilizó para medir fragmentos con una circularidad entre 0.2 y 1,0 y un tamaño entre 20 y 10,000 píxeles, y la herramienta Medir se utilizó para determinar el área total de neuritas.

Los valores sobre el área de neuritas fragmentada y el área de neuritas total se transfirieron a una hoja de cálculo en Microsoft Excel y se utilizó una operación matemática en Excel para calcular las puntuaciones DI. Después de abrir una imagen con ImageJ, se midió el tiempo necesario para realizar manualmente cada uno de estos procedimientos. Los tiempos promedio de análisis se calcularon a partir de 36 imágenes en total. Las imágenes se obtuvieron de nueve preparaciones de cultivos celulares independientes y los análisis se realizaron utilizando una imagen por condición de tratamiento de cada preparación de cultivo celular. Para determinar la velocidad de las mediciones DI realizadas con la macro ANDI, se utilizaron los mismos conjuntos de imágenes para determinar el tiempo necesario para abrir la macro en ImageJ, ejecutar las operaciones de la macro, transferir los datos a una hoja de cálculo de Excel y calcular el DI.

Estadísticas

Las comparaciones cuantitativas se presentan como diagramas de caja y bigotes, donde la línea media representa la mediana, los cuadros se extienden hasta los percentiles 25 y 75, y los bigotes representan los percentiles 5 y 95. Las medias se compararon estadísticamente en GraphPad Prism 9.1.2 mediante ANOVA de medidas repetidas con comparaciones post hoc utilizando una corrección de Sidák. La normalidad de los datos cuantitativos se probó mediante la prueba de Shapiro-Wilk en IBM SPSS 26.

Cuando se violó el supuesto de normalidad (Figs. 1C, 3D), las comparaciones de grupos se realizaron mediante la prueba no paramétrica de Friedman y la prueba de Dunn se realizó para comparaciones post hoc. Los análisis correlacionales se representan como diagramas de dispersión e incluyen líneas de mejor ajuste. Dichas relaciones se analizaron utilizando correlaciones producto-momento de Pearson o la r de Spearman cuando se violaba el supuesto de normalidad. La normalidad de los residuos para el análisis correlacional se evaluó mediante inspección visual de los gráficos QQ correspondientes.

Los coeficientes de correlación momento-producto de Pearson se compararon entre sí mediante la prueba z asintótica de Steiger (Steiger, 1980; Lee y Preacher, 2013). No se excluyeron valores atípicos. Se aceptó significación estadística en p < 0,05. Los valores P se redondean a cuatro decimales y se informan a lo largo del texto principal. También se informan los tamaños del efecto y los intervalos de confianza del 95% para los análisis paramétricos, con los tamaños del efecto descritos a lo largo del texto principal y los intervalos de confianza enumerados en la Tabla 1.

Disponibilidad de datos

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Accesibilidad del código

El código/software descrito en el artículo está disponible gratuitamente en línea en https://github.com/kraemerb/kraemerlab. El código está disponible como Datos extendidos 1.

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