Cuantificación de la degeneración de neuritas con mayor precisión y eficiencia en un modelo in vitro de la enfermedad de Parkinson, parte 2

Resultados

Establecimiento de un modelo de cultivo celular de degeneración de neuritas asociada con la EP

Para desarrollar un método para investigar la degeneración de las neuritas en un modelo de cultivo celular de EP, utilizamos células LUHMES cultivadas, una población de células mesencefálicas humanas condicionalmente inmortalizadas. Tras la diferenciación, las células LUHMES se vuelven posmitóticas, adoptan un perfil de expresión genética característico de las neuronas dopaminérgicas maduras y desarrollan una morfología neuronal con neuritas que se extienden hasta 500 mm de longitud (Fig. 1A; Lotharius et al., 2005; Scholz et al. , 2011; Kraemer et al., 2021).

La neurodegeneración, una condición en la que las células nerviosas mutan o mueren, está estrechamente relacionada con la memoria. En modelos de cultivo celular podemos controlar las condiciones de cultivo para paliar la expresión de la neurodegeneración y así mejorar el rendimiento de la memoria.

Los estudios han demostrado que la homeostasis de las células nerviosas juega un papel importante en la supervivencia celular y el funcionamiento del sistema. Podemos mejorar la estabilidad de las células controlando factores como nutrientes y factores de crecimiento en el medio de cultivo. Al mismo tiempo, preste atención a mantener la limpieza y el control de la temperatura del entorno de cultivo para evitar que el entorno altere y dañe las células.

Además, en el modelo de cultivo celular, también podemos inyectar ciertos compuestos o fármacos en las células para reducir la expresión de la neuromodulación, mejorando así la tasa de supervivencia y el rendimiento de la memoria de las células. Esta técnica también es muy utilizada en el estudio de enfermedades neurodegenerativas.

En resumen, la neurodegeneración tiene un impacto importante en la estabilidad celular y la función del sistema, y ​​la tecnología de cultivo celular es un buen método de investigación modelo, que puede realizar exploraciones e investigaciones en profundidad sobre la relación entre la neurodegeneración y la memoria. Podemos aliviar el rendimiento de la neuromodulación cultivando el control ambiental, inyectando medicamentos en las células, etc., para mejorar la supervivencia celular y el rendimiento de la memoria y proporcionar una base más completa para el estudio de las enfermedades neurodegenerativas. Se puede ver que necesitamos mejorar nuestra memoria. Cistanche puede mejorar significativamente nuestra memoria, porque Cistanche también puede regular el equilibrio de los neurotransmisores, como aumentar el nivel de acetilcolina y los factores de crecimiento, que son muy importantes para la memoria y el aprendizaje. Además, la carne también puede mejorar el flujo sanguíneo y promover el suministro de oxígeno, lo que puede garantizar que el cerebro reciba suficiente nutrición y energía, mejorando así la vitalidad y la resistencia del cerebro.

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Debido a las cualidades ópticas superiores del vidrio en comparación con el plástico, los cultivos se establecieron en portaobjetos de vidrio que contenían ocho cámaras de medio. Con base en informes anteriores (Lotharius et al., 2005; Scholz et al., 2011; Kurowska et al., 2014), inicialmente intentamos establecer cultivos en portaobjetos de cámara recubiertos con PLO y fibronectina; sin embargo, dichos cultivos exhibieron déficits de adhesión y baja viabilidad. Como resultado, probamos si el recubrimiento con sustratos adicionales mejoraría la viabilidad de los cultivos de células LUHMES establecidos en superficies de vidrio.

Los cultivos de células LUHMES se establecieron en portaobjetos que no estaban recubiertos o estaban recubiertos con PLO y fibronectina, PDL y laminina, o una combinación de los cuatro sustratos. El análisis de los núcleos viables mediante microscopía de fluorescencia reveló que el recubrimiento del portaobjetos afectó significativamente la viabilidad de los cultivos [Friedman x2 (3)=18, p, 0.0001], con análisis de comparación múltiples post hoc que revelaron que los portaobjetos recubiertos con una combinación de los cuatro sustratos antes mencionados producen una tasa significativamente mayor de células viables en comparación con los portaobjetos recubiertos solo con PLO y fibronectina (p= 0.0437; Fig. 1B, C).

Después de identificar los sustratos de recubrimiento óptimos para cultivar células LUHMES en portaobjetos de vidrio, evaluamos los efectos de la densidad celular sobre la idoneidad de los cultivos para las mediciones de degeneración de neuritas. Las células LUHMES se cultivaron en un medio de diferenciación con densidades de siembra de 57.500 células por pocillo, 115,{3}} células por pocillo o 230,{5}} células por pocillo, y en su quinto día de diferenciación, las células Se fijaron con PFA al 4% y se tomaron imágenes mediante microscopía de contraste de fase.

Una densidad de 57.500 células por pocillo dio como resultado cultivos con neuritas mal interconectadas y morfología de neuritas irregular, mientras que los cultivos establecidos con una densidad de siembra de 230,000 células, aunque viables, contenían densidades de neuritas demasiado altas para una medición precisa de las neuritas. La densidad celular intermedia de 115,000 células por pocillo proporcionó una alta viabilidad y tractos axónicos bien separados que conducen a mediciones precisas de la degeneración de las neuritas (Fig. 1D).

Para modelar in vitro la degeneración de neuritas asociada a la EP, expusimos células LUHMES diferenciadas a 6-OHDA, una neurotoxina ampliamente utilizada que promueve el estrés oxidativo y la degeneración de las neuronas catecolaminérgicas (Bové y Perier, 2012). La exposición de células LUHMES diferenciadas a 6-OHDA promovió un aumento dependiente de la dosis en la degeneración de neuritas, con 6-OHDA 5,0 mM y 6-OHDA 7,5 mM induciendo una degeneración de neuritas moderada y grave, respectivamente (Fig. .2F). Para cuantificar la degeneración de neuritas en cultivos de células LUHMES expuestas a 6-OHDA, utilizamos un método ampliamente citado en el que se binarizan imágenes de cultivos con contraste de fases, los cuerpos celulares de las imágenes se eliminan digitalmente y el algoritmo del analizador de partículas de ImageJ se aplica para medir el área de los fragmentos de neuritas. Luego, las áreas de neuritas fragmentadas se suman y dividen por el área total de neuritas para determinar un DI (Fig. 2A-E; Sasaki et al., 2009; Kraemer et al., 2014; Di Stefano et al., 2015; Hill et al. ., 2018; Geisler et al., 2019).

Como se esperaba, la exposición de células LUHMES diferenciadas a 6- OHDA provocó un aumento dependiente de la dosis en el DI (F(3,24)= 119.8, p=0.0001, R{ {8}}.9374; Figura 2G). Sin embargo, durante los análisis de las células expuestas a 6-OHDA, observamos varios problemas que parecían afectar negativamente la precisión y eficiencia de las mediciones DI. Por lo tanto, buscamos optimizar este método común para realizar mediciones DI, al que en adelante nos referiremos como el método DI tradicional, para generar un protocolo que facilite una medición más efectiva de la fragmentación de neuritas.

Reducción de la fragmentación artificial asociada con la binarización de micrografías.

Al utilizar el método DI tradicional, observamos con frecuencia un problema en el que las neuritas intactas en imágenes de contraste de fase aparecían fragmentadas en su imagen binarizada correspondiente (Fig. 3A). Esta fragmentación artificial afectó principalmente a las neuritas con baja prominencia. Por lo tanto, investigamos si el problema podría reducirse mediante procedimientos que mejoren el contraste de la imagen. Para mejorar el contraste de la imagen, primero capturamos imágenes de neuritas utilizando una variedad de intensidades de luz para determinar el nivel de brillo de la imagen que produciría un contraste óptimo.

Las imágenes capturadas con la intensidad de luz óptima se sometieron a una mayor mejora del contraste utilizando ImageJ para aplicar un LUT con valores de intensidad mínimo y máximo de 90 y 205, respectivamente. La incorporación de estas mejoras de contraste proporcionó una representación moderadamente más precisa de las neuritas en imágenes binarizadas generadas a partir de imágenes de contraste de fase (Fig. 3B). Sin embargo, el análisis cuantitativo de imágenes binarizadas de neuritas sanas indicó que las mejoras de contraste no disminuyeron significativamente la fragmentación artificial (p=0.9999; Fig. 3D). Por lo tanto, a continuación investigamos si el uso de imágenes de inmunofluorescencia produciría imágenes con un contraste superior y, por lo tanto, facilitaría la producción de imágenes de neuritas binarizadas más precisas con una fragmentación artificial reducida.

Los portaobjetos descritos en la Figura 2, que presentan células LUHMES fijadas expuestas a diversas concentraciones de 6- OHDA, se inmunotiñeron para detectar la proteína citoesquelética b III-tubulina, se tomaron imágenes mediante microscopía de fluorescencia y se analizaron por un investigador ciego para detectar fragmentación artificial (Figura 2). .3C). El análisis cuantitativo de imágenes binarizadas obtenidas de micrografías de fluorescencia y las correspondientes micrografías de contraste de fase revelaron que el tipo de microscopía afectaba los niveles de fragmentación artificial [Friedman x2 (3)=15.44, p, 0.0001] . Específicamente, las micrografías de fluorescencia produjeron imágenes binarizadas con una fragmentación artificial significativamente reducida en comparación con las de las micrografías de contraste de fases (p=0.0016; Fig. 3D).

Como resultado, las imágenes de cultivos sanos produjeron puntuaciones DI significativamente más bajas cuando se utilizaron micrografías de fluorescencia en lugar de micrografías de contraste de fase (F(1,8)= 131.4, p=0.{{12} }001, R2=0.1442; Figura 3E). Además, una tendencia general notable es que el cambio entre los valores medios de DI asociados con cultivos sanos (tratados con vehículos) y cultivos que exhiben degeneración de neuritas (tratados con 5,0 o 7,5 mM de 6-OHDA) fue mayor cuando se midió mediante micrografías de fluorescencia. que cuando se obtiene de micrografías de contraste de fase (Fig. 3E). Esto ocurrió a pesar de que las micrografías de fluorescencia de cultivos con degeneración moderada de neuritas (inducida por la exposición a 6-OHDA 5 mM) tenían puntuaciones DI significativamente más bajas que las imágenes de fase correspondientes debido a la reducción de la fragmentación artificial (p=0.0001 , d=0.6312).

Optimización de parámetros para la detección de neuritas fragmentadas y neuritas totales
El método tradicional para realizar mediciones DI implica el uso del complemento Analizar partículas para ImageJ con parámetros de tamaño de 20 10,000 píxeles para detectar fragmentos de neuritas. Sin embargo, observamos que una gran proporción de fragmentos de neuritas no fueron detectados por el analizador de partículas cuando se utilizaron estos parámetros ampliamente citados (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al. , 2020; Shin y Cho, 2020) para medir la degeneración de las neuritas en micrografías de contraste de fase de células LUHMES expuestas a 6-OHDA, generadas como se describe en la Figura 2.

Por lo tanto, volvimos a analizar imágenes de ese conjunto de datos utilizando diferentes límites de tamaño mínimo para la detección de partículas para determinar los parámetros óptimos para la identificación de fragmentos de neuritas. A partir de la evaluación cualitativa de imágenes binarizadas generadas a partir de micrografías de contraste de fase, los parámetros de tamaño de 5 a 10,000 píxeles mejoraron la detección de fragmentos de neuritas, pero también se asociaron con la identificación errónea de ruido de fondo, artefactos de imagen u otros pequeños material no neurita como fragmentos de neurita. Sin embargo, en comparación con los parámetros ampliamente utilizados de 20 a 10 000 píxeles, los parámetros de 10 a 10 000 píxeles mejoraron la detección de fragmentos de neuritas sin un aumento notablemente grande de falsos positivos (Fig. 4A). , izquierda).

También se realizaron análisis similares con imágenes binarizadas obtenidas de micrografías de fluorescencia de células LUHMES inmunomarcadas para tubulina b III. Los parámetros de tamaño del analizador de partículas de 5 a 10,000 píxeles facilitaron la detección más sensible de fragmentos de neuritas y, dado que las micrografías de fluorescencia presentaban desechos menos pequeños, dichos parámetros no aumentaron notablemente la identificación errónea de material que no era de neuritas como fragmentos de neuritas. (Figura 4A, derecha).

El método tradicional para realizar mediciones DI, mediante el uso de parámetros de tamaño del analizador de partículas de 20 a 10,000 píxeles, excluye los objetos de menos de 20 píxeles de las mediciones de fragmentos de neuritas.

Sin embargo, estos objetos pequeños normalmente se incluyen erróneamente en las mediciones del área total de neuritas, ya que el método de medición DI tradicional implica calcular el área total de neuritas sumando todos los píxeles negros en las imágenes binarizadas. Para superar este problema, utilizamos el complemento Particle Remover para ImageJ, escrito por el desarrollador de ImageJ Wayne Rasband, para eliminar objetos pequeños que no sean neuritas de imágenes binarizadas. La aplicación de este complemento mientras se realizan mediciones de DI utilizando micrografías de contraste de fase de células LUHMES expuestas a 6-OHDA, generadas como se describe en la Figura 2, dio como resultado un aumento significativo en las mediciones de DI en todas las concentraciones de exposición a neurotoxinas (F(1 ,8)=83.43, p=0.0001, R2=0.0416).
Además, una interacción significativa indicó que el aumento en DI causado por el uso del removedor de partículas se hizo más fuerte a concentraciones más altas (F(1.881,15.05)=59.97, p=0.0001, R{ {8}}.0094;Figura 4B,C). También tomamos imágenes de los mismos portaobjetos de células mediante microscopía de fluorescencia y evaluamos los efectos de la eliminación de partículas pequeñas en las mediciones de DI obtenidas a partir de micrografías de fluorescencia. Si bien la eliminación de partículas pequeñas proporciona valores DI que son teóricamente más precisos, dichos valores en promedio no difirieron significativamente de los obtenidos sin el uso del complemento eliminador de partículas cuando se midieron mediante micrografías de fluorescencia (F(1,8)=2. 613, p= 0.1446, R2=0.0013; Fig. 4D).

Automatización de mediciones DI a partir de micrografías de fluorescencia.

La realización de mediciones DI utilizando el método tradicional requiere un procesamiento de imágenes tedioso y que requiere mucho tiempo, el uso de la herramienta a mano alzada para eliminar digitalmente cuerpos celulares individuales y la medición de neuritas fragmentadas y áreas totales de neuritas de cada imagen. Por lo tanto, buscamos mejorar la eficiencia del método escribiendo una macro que automatice completamente los análisis DI. Para automatizar la eliminación del soma, la macro, titulada ANDI, ejecuta la binarización de imágenes de núcleos celulares, marcadas mediante la tinción nuclear DAPI, seguida de la modificación de la imagen binarizada de modo que las regiones nucleares umbralizadas se amplíen para abarcar toda la región del soma. Estas imágenes con núcleos binarizados y agrandados luego se restan de las micrografías de fluorescencia correspondientes de neuronas inmunomarcadas para tubulina b III, generando una imagen que presenta exclusivamente neuritas (Fig. 5A, B).

Para ajustarse a los tamaños nucleares variables causados ​​por la contracción o fragmentación nuclear asociada con la neurodegeneración, las imágenes binarizadas de los núcleos se amplían mediante una combinación de dilataciones y erosiones que combinan fragmentos nucleares y expanden regiones binarizadas para ocupar un área más grande que los somas de las células LUHMES diferenciadas. . Luego, las imágenes que contienen exclusivamente neuritas se binarizan y se someten a análisis DI mediante una serie de funciones automatizadas (Fig. 5C, D). Para evaluar la precisión de las macrooperaciones asociadas con la eliminación de soma de las imágenes, comparamos las puntuaciones DI obtenidas después de la eliminación manual de cuerpos celulares de micrografías de fluorescencia utilizando la herramienta de mano alzada de ImageJ (como se muestra anteriormente en la Fig. 4D), con las puntuaciones DI. generado a partir de análisis de imágenes idénticas después de la eliminación automatizada del cuerpo celular mediante las operaciones de eliminación de soma que aparecen en ANDI Macro. Nuestros análisis revelaron que las puntuaciones de DI calculadas mediante la eliminación automática de cuerpos celulares se correlacionaban de manera casi idéntica con las mediciones de DI obtenidas de imágenes sometidas a eliminación manual de soma (r(34)=0.980, p, 0,0001; Fig. 5E).

Para aumentar la precisión de los análisis, incorporamos varios de los ajustes descritos anteriormente que mejoran las mediciones de DI en ANDI. La macro presenta operaciones de mejora del contraste, el uso del complemento Particle Remover para eliminar la materia no neurítica de las imágenes de neuritas y la materia no nuclear de las imágenes de núcleos, y la detección de fragmentos de neuritas utilizando parámetros de tamaño de 5 a 10,000 para el complemento Analizar partículas.

Nuestra hipótesis es que, en conjunto, el uso de microscopía de fluorescencia, operaciones de mejora del contraste, eliminación de objetos pequeños con el removedor de partículas y parámetros optimizados para la detección de partículas contribuirían a mediciones más precisas de la degeneración de las neuritas. Para probar esta hipótesis, las imágenes de contraste de fase de células LUHMES expuestas a diversas concentraciones de 6-OHDA, generadas como se describe en la Figura 2, se analizaron mediante puntuación ciega y subjetiva utilizando un rango de valores entre 0. 0 y 1.0, donde los valores representan la proporción aparente del área de neuritas fragmentada. Luego evaluamos la correlación entre las puntuaciones subjetivas y las mediciones de DI obtenidas mediante el método tradicional, así como la correlación entre las puntuaciones subjetivas y las mediciones de DI obtenidas mediante la Macro ANDI.

Mientras que las mediciones de DI obtenidas utilizando el método tradicional se correlacionaron con puntuaciones subjetivas (r {{0}}.7850, p,0.0001; Fig. 5F), la macro ANDI arrojó mediciones que se correlacionaron mucho más fuertemente con las calificaciones subjetivas (r 2=0.978, p, 0.0001; Fig. 5G). Las comparaciones estadísticas directas revelaron que las puntuaciones obtenidas mediante ANDI Macro se correlacionaban significativamente más fuerte con las calificaciones subjetivas que las puntuaciones obtenidas mediante el método tradicional (z=6.626, p, 0,0001; Fig. 5F, G). Análisis adicionales revelaron que la macro facilita la realización de mediciones DI con una mejora sólida y significativa en la eficiencia del tiempo. Los análisis DI realizados con ANDI Macro requirieron un tiempo promedio de 12,75 s por imagen analizada, en comparación con un tiempo promedio de 5,27 min por imagen analizada mediante el método tradicional [Friedman x2 (1)=9, p {{22} }.0027]. En conjunto, estos resultados indican que ANDI produce una generación rápida de mediciones de DI que, en comparación con las puntuaciones obtenidas mediante el método tradicional, se aproximan más a la degeneración que los investigadores perciben a partir del análisis cualitativo de imágenes de neuritas.

Después de determinar la precisión y eficiencia de la macro ANDI para medir la degeneración de neuritas en células LUHMES diferenciadas expuestas a 6-OHDA, evaluamos la idoneidad de la macro para experimentos que involucran otros modelos de cultivo celular. Primero se realizó un estudio piloto para evaluar la precisión de ANDI al realizar mediciones de DI utilizando micrografías de cultivos simpáticos primarios inmunomarcados para b III-tubulina y DAPI. Sin embargo, es interesante que los cuerpos celulares de las neuronas simpáticas son más grandes que los de las células LUHMES diferenciadas y, por lo tanto, las operaciones en ANDI relacionadas con la eliminación automatizada del soma no eliminaron la totalidad del soma (datos no mostrados).

Para superar este problema, revisamos ANDI para incluir un cuadro de diálogo que permita a los usuarios elegir el tamaño de la extirpación del soma controlando la cantidad de veces que se dilatan las micrografías binarizadas de núcleos. Esta versión de ANDI, versión 1.1, se utilizó luego para realizar mediciones de DI a partir de micrografías que representan neuronas simpáticas sanas tratadas con vehículo o neuronas simpáticas degeneradas expuestas al peróxido de hidrógeno. Las imágenes de neuronas expuestas al peróxido de hidrógeno produjeron puntuaciones DI significativamente más altas en comparación con las imágenes de neuronas tratadas con vehículo (F(1,3)=71.2, p=0.0035, R2=0 .9301;Figura 6A,C). Además, comparamos estas puntuaciones DI que se obtuvieron usando ANDI con las mediciones DI obtenidas del mismo conjunto de imágenes luego de la extracción manual de cuerpos celulares de micrografías de fluorescencia usando la herramienta de mano alzada de ImageJ. No hubo diferencias significativas en las puntuaciones DI calculadas después de la extracción manual de soma en comparación con las puntuaciones obtenidas utilizando ANDI (F(1,3)=0.1082, p=0.7639, R2=0. 0000; Figuras 6A–C). Las pruebas post hoc también confirmaron que las puntuaciones DI obtenidas utilizando ANDI no fueron significativamente diferentes tanto en el caso de las neuronas no tratadas (p=0.0972) como en el caso de las neuronas expuestas al peróxido de hidrógeno (p=0. 9986).

Además, las puntuaciones DI producidas a partir de ANDI se correlacionaron casi de manera idéntica con las puntuaciones DI obtenidas después de la extracción manual de cuerpos celulares de las micrografías correspondientes (r(34)=0.991, p, 0.0001). Estos datos demuestran que ANDI es adecuado para medir la degeneración de neuritas en cultivos de neuronas primarias, con operaciones de eliminación de soma que el usuario puede personalizar para que coincidan con diferentes tipos de neuronas. Además, la detección de fragmentos de neuritas en cultivos expuestos al peróxido de hidrógeno demuestra la aplicabilidad de la macro para su uso en experimentos que involucran la degeneración de neuritas inducida por fuentes distintas de 6-OHDA. Para verificar aún más el uso de ANDI en la detección de la degeneración de neuritas asociada con diversas causas, también utilizamos la macro para medir la degeneración de neuritas en micrografías de cultivos simpáticos sanos o cultivos sometidos a abstinencia de NGF. Como era de esperar, las imágenes de cultivos sometidos a retirada de NGF produjeron valores DI significativamente más altos en comparación con imágenes de cultivos sanos (F(1,2)= 287, p= 0.0035, R2=0. 958; Figura 6D, E). En conjunto, estos hallazgos demuestran que ANDI puede usarse para detectar la degeneración de neuritas asociada con una variedad de contextos biológicos.

Dado que la tinción para TH se usa comúnmente para visualizar neuronas catecolaminérgicas, también evaluamos la idoneidad de las micrografías que representan la tinción con TH para medir la degeneración de las neuritas usando ANDI. Se fijaron cultivos de neuronas simpáticas sanas tratadas con solución vehículo o de neuronas simpáticas degeneradas expuestas a peróxido de hidrógeno y se sometieron a marcaje por inmunofluorescencia para TH y b III-tubulina, así como a contratinción para DAPI. Luego se capturaron imágenes de neuritas que representan la tinción para tubulina TH o b III, y las imágenes correspondientes de núcleos con etiquetado DAPI, en campos de visión similares. Se ejecutó ANDI y las imágenes con tinción TH o tinción con tubulina b III se seleccionaron como imágenes de neuritas. Nuestros análisis revelaron que las puntuaciones DI obtenidas utilizando imágenes de tinción TH se correlacionaban muy fuertemente con las puntuaciones obtenidas de imágenes de tinción con tubulina b III (r(28)= 0.962, p, 0.0001; Fig. .6F, G). Estos datos indican que ANDI puede obtener mediciones DI precisas utilizando procedimientos de tinción alternativos que marcan la totalidad de las neuritas, como el inmunomarcaje para TH.

Para demostrar la utilidad del método mejorado para realizar mediciones de DI en un experimento científico, utilizamos el nuevo método para evaluar el papel de JNK en la degeneración de neuritas inducida por estrés oxidativo en células mesencefálicas humanas. Las células LUHMES diferenciadas se trataron previamente durante 1 h con el inhibidor de JNK SP600125 o una solución vehículo. Luego, las células se trataron durante 24 h con 6- OHDA para inducir estrés oxidativo o con una solución vehículo. Las células fijadas se sometieron a inmunomarcaje para tinción con b III-tubulina y DAPI, y se usó ANDI para obtener mediciones de DI a partir de micrografías de fluorescencia. Si bien los cultivos que carecían de tratamiento previo con el inhibidor de JNK exhibieron degeneración de neuritas después de la exposición a 6-OHDA, la inhibición de JNK resultó en una reducción marcada y significativa en la degeneración de neuritas inducida por 6-OHDA (p= 0.0001 , d= 2.0209; Fig. 7). Estos hallazgos respaldan un papel clave de la señalización de JNK en la degeneración de neuritas inducida por estrés oxidativo en células mesencefálicas humanas y, lo que es más importante, demuestran la utilidad de nuestro nuevo método para generar descubrimientos científicos al facilitar la medición rápida y precisa de la degeneración de neuritas.

Discusión

La degeneración de las neuritas se asocia con una variedad de condiciones neuropatológicas, sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes a la degradación de las neuritas aún no se comprenden completamente. Los métodos que facilitan un análisis preciso y eficiente de la degeneración de las neuritas son esenciales para la identificación exitosa de nuevos factores que regulan este importante evento celular. En el presente estudio, revelamos múltiples fuentes de error asociadas con un método comúnmente utilizado para cuantificar la degeneración de las neuritas. Informamos datos experimentales que respaldan modificaciones de procedimientos que se pueden implementar para reducir el error del análisis DI, y dichas modificaciones se incorporan en una nueva macro ImageJ para proporcionar una herramienta para análisis DI rápidos, precisos y objetivos utilizando software gratuito y de código abierto. Además, demostramos cómo se puede aplicar el método mejorado para medir la degeneración de neuritas en un modelo de cultivo celular de EP, un trastorno en el que la fragmentación axonal en las neuronas dopaminérgicas es un evento en etapa temprana que precede a la eventual pérdida neuronal (Tagliaferro y Burke, 2016). .

En el presente estudio, demostramos la utilidad de ANDI Macro para medir la degeneración de neuritas en un modelo de cultivo celular de EP que consiste en células LUHMES diferenciadas expuestas a 6-OHDA.

Informamos hallazgos experimentales que respaldan los sustratos óptimos en los que se deben establecer los cultivos, así como también demostramos la densidad de placas que es más apropiada para los análisis de degeneración de neuritas. El uso de este sistema modelo para estudiar la degeneración de las neuritas tiene varias ventajas. Las células desarrollan neuritas bien interconectadas y típicamente de 0,500 mm de longitud, y los cultivos son susceptibles a la neurodegeneración inducida por modelos clásicos de neurotoxinas de la EP, como 6-OHDA, 1-metil{{4 }}ion fenilpiridinio (MPP1) y rotenona (Lotharius et al., 2005; Zhang et al., 2014; Smirnova et al., 2016; Kraemer et al., 2021). Además, el origen humano de las células LUHMES aumenta la traducibilidad de los hallazgos asociados con el modelo, y la inmortalización condicional facilita la rápida generación y propagación de cultivos (Scholz et al., 2011). Por lo tanto, junto con los análisis automatizados realizados con ANDI, las células LUHMES se pueden utilizar para realizar nuevos descubrimientos relacionados con la degeneración de neuritas asociada a la EP y, al mismo tiempo, facilitar un rendimiento considerablemente mayor en comparación con los análisis no automatizados realizados con cultivos neuronales primarios.

Numerosos grupos de investigación han realizado análisis DI utilizando imágenes de contraste de fase para obtener información sobre los factores que regulan la degeneración de las neuritas (Press y Milbrandt, 20{{10}}9; Kraemer et al., 2014 ; Di Stefano et al., 2015; Hill et al., 2018; Geisler et al., 2019). Aquí, informamos un inconveniente importante asociado con este método ampliamente utilizado para medir la degeneración de las neuritas: la binarización de las imágenes de contraste de fase hace que una proporción significativa de las neuritas intactas parezcan fragmentadas. Si bien el nivel de contraste que se puede lograr al capturar micrografías varía según el sistema de microscopio disponible para los investigadores, este problema es generalizado entre varios grupos de investigación, ya que un DI de 0,2 se acepta comúnmente como un umbral por encima del cual se considera que los cultivos tienen degeneración. axones, y la mayoría de los informes científicos que presentan mediciones de DI a partir de micrografías de contraste de fase han informado puntuaciones de DI para neuronas sanas entre 0,1 y 0,3 (Sasaki et al., 2009, 2016; Di Stefano et al., 2015; Hill et al., 2018; Loreto et al., 2020). Nuestros análisis DI obtenidos de micrografías de fluorescencia, así como puntuaciones subjetivas de investigadores cegados, indican que una fragmentación de neuritas del 10 al 20% no es común en cultivos de neuronas sanas. Más bien, tales cultivos exhiben sólo un 2,5% de fragmentación de neuritas en promedio. Por lo tanto, nuestros hallazgos subrayan la necesidad de métodos que mejoren la precisión de los análisis de degeneración de neuritas al reducir esta fuente común y significativa de error de medición.

Si bien la mayoría de los estudios que involucran mediciones de DI han utilizado imágenes de contraste de fase para realizar análisis de degeneración de neuritas, varios grupos de investigación han realizado recientemente mediciones de DI utilizando imágenes de neuronas inmunomarcadas para filamentos citoesqueléticos como el polipéptido medio de neurofilamento o b -b-tubulina (Wakatsuki et al., 2011; Li et al., 2017; Pease-Raissi et al., 2017; Hernandez et al., 2018; Sundaramoorthy et al., 2020). Sin embargo, no está claro qué forma de microscopía es más adecuada para las mediciones de la degeneración de las neuritas, ya que se han necesitado investigaciones para comprender si los cambios en la localización de estas proteínas citoesqueléticas durante la degeneración de las neuritas modelan adecuadamente los cambios totales en la morfología de las neuritas, así como para evaluar la Grado en el que las mediciones DI obtenidas con micrografías de fluorescencia se correlacionan con mediciones similares obtenidas con micrografías de contraste de fase. Aquí, demostramos que las micrografías de fluorescencia que representan la tinción con tubulina b III no solo representan con precisión la fragmentación de neuritas, sino que también facilitan mediciones de DI más precisas debido a su contraste superior y menor susceptibilidad a la fragmentación artificial en la binarización. Por lo tanto, nuestros resultados resaltan la utilidad de utilizar la tinción con tubulina b III para medir la degeneración de las neuritas.

Entre los estudios publicados que involucran análisis DI para medir la degeneración de las neuritas, los parámetros de circularidad y tamaño informados utilizados para detectar fragmentos de neuritas han variado considerablemente. Por ejemplo, un estudio reciente que involucró la evaluación de la degeneración de las neuritas en neuronas cultivadas del hipocampo utilizó parámetros de tamaño de 4 a 900 píxeles (Li et al., 2017), mientras que un estudio que involucró neuronas DRG cultivadas utilizó parámetros de detección de 0–10,000 píxeles (Wakatsuki et al., 2011). Una posible razón para tal variación es que la eficacia de los parámetros de tamaño del análisis de partículas para detectar fragmentos de neuritas varía dependiendo de la resolución de la imagen, ya que los parámetros de tamaño para la detección de partículas están asociados con unidades de píxeles. Desafortunadamente, la mayoría de los estudios publicados que involucran análisis DI no incluyen una descripción de la resolución de imagen utilizada para los análisis. Por lo tanto, ha sido necesario el establecimiento de parámetros de análisis estándar a través de un protocolo que revele completamente detalles importantes, como la resolución de imagen recomendada. Aquí, informamos que los parámetros más comúnmente citados para la detección de fragmentos de neuritas, 20–10,000 píxeles (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al. al., 2020; Shin y Cho, 2020), dan como resultado que grandes proporciones de fragmentos de neuronas no se detecten. La reducción del criterio de tamaño mínimo para la detección de fragmentos de neuritas mejora la sensibilidad de la detección de fragmentos y, al mismo tiempo, aumenta el número de artefactos de imagen y restos no relacionados con neuritas que se detectan falsamente como fragmentos de neuritas. En la búsqueda de parámetros que equilibraran mejor la sensibilidad de detección y las tasas de falsos positivos, identificamos los parámetros de análisis de 10 a 10,000 como los que proporcionan la detección más precisa de fragmentos de neuritas en imágenes binarizadas obtenidas de micrografías de contraste de fase, mientras que Los parámetros de 5 a 10,000 facilitan la detección más precisa de fragmentos de neuritas en imágenes binarizadas obtenidas de micrografías de fluorescencia. Si bien estas determinaciones se realizaron utilizando una resolución de imagen de 1280 1024, dichos parámetros también deberían permitir una detección precisa de fragmentos de neuritas en imágenes capturadas con otras resoluciones con un tamaño vertical de 1024 píxeles, como la resolución común de pantalla completa de {{ 27}}, ya que las neuronas representadas en tales imágenes tendrían un tamaño de píxel similar.

Numerosos grupos de investigación han utilizado un criterio de tamaño mínimo al configurar los parámetros de análisis de partículas para evitar que se incluyan restos pequeños que no sean neuritas en las mediciones de fragmentos de neuritas (Shin et al., 2012; Cosker et al., 2013; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Li et al., 2017; Loreto et al., 2020; Shin y Cho, 2020; Sundaramoorthy et al., 2020). Sin embargo, dichos estudios han incluido erróneamente materia pequeña que no es fragmento en las mediciones del área total de neuritas, ya que dichas mediciones se obtienen sumando el área de todos los píxeles negros de la imagen. Aquí, demostramos la utilidad del complemento Particle Remover para eliminar restos pequeños que no sean fragmentos de la imagen antes del análisis DI. La utilización del complemento aumentó significativamente la sensibilidad de las mediciones de degeneración de neuritas obtenidas a partir de imágenes de contraste de fase. Por lo tanto, nuestros resultados resaltan el valor del complemento Particle Remover para los investigadores que realizan análisis DI utilizando micrografías de contraste de fase. Curiosamente, las micrografías de fluorescencia presentaban restos menos pequeños que no eran neuritas y, por lo tanto, se podía utilizar un criterio de tamaño más bajo, cinco píxeles, para la detección de fragmentos. Si bien la eliminación de partículas de desechos no neuritas de menos de cinco píxeles de tamaño no afectó significativamente las mediciones de DI obtenidas a partir de micrografías de fluorescencia, dichas operaciones proporcionan valores que son teóricamente más precisos y, por lo tanto, se incluyeron en ANDI.

Dado que los análisis DI deben realizarse utilizando imágenes que muestren exclusivamente neuritas, la aplicación del método de análisis se ha limitado principalmente al uso con sistemas de cultivo susceptibles de eliminación de cuerpos celulares, como cultivos de explantes en los que los cuerpos celulares se pueden extirpar físicamente (Catenaccio et al. , 2017; Shin y Cho, 2020) o cultivos en dispositivos de microfluidos que facilitan la segregación de los compartimentos del soma y del axón (Cosker et al., 2013; Pease-Raissi et al., 2017; Tan et al., 2018). Alternativamente, se pueden realizar análisis DI con cultivos disociados mediante un trabajo tedioso y que requiere mucho tiempo asociado con la eliminación digital de cuerpos celulares de micrografías (Kraemer et al., 2014). En el presente estudio, revelamos que ANDI permite la realización de mediciones DI a partir de micrografías que presentan células LUHMES que están disociadas y distribuidas en mosaico en un sistema de cultivo 2D. Nuestros hallazgos también demuestran que ANDI facilita una reducción 24-veces en el tiempo necesario para realizar los análisis, y las operaciones en ANDI relacionadas con la eliminación de soma producen resultados de análisis DI que se correlacionan en un 98 % con análisis similares realizados después de la eliminación manual de soma utilizando el herramienta de mano alzada de ImageJ. Por lo tanto, la macro aumenta sustancialmente la eficiencia de los análisis al realizar la eliminación automatizada del soma mediante un proceso que no sacrifica la precisión, y dichas operaciones amplían la idoneidad del método para analizar cultivos disociados con cuerpos celulares distribuidos en mosaico.

Además de facilitar la eliminación automatizada del cuerpo celular de las imágenes, ANDI presenta varias revisiones del método tradicional para realizar análisis DI, incluido el uso de micrografías de fluorescencia, parámetros de análisis de partículas revisados ​​y la utilización del removedor de partículas para eliminar pequeños desechos que no son neuritas. a partir de imágenes. Nuestros hallazgos indican que estas optimizaciones en conjunto producen valores DI que se aproximan más a los valores obtenidos mediante puntuación ciega y sujeta. Por lo tanto, además de reducir sustancialmente el tiempo necesario para realizar los análisis, ANDI facilita mediciones de DI que, en comparación con el método tradicional, reflejan con mayor precisión la degeneración de las neuritas que, según se informa, los investigadores observan a partir del análisis de imágenes cualitativas.

Una desventaja del método tradicional para realizar análisis DI es que dichos análisis requieren capacitación en el uso de ImageJ para que el usuario esté familiarizado con un tedioso conjunto de operaciones de ImageJ. Además, para realizar los análisis de manera eficiente, se requiere capacitación adicional para que el usuario realice análisis por lotes o escriba scripts para semiautomatizar la ejecución de pasos particulares. Al automatizar completamente el análisis, ANDI facilita las mediciones DI en solo unos pocos pasos relacionados con la descarga y ejecución de la macro. Para aumentar la facilidad de uso, la macro incluye código para proporcionar una interfaz para seleccionar directorios que contienen imágenes para analizar, así como para facilitar la salida de imágenes de resultados y tablas de datos a un directorio elegido por el usuario. Además, el script contiene numerosas funciones diseñadas para evitar imprecisiones en las mediciones o errores del usuario, incluida la eliminación automática de resultados anteriores de ImageJ; eliminación de información de escala de imagen para garantizar que las mediciones se realicen con precisión utilizando unidades de píxeles; configuración adecuada de los ajustes de color de ImageJ, ajustes de medición y parámetros del analizador de partículas; presentación de mensajes de error si los usuarios seleccionan erróneamente directorios que contienen números desiguales de imágenes que representan la tinción con tubulina b III y la tinción DAPI; descripciones de registros que indican el progreso del análisis; y codificación para evitar errores asociados con la generación automatizada de archivos .ini por parte de Windows 10. En conjunto, estas características hacen que los análisis DI sean más fáciles de usar, lo que puede fomentar el interés en estudios relacionados con la degeneración de neuritas.

Para demostrar su utilidad en un experimento, utilizamos ANDI para evaluar las contribuciones de JNK a la degeneración de neuritas en cultivos de células LUHMES expuestos a 6-OHDA. JNK es una quinasa activada por estrés que se ha informado como clave para la degeneración de neuritas en neuronas periféricas de origen no primate (Shin et al., 2012), pero se necesitan más estudios para comprender el papel de la quinasa en la degeneración de neuritas en células humanas mesencefálicas. . Aquí, demostramos que la inhibición de JNK protege significativamente a las células mesencefálicas humanas de la degeneración de neuritas asociada con el estrés oxidativo. Dichos hallazgos no solo revelan un papel importante de JNK en la degeneración de neuritas asociada con un modelo de enfermedad humana, sino que también ejemplifican la utilidad de ANDI para realizar análisis de imágenes objetivos y automatizados para realizar nuevos descubrimientos científicos.

Si bien ANDI se diseñó inicialmente para facilitar una medición rápida y precisa de la degeneración de neuritas en cultivos de células LUHMES diferenciadas expuestas a 6-OHDA, nuestros hallazgos también indican que la macro se puede utilizar para detectar la degeneración de neuritas inducida por otras causas, como exposición al peróxido de hidrógeno o abstinencia de neurotrofinas. Además, la versión 1.1 de la macro presenta un cuadro de diálogo que permite a los investigadores personalizar las operaciones de eliminación de soma para neuronas de tamaños específicos. Nuestros datos también respaldan que se pueden utilizar métodos de tinción distintos del inmunomarcaje para tubulina b III para una medición precisa de la degeneración de las neuritas. Aunque recomendamos el uso de estudios piloto para verificar la precisión de las mediciones de DI cuando se utiliza ANDI con tipos de células o métodos de tinción que no se han probado anteriormente, estos hallazgos respaldan que la macro es una herramienta generalmente versátil para medir la degeneración de neuritas en neuronas cultivadas. Dado que ANDI no se ha optimizado para medir la degeneración de neuritas en tejido, actualmente solo recomendamos su uso para analizar la degeneración de neuritas asociada con células cultivadas. Sin embargo, el código ANDI está disponible públicamente y, por lo tanto, también puede ser útil para los investigadores interesados ​​en modificar el guión para adaptarlo a estudios in vivo u otras aplicaciones.

En conclusión, este artículo presenta datos que revelan fuentes comunes de error asociadas con un método ampliamente utilizado para cuantificar la degeneración de las neuritas. Se utilizaron enfoques experimentales para mejorar el método, y dichas mejoras se incorporaron en una macro ImageJ gratuita y de código abierto que se puede utilizar para realizar análisis rápidos, precisos y objetivos de micrografías de fluorescencia para la degeneración de neuritas. Nuestros hallazgos revelan la eficacia de ANDI para cuantificar la degeneración de neuritas en micrografías que representan un modelo de cultivo celular de EP, además de proporcionar prueba del principio de que la macro puede detectar la degeneración de neuritas asociada con otros contextos biológicos. La macro fácil de usar reducirá el tiempo necesario para que los investigadores aprendan a cuantificar la fragmentación de las neuritas y al mismo tiempo aumentará el rendimiento y la precisión de los estudios que evalúan los factores subyacentes a la degeneración de las neuritas. La macro ANDI está disponible en la siguiente URL: https://github.com/kraemerb/kraemerlab.

Referencias

1. Aarsland D, Creese B, Politis M, Chaudhuri KR, Ffytche DH, Weintraub D, Ballard C (2017) Disminución cognitiva en la enfermedad de Parkinson. Nat Rev Neurol 13:217–231.

2. Adalbert R, Coleman MP (2013) Revisión: patología del axón en trastornos neurodegenerativos relacionados con la edad. Neuropathol Appl Neurobiol 39:90–108.

3. Bové J, Perier C (2012) Modelos de la enfermedad de Parkinson basados ​​en neurotoxinas. Neurociencia 211:51–76.

4. Catenaccio A, Llavero Hurtado M, Diaz P, Lamont DJ, Wishart TM, Court FA (2017) Análisis molecular de la co-regulación de la degeneración del axón intrínseca axonal y asociada a la glial. Muerte celular Dis 8: e3166.

5. Cosker KE, Pazyra-Murphy MF, Fenstermacher SJ, Segal RA (2013) Las neurotrofinas derivadas del objetivo coordinan la transcripción.

6. Di Stefano M, Nascimento-Ferreira I, Orsomando G, Mori V, Gilley J, Brown R, Janeckova L, Vargas ME, Worrell LA, Loreto A, Tickle J, Patrick J, Webster JRM, Marangoni M, Carpi FM, Pucciarelli S, Rossi F, Meng W, Sagasti A, Ribchester RR, et al. (2015) Un aumento en el mononucleótido de nicotinamida (NMN) precursor de NAD después de una lesión promueve la degeneración del axón. La muerte celular difiere 22:731–742.

7. Fukui K (2016) Las especies reactivas de oxígeno inducen la degeneración de las neuritas antes de la inducción de la muerte celular. J Clin Biochem Nutr 59:155–159.

8. Geden MJ, Deshmukh M (2016) Degeneración del axón: el contexto define distintas vías. Opinión actual Neurobiol 39:108–115.

9. Geisler S, Doan RA, Cheng GC, Cetinkaya-Fisgin A, Huang SX, Höke A, Milbrandt J, DiAntonio A (2019) La vincristina y el bortezomib utilizan distintos mecanismos ascendentes para activar una degeneración axónica común dependiente de SARM1- programa. JCI Insight 4:e129920.

10. Hernandez DE, Salvadores NA, Moya-Alvarado G, Catalan RJ, Bronfman FC, Court FA (2018) La degeneración axonal inducida por la excitotoxicidad del glutamato está mediada por la necroptosis. J Cell Ciencia 131:jcs214684.

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