Un estudio proteómico cuantitativo desenmascara la vía del fibrinógeno en la enfermedad poliquística del hígado Ⅱ
Nov 22, 2023
3. Resultados
3.1. El riñón y el hígado no siguen los mismos mecanismos quísticos
Estudios anteriores demostraron que la inactivación temprana del gen Pkd1 (antes de p12) desencadena el rápido desarrollo de la enfermedad poliquística (ventana quística), mientras que la inactivación después de p14 conduce a la formación tardía de quistes después de 4 a 5 meses, con un fenotipo leve (ventana no quística) [19]. Utilizando el mismo modelo ortólogo de PQRAD (Pkd1cond/cond; Tam-Cre) [18,19], investigamos si esta ventana de desarrollo renal se correspondía en el tiempo con una ventana similar de desarrollo hepático. Para establecer una comparación directa con nuestros estudios anteriores [37], se indujo a los ratones con tamoxifeno a inactivar el gen Pkd1 en los días posnatales 14 (p14) y 12 (p12) y se sacrificaron a la edad de 30 días (p30). Curiosamente, observamos un fenotipo quístico en ambos momentos con un grado diferente de enfermedad (leve y grave), lo que sugiere que el riñón y el hígado tienen ventanas de desarrollo quístico independientes (Figura 1a) y/o posibles tiempos y progresión diferentes de la enfermedad. . No se encontraron diferencias entre machos y hembras a esta edad de sacrificio entre ambas ventanas de inactivación (se utilizó n=6 para cada grupo de mutantes). Los animales mutantes p14 presentaron un fenotipo más leve que el grupo mutante p12 con valores más bajos de índice quístico, número de quistes y función hepática según el valor sérico de ALP (Figura 1b-d). Este es el primer estudio que muestra diferentes ventanas/mecanismos de desarrollo para la deficiencia hepática y renal de Pkd1. Esas diferencias moleculares deberán determinarse en estudios futuros.
Figura 1. Caracterización del fenotipo quístico del hígado en el día 30 de las etapas p12 y p14. La eliminación de Pkd1 en p12 conlleva una cistogénesis más grave. (a) Imágenes macroscópicas y microscópicas representativas de hematoxilina-eosina teñidas de hígados de Pkd1cond/cond; ratón Tam-Cre tipo salvaje (WT, Pkd1cond/cond; Tam-Cre−) y mutante (KO, Pkd1cond/cond; Tam-Cre+ ) con deleción del gen Pkd1 inducida por tamoxifeno en el día posnatal 14 (grupo p14) y 12 (grupo p12). Todos los ratones fueron sacrificados en p30. Barra de escala, 2 mm (panel superior) 100 µm (panel inferior). n representa el número de muestras por grupo y Bd significa conducto biliar. (b,c) Índice quístico hepático y número de quistes de los diferentes fenotipos. ( d, e ) Valores de ALP y ALT en suero sanguíneo. Las barras representan medias ± SEM en todos los casos. Se consideró como resultado significativo p < 0,05 según la prueba t de Student (dos colas). ns no representa importancia. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
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3.2. Análisis proteómico de escopeta y SWATH-MS en PLD
Como se indica en la Figura 2, realizamos un análisis diferencial del proteoma en ambas etapas quísticas (p12 (enfermedad quística grave) y p14 (enfermedad quística leve) de animales mutantes (KO) en comparación con animales de tipo salvaje (WT), para identificar y caracterizar los mecanismos moleculares relevantes que experimentan cistogénesis hepática y progresión de la enfermedad.
Figura 2. Esquema de flujo de trabajo ilustrado. Utilizamos un modelo murino con ADPKD (Pkd1cond/cond; ratones Tam-Cre) en el que la inactivación genética de Pkd1 se indujo mediante la administración de tamoxifeno en el día 10 posnatal (p10) y p11 (progresión rápida de la enfermedad) o p15 y p16 (progresión retardada de la enfermedad). ) de acuerdo con el cambio de desarrollo para la cistogénesis renal, definiendo los dos grupos del estudio denominados p12 y p14 respectivamente [19]. Para ambos grupos, utilizamos una n igual o mayor que seis individuos de tipo salvaje (WT) y mutantes (KO) en cada condición, y todos los animales fueron sacrificados en p30. Estudiamos el proteoma diferencial de los hígados WT y KO en ambas gravedades de la enfermedad quística hepática (Figura 1), utilizando tanto análisis proteómico cuantitativo SWATH-MS como análisis DDA-MS de adquisición dependiente de datos de escopeta. De las proteínas con un cambio significativo en abundancia, utilizamos bioinformática. Figura 2. Esquema de flujo de trabajo ilustrado. Utilizamos un modelo murino con ADPKD (Pkd1cond/cond; ratones Tam-Cre) en el que la inactivación genética de Pkd1 se indujo mediante la administración de tamoxifeno en el día 10 posnatal (p10) y p11 (progresión rápida de la enfermedad) o p15 y p16 (progresión retardada de la enfermedad). ) de acuerdo con el cambio de desarrollo para la cistogénesis renal, definiendo los dos grupos del estudio denominados p12 y p14 respectivamente [19]. Para ambos grupos, utilizamos una n igual o mayor que seis individuos de tipo salvaje (WT) y mutantes (KO) en cada condición, y todos los animales fueron sacrificados en p30. Estudiamos el proteoma diferencial de los hígados WT y KO en ambas gravedades de la enfermedad quística hepática (Figura 1), utilizando tanto análisis proteómico cuantitativo SWATH-MS como análisis DDA-MS de adquisición dependiente de datos de escopeta. De las proteínas con un cambio significativo en abundancia, utilizamos herramientas bioinformáticas para detectar nuevas dianas terapéuticas y vías implicadas en la enfermedad. Finalmente, validamos esos objetivos utilizando estrategias primero in silico (análisis DDA vs SWATH) y finalmente in vivo, así como RT-qPCR, transferencia Western e inmunohistoquímica. p significa día posnatal
Patrón de expresión de proteínas en la cistogénesis hepática Primero, realizamos un análisis de espectrometría de masas proteómica mediante adquisición dependiente de datos de escopeta DDA-MS o DDA. Este análisis permite caracterizar el proteoma a partir de muestras completas e individuales, proporcionando la presencia/ausencia de proteínas con alta sensibilidad pero sin proporcionar su cuantificación. Consideramos exclusivamente todas las proteínas expresadas de manera diferencial en más de cinco muestras independientes de un total de seis muestras, para las etapas p14 y p12 de individuos de tipo salvaje y mutantes, respectivamente (Figura S1). En p14, se identificaron 1 proteína exclusiva de WT (o regulada negativamente para la enfermedad) y 7 proteínas exclusivas de MUT (reguladas positivamente), mientras que en p12, se observaron ocho proteínas exclusivas de WT y seis exclusivas de MUT (Figura S1).
A continuación, utilizamos un método que nos permitió cuantificar proteínas expresadas diferencialmente. Realizamos un análisis proteómico cuantitativo SWATH-MS en las mismas muestras que usamos para DDA, obteniendo ~ 1500 proteínas por muestra y más de 2000 proteínas en cada grupo de estudio. Primero, realizamos la normalización de la suma del área total (TAS) para evaluar que nuestras muestras siguieron un patrón de distribución normal, como se muestra en las Figuras S2 y S3. A continuación, estudiamos la proteína con diferencias significativas entre los grupos Wild Type y Mutant. La Tabla 1 muestra las proteínas con un cambio significativo en abundancia con un aumento doble (regulado hacia arriba) o una disminución (regulado hacia abajo) y un valor de p ajustado significativo (según la prueba t de Student paramétrica) en WT vs. Muestras MUT en p14 y p12. En total, seis proteínas mostraron diferencias significativas en la abundancia de proteínas entre los grupos WT p14 y MUT-p14 (cinco proteínas reguladas al alza y una proteína regulada a la baja). Entre WT-p12 y MUT-p12, 26 proteínas (20 proteínas reguladas positivamente y 6 proteínas reguladas negativamente) mostraron diferencias significativas (Figura 3a y Tabla 1). Gráficamente, estas variaciones se pueden observar a través de gráficos de volcanes, que se generaron trazando los cambios log(2) veces para todas las proteínas identificadas frente a su valor p −log(10) (Figura 3b). Se pueden visualizar diferencias significativas entre los niveles de abundancia de proteínas en el mapa de calor con valores individualizados según las áreas de la biblioteca espectral y su nivel de agrupación en el análisis del mapa de calor de grupos (Figuras 3c y S4). Estos grupos detectados por el análisis SWATH-MS nos ayudan a identificar aquellas muestras separadas cualitativamente, que se considerarán para el análisis cuantitativo (Figura S5). Se realizó un análisis estadístico multivariado no supervisado mediante análisis de componentes principales (PCA) para comparar los datos entre muestras (Figura S6). Los datos del mapa de calor y PCA demostraron reproducibilidad entre los triplicados de la muestra, ya que las tres réplicas se agruparon estrechamente en ambos análisis. Podemos observar tanto en el PCA como en el análisis de conglomerados del mapa de calor (Figuras S5 y S6) cómo algunas muestras no se agruparon correctamente, superponiéndose entre ambos conglomerados. No obstante, podemos ver la tendencia a separar los datos en los grupos de tipos salvajes y mutantes. La menor cantidad de proteínas con diferencias significativas en p14 frente a p12 podría justificarse por el diferente grado de gravedad (Figura 2), lo que sugiere que la cantidad de proteínas y vías aumenta según la gravedad y el estado de la enfermedad del fenotipo quístico.
3.3. Análisis de agrupación, enriquecimiento de vías y interacción proteína-proteína de la expresión genética en PLD
Para establecer la función relacionada con las proteínas expresadas diferencialmente identificadas mediante el análisis SWATH-MS, utilizamos varias herramientas bioinformáticas y formas de análisis. Los análisis de términos y rutas de ontología genética (GO) se realizaron utilizando FunRich [39,40], String [41] y Reactome [42]. Las proteínas se clasificaron en el análisis de enriquecimiento genético FunRich. En cuanto al proceso biológico, el grupo de proteínas más enriquecido para el grupo p14 (quístico leve) estuvo relacionado con el transporte de ácidos grasos y la biosíntesis de prostaglandinas, y para el grupo p12 (quístico severo) con actividad fibrinógeno/fibrina, adhesión célula-célula/matriz y metabólica. proceso (Figura 4a, panel superior). ANXA2 y el complejo de fibrinógeno fueron los dos componentes celulares más enriquecidos en los grupos p14 y p12, respectivamente. Además, el espacio extracelular fue el componente celular con mayor porcentaje de proteínas en ambos grupos (Figura 4a, panel inferior). De igual forma, se estableció el mismo análisis con análisis de cuerdas, identificando diferentes procesos metabólicos como el proceso biológico principal, y el espacio extracelular como el componente celular más enriquecido; consistente con los resultados de GO (Figura S7a). Finalmente, repetimos el análisis con la plataforma Reactome y descubrimos que el metabolismo y el sistema inmunológico fueron las vías más enriquecidas (Figura S7b).
También se realizó un análisis proteína-proteína o de grupos basado en análisis de cadenas para investigar posibles interacciones proteína-proteína (interacciones con evidencia experimental). Se identificaron numerosas interacciones de proteínas en diferentes grupos (Figura S8), pero un grupo en p14 y otro en p12 fueron los más relevantes según la cantidad de interacciones entre proteínas y el nivel de expresión (Figura 4b). El grupo p14-contiene la proteína anexina A2 (ANXA2_P07356) asociada con varias funciones celulares, como la fibrinólisis, la motilidad celular (en células epiteliales), una proteína relacionada con la actina. interacciones citoesqueleto y matriz celular [43], interactuando con otras dos proteínas involucradas en el transporte de lípidos intracelulares (FABP1_P12710 y FABP5_Q05816). Curiosamente, se identificó otro grupo relevante de proteínas en el grupo p12-con una interacción proteína-proteína muy fuerte entre varios fibrinógenos (FGL1_Q71KU9, FIBB_Q8K0E8, FIBA{{22 }}E9PV24 y FIBGG_Q8VCM7). Los fibrinógenos participan en el crecimiento de los hepatocitos y median en la diseminación de las plaquetas sanguíneas, el colágeno intersticial y las lesiones fibróticas [44]. Además, se encontró que proteínas adicionales interactúan con fibrinógenos (Figura S8), como el componente p amiloide sérico (SAMP_P12246), la hemopexina (HEMO_Q91X72) o la hidroxiácido oxidasa 2 (HAOX{ {37}}Q9NYQ2). De manera consistente con los resultados de la cadena, ANXA2 y los complejos de fibrinógeno también fueron los componentes celulares más enriquecidos identificados por el análisis FunRich (Figura 4a). Curiosamente, al comparar los datos obtenidos mediante el análisis DDA y SWATH, confirmamos que varias proteínas identificadas por SWATH también se identificaron mediante el análisis DDA, incluidas varias relacionadas con proteínas del complejo de fibrinógeno (SAMP/Apcs y S10A9/S100a9; Tabla S3).
3.4. La validación del análisis SWATH-MS desenmascara el complejo de fibrinógeno como un nuevo mecanismo molecular relacionado con la PLD
Con base en estos datos, seleccionamos del análisis SWATH-MS (Figura S9) las proteínas alteradas relacionadas con el complejo de fibrinógeno en las etapas p12 y p14 para la validación in vivo con RT-qPCR, transferencia Western e inmunohistoquímica, para establecer su confirmación como sea posible. objetivos de la enfermedad. Ocho de 10 de estas proteínas seleccionadas fueron validadas a nivel de ARNm mediante RT-qPCR (Figura 5); uno regulado positivamente en la etapa 14-(ANXA2_P07356) y en el grupo p12-(SAMP_P12246, FGL1_Q71KU9, ILK{{ 17}}O55222, S10A9_P31725, FIBB_Q8K0E8, HEMO_Q91X72, FIBA_E9PV24 y FIBG_Q8VCM7), y uno abajo- regulado en el grupo p12 (HAOX2_Q9NYQ2). Curiosamente, la expresión génica de las dos proteínas con más distancia o menos interacciones con el grupo fibrinógeno (ILK y S10A9) fueron las únicas que no fueron validadas (Figura 5c).
La regulación positiva del complejo de fibrinógeno (proteínas ANXA2, SAMP, FIBB, FIBA, FIBG y HAOX2) se confirmó mediante análisis de transferencia Western (WB) (Figura 6). En general, la expresión génica y el WB fueron muy consistentes con los datos proteómicos de SWATH-MS. Finalmente, también realizamos la validación inmunohistoquímica del complejo de fibrinógeno en muestras de hígado poliquístico y mutante (Figura 7). La tinción de fibrinógeno estuvo fuertemente regulada al alza en las células epiteliales que recubren los quistes y en las dilataciones de los conductos biliares (Figura 7a). Estos resultados desenmascaran, por primera vez, el complejo de fibrinógeno como una posible vía relacionada con la cistogénesis hepática y como una posible futura diana terapéutica para la PLD.
Figura 5. Validación de posibles objetivos de PLD mediante RT-qPCR. Expresión genética de 8 a 10 objetivos seleccionados correlacionados con datos de SWATH-MS. RT-qPCR de anexina A2 objetivo p14 seleccionada regulada positivamente (Anxa2) (a); La p12 regulada positivamente se dirige al componente amiloide p, suero (Apcs, gen SAMP), similar al fibrinógeno 1 (Fgl1), cadena beta de fibrinógeno (Fgb), hemopexina (Hpx), cadena alfa de fibrinógeno (Fga), cadena gamma de fibrinógeno (Fgg) (b), quinasa unida a integrina (Ilk) y proteína de unión a calcio A9 S10{{30}} (S100a9) (c); y p12 regulada negativamente apunta a la hidroxiácido oxidasa 2 (Hao2) (d). Se utilizó n= 6 para cada grupo de proteínas. Gapdh se utilizó como gen de limpieza. Las barras representan medias ± SEM. Se utilizó la prueba t de Student con dos colas y se consideró significativo un valor de p < 0,05. ns: no significativo (p Mayor o igual a 0,05), * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
Figura 7. El complejo de fibrinógeno está regulado positivamente en los epitelios quísticos. ( a, b ) Imágenes representativas de inmunohistoquímica de fibrinógeno en el conducto biliar (panel superior) y parénquima hepático (panel inferior) (a) y su cuantificación (b). Se utilizó n=6 para cada grupo. El análisis inmunohistoquímico mostró una regulación positiva del fibrinógeno a través de epitelios quísticos. Las muestras correspondieron al grupo p12. Las barras de escala representan 100 µm. Bd significa conducto biliar. Las barras representan medias ± SEM. Se utilizó la prueba t de Student con dos colas y se consideró significativo un valor de p < 0,05. ***p < 0,001.
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