Análisis proteómico cuantitativo de pacientes con COVID-19: fetuina-A y tetranectina como moduladores potenciales de las respuestas inmunitarias innatas

ABSTRACTO

El tratamiento de los casos graves de enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) es extremadamente importante para minimizar la muerte y el daño a los órganos diana. Aquí realizamos un análisis proteómico de muestras de plasma de pacientes con COVID-19 leve, moderado y grave. El análisis reveló proteínas expresadas diferencialmente y diferentes dianas terapéuticas potenciales relacionadas con las respuestas inmunitarias innatas, como la fetuina-A, la vitronectina (TN) y la paraoxonasa-1 (PON1). Además, los cambios en las proteínas del plasma mostraron una desregulación de las cascadas del complemento y la coagulación en los pacientes con COVID-19 en comparación con los controles sanos. En conclusión, nuestros datos de proteómica sugirieron que la fetuina-A y el TN son objetivos potenciales que podrían usarse para el diagnóstico, así como firmas para una mejor comprensión de la patogenia de la enfermedad COVID-19.

Los órganos terminales se refieren a los tejidos u órganos que finalmente completan funciones específicas en el cuerpo humano, como el hígado, los riñones y los pulmones. El daño a estos órganos puede provocar una variedad de enfermedades importantes, como la enfermedad renal crónica, la cirrosis hepática y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. La inmunidad se refiere a la respuesta inmune del cuerpo a los microorganismos y tejidos patógenos extraños. La inmunidad del cuerpo permanece normal, lo que puede prevenir la aparición y un mayor deterioro de las enfermedades. Por lo tanto, el daño de los órganos diana está estrechamente relacionado con la inmunidad, e interactúan para afectar la función inmunológica del cuerpo humano.

El daño a los órganos terminales puede provocar daños en la cantidad y la calidad de las células inmunitarias del cuerpo. Por ejemplo, los pacientes con enfermedad hepática experimentarán leucopenia, función hepática anormal y síntesis de anticuerpos reducida, lo que los hará más susceptibles a la infección después de la enfermedad; la disminución de la función renal conducirá a la uremia. Síndrome, anemia, osteoporosis y otras enfermedades, estos factores también afectarán la función inmunológica del cuerpo. Por otro lado, la respuesta inmunitaria del cuerpo también puede afectar a los órganos diana; por ejemplo, una respuesta inmunitaria excesiva puede provocar una hepatitis inmunitaria o una neumonía anafiláctica. La interacción del daño de los órganos diana y la disfunción inmunitaria hace que el cuerpo sea más susceptible a las enfermedades y acorta su vida útil.

Por lo tanto, mantener la función normal de los órganos diana y una función inmunológica robusta es clave para mantener una buena salud. Las personas deben prevenir el daño de los órganos finales a través de un buen estilo de vida, como una dieta saludable, ejercicio adecuado y relajación, y mantener una función inmunológica normal a través de la prevención activa y el tratamiento de enfermedades. Se puede ver que tenemos que prestar atención a nuestra inmunidad. Cistanche puede mejorar la inmunidad y el efecto es bueno. Los polisacáridos de la carne pueden regular la respuesta inmunitaria del sistema inmunitario humano, mejorar la capacidad de estrés de las células inmunitarias y fortalecer las células inmunitarias. efecto bactericida.

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1. Introducción

El síndrome respiratorio agudo severo, coronavirus 2 (SARS-CoV-2), causó la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) [1]. La enfermedad de COVID-19 se caracteriza por diferentes fenotipos clínicos que van desde los asintomáticos, leves y moderados hasta los graves o extremadamente graves, caracterizados por neumonía grave y un alto riesgo de muerte en la población anciana, especialmente en pacientes mayores de 70 años [ 2,3]. Las vacunas se generaron a fines de 2020 y la mayoría de las personas en todo el mundo fueron vacunadas con al menos 2 dosis. A pesar de la disminución en el número de sujetos infectados, así como de los casos graves notificados, el problema está lejos de resolverse y se desconoce la causa de la progresión de la enfermedad a un estado grave. Además, el SARS-CoV-2 al igual que otros virus cambia con el tiempo, y las nuevas variantes pueden tener una modificación en las propiedades originales, como la propagación y la gravedad de la enfermedad asociada, y volverse menos (variante omicron) [4] o más (delta variante) [5] grave. La posible aparición de nuevas variantes aún es posible y comprender el mecanismo de las vías detrás de la enfermedad COVID-19 es muy importante.

Es bien sabido que la disfunción de las respuestas inmunitarias es el problema principal contra la eliminación del virus y la recuperación de la enfermedad. Además, las respuestas inmunitarias innatas se consideran los factores clave para modular el progreso de la enfermedad hacia fenotipos clínicos asintomáticos, leves, moderados, graves o extremadamente graves [6,7]. Los neutrófilos y los monocitos/macrófagos son los elementos de defensa cruciales de primera línea que impulsan las respuestas inmunitarias innatas durante la infección [8,9]. La proteína espiga del SARS-CoV-2 podría activar los macrófagos directamente a través del receptor ACE2 presente en estas células [10].

A lo largo de la infección, las células inmunitarias liberaron varias proteínas, citoquinas y mediadores para regular la inflamación y mantener la homeostasis fisiológica del cuerpo. La proteómica basada en plasma es un enfoque práctico para analizar los perfiles de proteínas y clasificar los cambios asociados con las condiciones fisiopatológicas o la progresión de la enfermedad [11]. Se realizaron diferentes estudios de proteómica para identificar y caracterizar los perfiles de proteoma en diferentes cohortes de COVID-19 utilizando tejidos [12,13], células [14] o plasma [15,16]. Por lo tanto, aplicamos proteómica basada en plasma para identificar posibles proteínas asociadas al sistema inmunitario innato relevantes para la progresión de la enfermedad y la gravedad de la COVID-19. Nuestro objetivo es estudiar el patrón de expresión de proteínas plasmáticas en pacientes sanos e infectados con COVID-19-y evaluar la posible interacción con las respuestas inmunitarias innatas.

2. Resultados

2.1. Perfiles proteómicos de plasma

Para evaluar las respuestas del huésped del SARS-CoV-2, se realizó un análisis proteómico del plasma de una cohorte de pacientes con COVID-19 y controles sanos. En nuestro estudio, el método iTRAQ 4plex se eligió cuidadosamente sobre otros métodos etiquetados con proteómica debido a la alta reproducibilidad y la cobertura del proteoma [17]. Además, para una mayor profundidad de la cobertura del proteoma total, combinamos el fraccionamiento de péptidos de intercambio catiónico fuerte con iTRAQ. En la Fig. 1 se presenta una ilustración del flujo de trabajo del estudio. Se identificó un total de 176 proteínas en todas las muestras de plasma de control sanas y de COVID-19 con una tasa de descubrimiento falso de<1% at the protein level. Nevertheless, our prime interest was to identify biomarkers and investigate the pathogenesis of COVID-19. Consequently, differentially expressed proteins analysis was performed for healthy control versus other COVID-19 groups (severe, moderate, and mild) by applying pairwise comparison. Supplementary Table S1 shows a list of differentially expressed proteins in all pairwise comparisons including 'severe v. Control', 'moderate v. Control', and 'mild v. Control'. The statistical criteria for the quantitative analysis were set with a cutoff for fold change with >1.20 para regulación ascendente y<0.83 for down-regulation and a p-value of <0.05 (Supplementary Table S2). 

Los resultados revelaron que la cantidad de proteínas que se alteraron entre los grupos de comparación varió como se muestra en la Fig. 2a. Los resultados comparativos mostraron que el 27 por ciento de las mediciones de proteínas expresadas diferencialmente se superponen en los tres grupos (Fig. 2b). El diagrama de Venn también mostró que el número de proteínas únicas en la comparación por pares de leve versus control tiene un número más alto en comparación con otros grupos. Esto no refleja necesariamente las diferencias en el nivel de identificación de proteínas, sino el nivel cuantitativo, considerando que los criterios estadísticos se seleccionaron para el cambio de pliegue y el valor de p. Para evaluar si las mediciones de proteínas expresadas diferencialmente para todas las comparaciones se pueden distinguir entre los grupos de COVID-19 o no, se aplicó el análisis PCA. Curiosamente, los resultados mostraron que había una clara distinción entre los grupos de COVID-19 como se muestra en la Fig. 3. Además, las proteínas expresadas diferencialmente se han presentado mediante la creación de un gráfico de volcán para todas las comparaciones por pares de control saludable versus COVID{{ 7}} grupos (Fig. 4). Varias de las proteínas expresadas diferencialmente en nuestro conjunto de datos se informaron previamente como biomarcadores para COVID-19 [16,18].

Se realizó un análisis de vía y ontología génica utilizando la herramienta en línea 'STRING' en las mediciones de proteínas expresadas diferencialmente para controles sanos y pacientes con COVID{{0}}, independientemente del grupo en el que se encuentren. Para el análisis de enriquecimiento go, la mayoría Se descubrió que las proteínas expresadas diferencialmente están involucradas en la regulación biológica, la región extracelular y el regulador de la función molecular para el proceso biológico, el complemento celular y la función molecular, respectivamente (material complementario, Fig. S1). Además, hemos estudiado las proteínas expresadas diferencialmente y su participación en el análisis de rutas utilizando la base de datos KEGG. Los criterios estadísticos del análisis de enriquecimiento se eligieron para ser p < 0,01 y la clasificación de los términos de la ruta se basó en el enriquecimiento de veces, como se muestra en el material complementario (Fig. S2). A lo largo de la infección, las células dañadas y muertas inician grandes respuestas inmunitarias y liberan diferentes componentes celulares y endotoxinas que activan la cascada de coagulación de la sangre [19]. La activación de dichas vías conduce a la disfunción e inflamación endotelial, así como a la estimulación de la migración de leucocitos y la infiltración tisular, lo que desencadena la activación de respuestas inmunitarias locales innatas [20]. En nuestro estudio, se encontró que el sistema del complemento, que es el modulador central de las vías de la cascada de coagulación e inmunidad innata, es el más significativo entre otros términos de vías. Varios estudios de proteómica en plasma de pacientes con COVID-19 mostraron que las cascadas del complemento y la coagulación eran una de las vías más enriquecidas [21,22]. Sin embargo, el enfoque de nuestra discusión está en tres proteínas fetuin-A, TN y PON-1 como posibles nuevos objetivos involucrados en las respuestas inmunitarias innatas a la infección por SARS-COV-2 y la gravedad de COVID{{ 14}} enfermedad.

2.2. Los niveles plasmáticos de TNF están asociados con los síntomas de la enfermedad COVID-19

La tormenta de citoquinas inducida por Sars-CoV2 es una firma de casos graves de la enfermedad COVID-19 [23]. Se informó que la liberación excesiva de TNF está asociada con la gravedad y el mal pronóstico de los pacientes con enfermedad de COVID-19 [24,25]. En nuestro estudio, la medición de los niveles plasmáticos de TNF mostró un aumento esperado en los grupos con COVID-19 en comparación con los controles sanos, lo que se corroboró con un aumento adicional en las muestras graves en comparación con las muestras moderadas o leves.\

3. Discusión

Se han empleado varios estudios proteómicos no dirigidos para investigar el cambio en las muestras de suero/plasma de COVID-19. El número de proteínas identificadas a partir de estos estudios varía debido a los diferentes métodos que se utilizaron. El enfoque de cuantificación sin etiquetas que utiliza un método de adquisición independiente de datos mostró una mayor cobertura de proteoma plasmático [26]. Para el enfoque proteómico basado en el marcado, el método de cuantificación de TMT basado en LC-MS/MS de Orbitrap ha mostrado una mayor cobertura de proteoma de plasma/suero con un número de proteínas identificadas que alcanza las 900 [27]. En nuestro estudio, el número total de proteínas identificadas fue de 176, muy cercano a dos estudios publicados que utilizaron el mismo analizador de masas (TripleTOF) donde identificaron 179 y 189 proteínas [28,29]. Las proteínas circuladas en el plasma de los pacientes con COVID-19 presentan una ventana para la detección del progreso y la gravedad de la enfermedad, así como la firma de la inflamación y las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas.

La producción y la liberación excesiva de citoquinas proinflamatorias se consideran el punto clave para cambiar el fenotipo clínico de un estado moderado a grave en pacientes con COVID-19. En el curso de la infección, las respuestas inmunitarias innatas son moduladas por patrones moleculares asociados a daños (DAMP) o patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) [30]. Las proteínas de fase aguda (APP), como la fetuina-A, se liberan sistemáticamente en el plasma para apoyar el proceso antiinflamatorio durante la inflamación. En nuestro estudio, observamos una clara regulación a la baja de la fetuina-A plasmática en casos moderados y graves en comparación con controles sanos (Fig. 4). Se demostró que la fetuina-A puede inhibir mediadores tempranos (TNF, IL-1, IL-6 e INF) y tardíos (HMGB1) liberados por células inmunitarias innatas como los macrófagos [31]. El análisis de TNF en nuestra cohorte COVID-19 indica una tendencia de aumento en la concentración plasmática en comparación con donantes sanos que se potencia más en casos graves (material complementario, Fig. S3). Durante la inflamación, los monocitos/macrófagos activados liberan citoquinas proinflamatorias que son atenuadas por una amina biogénica ubicua llamada espermina [32]. Sin embargo, los efectos antiinflamatorios de la espermina dependen de la fetuina-A. Por lo tanto, la espermina no pudo inhibir la función de las células deficientes en monocitos/macrófagos fetuin-A [33]. Además, una disminución en el nivel de fetuina-A podría estar relacionada con anormalidades vasculares y trombosis detectadas en casos extremadamente severos debido a un aumento en la calcificación vascular y disfunción endotelial [34,35] y estrés oxidativo [36] asociado con los niveles de fetuina-A .

Después de la infección viral, la apoptosis celular es uno de los mecanismos de defensa del huésped. Sin embargo, la acumulación excesiva de células apoptóticas debido a defectos en la eliminación de células apoptóticas se asocia con hiperinflamación y autoinmunidad [37]. La disminución del nivel plasmático de fetuina-A podría estar involucrada, al menos en parte, en este proceso, ya que aumenta la capacidad de fagocitosis para limpiar las células apoptóticas por macrófagos [38] y las vesículas por VSMC [39].

Recientemente se informó que la fetuina-A desempeña un papel crucial no solo como inhibidor de la calcificación, sino también como componente multiprotector al reducir la fibrosis y la inflamación y modular la polarización de los macrófagos [40].

Rudloff et al. demostraron que la fetuina-A es un gen objetivo de HIF que tiene un papel protector en la disfunción renal inducida por hipoxia [40]. Fetuin-A atenúa la sobrecarga de calcio de los macrófagos debido a la hipoxia. Recientemente demostramos que la proteína de punta del coronavirus SARS-CoV-2 activa los-1-macrófagos similares y aumenta los niveles de calcio intracelular [41]; por lo tanto, la fetuina-A podría desempeñar el papel de eliminador de calcio para regular la homeostasis celular y modular la polarización adecuada para respuestas inmunitarias innatas razonables, evitando así la sobreinflamación.

Los síndromes de disfunción orgánica múltiple (MODS) o MODS relacionados con infecciones se consideran una de las principales causas de muerte en los casos graves de COVID-19 [42]. La hiperinflamación y la desregulación inmunitaria durante la infección provocan daños en los órganos terminales debido al fracaso de la respuesta inmunitaria innata y la hipercitoquinemia. Durante la infección sistémica, las endotoxinas bacterianas y los ARN virales son reconocidos por el sistema inmunitario innato que desencadena la expresión y liberación de citocinas tempranas (TNF e INF). Además, las respuestas inmunitarias innatas de primera línea estimulan la producción de mediadores tardíos, como la caja 1 del grupo de alta movilidad (HMGB1) [43]. La HMGB1 intracelular o extracelular expresada en la mayoría de las células es una alarmina liberada tras la estimulación o después de la muerte de la célula [44]. La hiperliberación de HMGB1 desencadena la producción de citoquinas como IL-6 [45]. El aumento de la concentración de IL-6 se asoció con resultados graves en el síndrome inflamatorio multisistémico en niños (MIS-C) relacionado con la infección por SARS-CoV-2 [46]. La IL-6 es secretada principalmente por monocitos/macrófagos específicamente cuando se polariza a un fenotipo similar a M1-. También se demostró que HMGB1 puede polarizar los macrófagos a través del receptor tipo Toll (TLR) 4 [47].

La tetranectina (CLEC3B) es una de las proteínas de unión a HMGB1- y su interacción podría modular la función biológica y el proceso inflamatorio durante la infección. La proteína TN altamente purificada inhibió la liberación de HMGB1 inducida por LPS de forma dependiente de la dosis en macrófagos [48]. La desregulación del sistema inmunitario innato que conduce a la sobreactivación inmunitaria es un futuro común de los casos graves y la sepsis de COVID-19. Recientemente se demostró que la concentración sanguínea de vitronectina disminuye drásticamente en pacientes con sepsis extremadamente grave [48]. Recientemente, Yuming Li et al. [49] informaron sobre la regulación a la baja de la vitronectina en casos graves de pacientes con COVID-19 utilizando el método de proteómica cuantitativa sin etiquetas. La disminución plasmática significativa de esta proteína la comprobamos en nuestro estudio (fig. 4) con diferentes grupos y basándonos en el método cuantitativo-marcador. Por lo tanto, la vitronectina puede considerarse un marcador potencial de la desregulación inmunitaria innata asociada con la gravedad de los síntomas de la COVID-19.

La tetranectina está involucrada en el sistema de fibrinólisis que conduce al control de la coagulación anormal; por lo tanto, la regulación a la baja de TN se asocia con enfermedades cardiovasculares como la enfermedad de las arterias coronarias (EAC) [50]. Cabe destacar que muchos casos graves de pacientes infectados por SARS-COV-2 presentan disfunción vascular posiblemente debido a la deficiencia de TN. La disminución del nivel sérico de TN se acompaña de una reducción de la paraoxonasa 1 (PON1) en diferentes enfermedades cardiovasculares. En nuestro estudio, la regulación a la baja de PON1 (Fig. 4) podría ser un marcador de progresión de la enfermedad a síntomas graves, ya que se informó que la presencia de inflamación y estrés oxidativo se asocia con una disminución de PON1 sérica en enfermedades cardiovasculares [51] . Además, un nivel bajo de PON1 puede exacerbar la reacción proinflamatoria innata a la infección por el virus, ya que se demostró que PON1 suprime la reacción exagerada de los macrófagos y mantiene la inflamación en la aterosclerosis [52]. La desregulación de TN ejerce una influencia sobre los efectores posteriores de AMPK, como HIF1, que regula el fenotipo y la función de las células inmunitarias innatas y modula la polarización de los macrófagos hacia el fenotipo similar a M1-, así como la maduración de DC [53,54].

En conjunto, la regulación a la baja de vitronectina, fetuina-A y PON1 observada en casos moderados y graves podría estar asociada con la desregulación de las respuestas inmunitarias innatas a través de la disfunción de monocitos/macrófagos, lo que lleva a una hiperliberación de citocinas y la progresión de la COVID{{4} } enfermedad a estado grave.

Además, nuestro análisis proteómico reveló una regulación positiva de APOE (material complementario, Fig. S4) en casos graves en comparación con controles sanos. Se sabe que los niveles plasmáticos de APOE modulan la función de las lipoproteínas y las enfermedades cardiometabólicas. Además, la APOE participa en el proceso inflamatorio al cambiar la polarización de los macrófagos y afectar los fenotipos pro/antiinflamatorios [55]. De acuerdo con esto, se informó que un aumento en los niveles de APOE podría estar asociado con la gravedad de COVID-19 [56].

En el curso de la infección, la interacción entre los macrófagos y el sistema del complemento es importante para las respuestas inmunitarias innatas, así como para la modulación de las funciones del complemento y la transición de las condiciones inmunitarias innatas a las adaptativas [57]. La interactividad de los componentes del complemento con diferentes receptores en los macrófagos impulsa el proceso inflamatorio y la producción de citoquinas. Se informó en diferentes estudios de proteómica que la desregulación de la cascada del complemento [58,59] en pacientes con COVID-19 y que la activación del sistema del complemento intensifica la citotoxicidad de las células T en casos graves [60]. Informamos un aumento significativo de los complementos 1q, 5, 6, 7 (material complementario, Fig. S5) en pacientes con COVID-19 moderado y grave. Durante el proceso de eliminación de células apoptóticas, C1q controla la polarización de monocitos/macrófagos e inhibe la actividad del inflamasoma [61]. El análisis de enriquecimiento mostró un vínculo significativo entre los componentes del complemento C1q, C5, C6, C7 y las cascadas de la coagulación, donde también encontramos la participación del sistema calicreína-cinina a través del cininógeno-1 que modula las reacciones inmunitarias innatas a través de la vía de la bradicinina.

El presente estudio tiene una limitación en cuanto al tamaño de la muestra. Sin embargo, nuestros resultados han mostrado una buena concordancia con estudios anteriores de proteómica covid-19 en los que identificamos biomarcadores que muestran una expresión similar. Esto demuestra que el enfoque proteómico seguido en este estudio es válido, pero quizás no sea el óptimo.

4. Conclusión

Durante la infección por SARS-COV-2, un trastorno en las respuestas inmunitarias es el principal problema que impulsa la escalada de la enfermedad de COVID-19 a casos graves. Las vías mecánicas que conducen a la disfunción inmunitaria innata son la piedra angular para resolver las complicaciones asociadas con la infección por SARS-CoV-2 no controlada. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que emplea el enfoque iTRAQ en muestras de plasma/suero de COVID-19. Los niveles séricos de TN, fetuina-A y PON1 son marcadores potenciales implicados, al menos en parte, en el sistema inmunológico innato, específicamente en la hiperactivación de macrófagos y, en consecuencia, podrían considerarse objetivos potenciales para el tratamiento de COVID-19.

5. Materiales y métodos

5.1. Diseño del estudio y población

Nuestras cohortes de estudio incluyen 25 sujetos: control sano (n=5) y 20 pacientes infectados con SARS-COV-2 agrupados según la gravedad de la enfermedad (Fig. 1) en leves (n=5) , Moderado (n=5), Grave (n=5) ​​y Muerto (n=5). El grupo de muertos se excluyó del comienzo del estudio debido a comorbilidades de los sujetos que podrían afectar la especificidad de los efectos de COVID-19. Todos los pacientes fueron reclutados en King Abdallah Specialist Children's Hospital (KASCH) y King Abdulaziz Medical City (KAMC). Todos los participantes firmaron el consentimiento informado mientras completaban un cuestionario sobre síntomas clínicos y datos demográficos.

Extracción de sangre: se recogieron 3-5 ml de sangre venosa de cada paciente. Se utilizaron tubos EDTA para recolectar muestras de sangre; luego, el plasma se separó por centrifugación antes de almacenarlo a 80 ◦C para su posterior análisis.

5.2. iTRAQ proteómica preparación de muestras de plasma

Se agruparon cinco muestras biológicas de cada grupo en una muestra. A continuación, todas las muestras de plasma se sometieron a los cartuchos Agilent Human14 Multiple Affinity Removal Spin para eliminar las 14 proteínas más abundantes del plasma siguiendo el protocolo de fabricación (Agilent, EE. UU.). Posteriormente, las digestiones de proteínas se etiquetaron con reactivos 4-plex iTRAQ (Sciex, Canadá) siguiendo el protocolo de fabricación con modificaciones menores. En resumen, se desnaturalizaron, redujeron y alquilaron 100 ug de proteínas usando urea 8 M/bicarbonato de trietilamonio (TEAB) 100 mM, tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) 50 mM y metanotiosulfonato de metilo (MMTS) respectivamente. A continuación, las muestras de proteína se digirieron en péptidos usando tripsina con una proporción de 1:40 (tripsina a proteína). Posteriormente, las muestras de péptidos se etiquetaron con 114, 115, 116 y 117 para el control sano, grave, moderado y leve, respectivamente. A continuación, las 4 muestras marcadas se mezclaron y agruparon en una sola muestra.

5.3. Fraccionamiento y desalado de péptidos

La muestra agrupada de iTRAQ se fraccionó fuera de línea en función del intercambio catiónico utilizando la columna de centrifugación Pierce Strong Cation Exchange (SCX) (Thermo Scientific, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, primero se acondicionó la columna de centrifugación utilizando {{0}},1 por ciento de ácido fórmico y luego se cargaron los péptidos marcados en la columna. Se realizaron dos pasos de lavado utilizando 0,1 por ciento de ácido fórmico. A continuación, los péptidos se eluyeron en 22 fracciones cambiando la proporción del 10 por ciento de acetonitrilo y la concentración de formiato de amonio de 15 mM a 900 mM. Posteriormente, el paso de desalinización y limpieza se realizó mediante adsorbente polimérico de fase reversa utilizando el cartucho Oasis HLB (Waters, EE. UU.). En resumen, el cartucho se acondicionó y equilibró con acetonitrilo y ácido fórmico al 0,1 por ciento, respectivamente. A continuación, se cargaron los péptidos marcados y se aplicaron dos etapas de lavado con ácido fórmico al 0,1 por ciento. La elución de los péptidos se realizó utilizando acetonitrilo al 70 por ciento.

5.4. NanoLC-MS/MS

Cada fracción (22 en total) se cargó en un Ekspert nanoLC 425 (Eksigent, Dublin, CA, EE. UU.), acoplado a un TripleTOF 5600 (Sciex, Concord, Canadá) por triplicado. La separación de péptidos en NanoLC se realizó como se describe anteriormente [41]. El MS1 y el MS/MS para el análisis iTRAQ se configuraron de la siguiente manera: rango de masa TOF 250–1500 con tiempo de acumulación de 0,25 s. Los criterios de IDA fueron para iones superiores a 400 m/z con un estado de carga de 2–5. El umbral de abundancia supera los 200 cps. El CE ajustado cuando se verificó el parámetro del reactivo iTRAQ. Los parámetros de la fuente de iones se establecieron de la siguiente manera: gas de fuente de iones 1 (GS1), 25; cortina de gas (CUR), 25; Flotación de voltaje de IonSpray (ISVF), 2250; Temperatura del calentador de interfaz (HIT), 60.

5.5. Análisis de proteómica cuantitativa iTRAQ

Los datos sin procesar de MS iTRAQ se procesaron con el software ProteinPilot (v 4.5, Sciex) para su identificación y cuantificación. Los parámetros se establecieron de la siguiente manera: tipo de muestra, iTRAQ 4plex, Cys, alquilación, MMTS, digestión, tripsina, factores especiales, desnaturalización de urea, especies, Homo sapiens, base de datos, base de datos UniProt Proteome Humans (descargada el 29 de octubre de 2019); Se comprobó el FDR global.

El cambio de pliegue y el valor p se calcularon en función del promedio de la intensidad del péptido y la prueba t de Student, respectivamente. Los datos de iTRAQ MS se depositaron en ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) con el identificador PXD037400.

5.6. Análisis bioinformático

El análisis PCA se realizó utilizando la función 'principal' en el software estadístico R. VolcaNoseR [62] se utilizó para generar los gráficos de volcanes. La herramienta en línea STRING [63] se utilizó para el enriquecimiento de genes y el análisis de vías con criterios estadísticos establecidos en p < 0.05. Se aplicó la base de datos de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG) para el análisis de la vía.

5.7. Medición de ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA)

Las muestras se prepararon como se describió anteriormente [64] utilizando el factor de necrosis tumoral (TNF-) y el kit de ensayo ELISA (SEKH-0047, Solarbio life sciences). Brevemente, se agregaron 100 ul de muestras o estándares a cada pocillo y luego se incubaron a 37 ◦C durante 1 h 30 min. Después de lavar cuatro veces con tampón de lavado, se añadió un anticuerpo de detección conjugado con biotina (100 ul) antes de la incubación durante 1 hora a 37 ◦C. Se realizó un segundo paso de lavado (cuatro veces) y se añadió Streptavidin-HRP (100 ul) antes de la incubación durante 30 min. Después del lavado, se agregó una solución de sustrato (TMB) (100 ul) y se incubó durante 15 min en la oscuridad antes de agregar la solución de parada y se detectó la medición de la absorbancia a 450 nm.

Fondos

Este artículo fue apoyado por una subvención del King Abdullah International Research Center no. RC20/153/R y RC20/205/R y BioBank KAIMRC NGHA.

Aprobación ética y consentimiento para participar

Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Comité de Ética del Centro Internacional de Investigación Médica Rey Abdullah (KAIMRC) con IRB RC20/153/R y RC20/205/R. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes en el estudio.

Contribuciones de los autores

BA: Concibió y diseñó los experimentos y analizó e interpretó los datos. FAM, H⋅S, KA y HA: realizaron los experimentos. FA, HSA y MR: analizaron e interpretaron los datos. FA, MJ, AH y MB: contribuyeron con reactivos, materiales, herramientas de análisis o datos y escribieron el artículo. TB: Concibió y diseñó los experimentos y analizó e interpretó los datos.

Declaración de disponibilidad de datos

Los datos asociados con este estudio se han depositado en Los datos de iTRAQ MS se depositaron en ProteomeXchange Consortium con el identificador PXD037400.

Declaración de declaración de interés

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia ni relaciones personales conocidas que pudieran haber influido en el trabajo informado en este documento.

Expresiones de gratitud

Los autores extienden su agradecimiento al Número de Proyecto de Apoyo a los Investigadores (RSP-2023/17) en la Universidad King Saud, Riyadh, Arabia Saudita.

Referencias

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