Determinación rápida y simultánea de seis componentes eficaces en Cistanche tubulosa mediante espectroscopia de infrarrojo cercano

1. Introducción

Cistanche (Hoffmg. Et Link) es un género fanerógamo perenne de la familia de plantas Orobanchaceae. La mayoría de las especies pertenecientes al género Cistanche se han utilizado como planta medicinal durante milenios en China; tener reputación de tónico superior; y son conocidos como "Ginseng de los Desiertos". Cistanche tubulosa es un parásito obligado de las raíces de la planta perenne Tamarix chinensis. Ha sido documentado en la Farmacopea China como la fuente auténtica deCistanches Herba(Nombre chino: Roucongrong) de la edición de 2005. La investigación farmacológica moderna sobre las especies de Cistanche se inició en la década de 1980. Las investigaciones farmacológicas demostraron que los extractos de las plantas de Cistanche poseen un amplio espectro de actividades, como curar la deficiencia renal y el estreñimiento senil, mejorar la capacidad de aprender y memorizar, contra la enfermedad de Alzheimer, mejorar la inmunidad, antienvejecimiento, antifatiga, etc. En las últimas tres décadas, se han combinado estudios farmacológicos exhaustivos y sistemáticos con investigaciones fitoquímicas para iluminar la base material de los efectos beneficiosos de las raíces de las plantas de Cistanche. Estos estudios indican que los glucósidos feniletanoides (PhG) eran los principales componentes eficaces de las plantas de Cistanche y desempeñaban funciones clave en el tratamiento de la deficiencia renal, la impotencia, el antienvejecimiento y la enfermedad de Alzheimer. La farmacopea china requería el contenido de dos PhG (equinacósido y verbascósido). Mientras tanto, los carbohidratos como el manitol, la sacarosa, la glucosa y la fructosa en las plantas de Cistanche poseen la función laxante y los grupos de carbohidratos dePlantas de cistancheSe han utilizado para el tratamiento del estreñimiento.

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Los recursos silvestres de C. tubulosa se distribuyen principalmente en el área que rodea el desierto de Taklamakan en el sur de la Región Autónoma de Xinjiang en China. Al igual que muchas otras especies utilizadas como medicina tradicional china (MTC), C. tubulosa tiene un gran valor económico y está casi extinta en su hábitat silvestre debido a la recolección excesiva. El cultivo de C. tubulosa comenzó en la década de 1990 en China para garantizar el suministro de materias primas para Cistanches Herba y proteger los recursos de plantas silvestres. En 2017, existen casi 13.000 hectáreas de C. tubulosa cultivadas en la prefectura de Hotan en Xinjiang. Se exigen avances en la tecnología de siembra para ampliar el cultivo y mejorar la calidad de C. tubulosa.

El objetivo principal del cultivo de C. tubulosa es producir Cistanches Herba, que es rico en esos componentes eficaces. Sin embargo, el contenido de los componentes eficaces enCistanches Herba, como los PhG y los oligosacáridos, pueden verse afectados significativamente por muchos factores durante la producción. Se debe explorar un sistema de detección en tiempo real de la calidad de C. tubulosa. Por lo tanto, es necesario desarrollar un método de alto rendimiento para cumplir con el requisito de analizar una gran cantidad de muestras en un período corto. Tradicionalmente, la determinación de los componentes primarios eficaces, como los PhG y los carbohidratos, en C. tubulosa generalmente se lograba mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Aunque es preciso y fiable, la recopilación y el procesamiento de datos requiere mucho tiempo y es laborioso. Además, también se requiere una gran cantidad de tiempo y esfuerzo para la preparación de muestras, que normalmente implica pulverización, extracción y filtración de ensayos de HPLC. Por lo tanto, se necesita un principio claro y una herramienta fácil de operar para obtener una cantidad relativamente grande de datos. Afortunadamente, la espectroscopia de infrarrojo cercano (NIRS) se ha utilizado ampliamente para evaluar productos agrícolas, alimentos, muestras médicas y productos farmacéuticos porque es rápida y no destructiva. Por lo tanto, NIRS podría cumplir exactamente con los requisitos para mediciones eficientes de TCM y, como era de esperar, NIRS se ha aplicado para la identificación cualitativa y la cuantificación de compuestos en TCM.

En este estudio, el contenido de seis componentes efectivos, incluidoequinacósido, verbascósido, manitol, sacarosa, glucosa y fructosaen 116 lotes de muestras de C. tubulosa que se recolectaron en la prefectura de Hotan en Xinjiang entre 2013 y 2015 se determinaron por primera vez mediante HPLC. Posteriormente, se establecieron los modelos de calibración de estos seis componentes con el método de regresión de mínimos cuadrados parciales (PLSR). Luego, estos modelos se validaron con los coeficientes de correlación y los errores de predicción en los conjuntos de calibración. Los resultados demostraron que el método desarrollado podría emplearse como un método confiable para el análisis cuantitativo de C. tubulosa.

2. Resultados

2.1. Análisis HPLC

Los contenidos deechinacósido y verbascósidose determinaron mediante un método HPLC-UV bien definido en la literatura y cuatro carbohidratos (manitol, sacarosa, glucosa y fructosa) se determinaron mediante un método HPLC-ELSD bien definido en la literatura para las 116 muestras. Los métodos de preparación y determinación de muestras se describieron en las Secciones 3.1 y 3.3. La Figura 1 muestra los cromatogramas característicos de los estándares mixtos. Se puede observar que los seis componentes efectivos estaban separados según la línea de base y, por lo tanto, podían cuantificarse. El método HPLC se validó antes del análisis de la muestra. Los principales resultados del método HPLC se enumeran en la Tabla 1. En los resultados se muestran una relación lineal favorable (r=0.9998) y una recuperación (98,5 %) del método de determinación de equinacósido, el mismo resultado que los cinco. componentes. Por tanto, se puede determinar con precisión el contenido de los seis componentes eficaces. Todos los rangos de contenido determinados se resumen en la Tabla 1.

2.2. Análisis NIRS

La Figura 2 muestra los espectros NIR (4000–10,000 cm-1) de las muestras de C. tubulosa. Aparecieron picos de absorción significativos de 4000 cm-1 a 7500 cm-1 en todas las muestras, mientras que aparecieron fluctuaciones suaves de 7500 cm-1 a 10 000 cm-1. La deriva de la línea base de los espectros NIR se produjo porque la muestra se vio fácilmente afectada por factores como el tamaño y el color de las partículas (Figura 2A). Se utilizaron pretratamientos matemáticos de los espectros para reducir hasta cierto punto la influencia de información innecesaria. Los pretratamientos matemáticos incluyeron primera derivación (primera derivación), segunda derivación (segunda derivación), variedad normal estándar (SNV) y corrección de dispersión multiplicativa (MSC). La Figura 2B muestra la segunda derivación de los espectros NIR de C. tubulosa, y se observan las variaciones significativas que ocurrieron en tres regiones, 4000–4500 cm−1, 5000–5500 cm−1 y 7000–7500 cm−1.

2.3. Establecimiento de modelos de calibración cuantitativa

La regresión de mínimos cuadrados parciales (PLSR) es un método de modelado clásico y se ha aplicado ampliamente en modelos cuantitativos debido a la alta calidad de los resultados. Las ventajas de PLSR incluyen su buena capacidad de pronóstico y su relativa simplicidad. PLSR también se ha aplicado ampliamente en el establecimiento de modelos de calibración cuantitativa de TCM [25]. Basado en los espectros NIR pretratados, se estableció un modelo de análisis cuantitativo NIR para los seis componentes efectivos en C. tubulosa utilizando el método PLSR con datos de análisis HPLC como valores verdaderos. Las 116 muestras se dividieron aleatoriamente en conjuntos de calibración y validación con una proporción de 3:1. Las condiciones más adecuadas para la calibración fueron elegidas por un RMSEC bajo y un coeficiente de correlación alto.

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2.3.1. Selección de la Banda de Ondas para los Modelos de Calibración

La selección de una banda de ondas adecuada fue un paso importante para la construcción del modelo de calibración. En este estudio, se compararon los espectros de intervalo NIR de 4000–7500 cm-1 (recomendado por el software de analista TQ) y 4000-10 000 cm-1. Se observó que este rango no es adecuado para la calibración en el intervalo entre 4000 cm-1 y 7500 cm-1 de la Tabla 2. Por lo tanto, en el estudio actual, todos los intervalos espectrales para los seis componentes químicos se seleccionaron del intervalo de 4000 a 10 000 cm-1 comparando el rendimiento de RMSEC y el coeficiente de correlación.

2.3.2. Selección del número óptimo de factores para los modelos de calibración

El PLSR explica la cantidad máxima de variabilidad en los datos reduciendo la dimensionalidad de los datos del espectro mediante el cálculo de factores. El problema de la "falta de preparación" surgió debido a la falta de información resultante de un número limitado de factores; sin embargo, elegir factores mayores que los valores óptimos introducidos en el modelo provocará el problema de "sobreajuste". Tanto el "insuficiente ajuste" como el "sobreajuste" reducirán el poder predictivo de los modelos establecidos [22]. La Figura 3 muestra la relación entre RMSECV y los factores de los seis compuestos. Por lo tanto, seleccionamos aquellos factores correspondientes a los valores más bajos de RMSECV. La selección óptima de factores para los modelos de calibración se enumera en la Tabla 3.

2.3.3. Selección de pretratamiento espectral para los modelos de calibración

Otro factor influyente y crítico para los modelos de calibración es el pretratamiento espectral, que tiene como objetivo reducir la influencia de la dispersión y la deriva de la línea base, mejorar las relaciones señal-ruido y eliminar variaciones irregulares. Se utilizaron métodos de corrección de dispersión multiplicativa (MSC) y de variación normal estándar (SNV) para eliminar la influencia de la dispersión de la radiación. Para resolver los efectos de la deriva de la línea base, se compararon los espectros de la primera y la segunda derivada y se seleccionó la segunda derivación. Para lograr el efecto deseado, suavizamos los espectros con el algoritmo de filtro Savitzky-Golay (SG) antes de la derivación para evitar la magnificación del ruido. La Tabla 3 muestra la información sobre el pretratamiento espectral y sus resultados para los modelos de calibración.

2.4. Evaluación de los modelos establecidos

Un buen modelo de calibración NIRS debe tener valores bajos de RMSEC y RMSEP, así como un coeficiente de correlación (r) alto y pequeñas diferencias entre RMSEC y RMSEP. Los modelos de calibración de los seis compuestos seleccionados se establecieron según los procedimientos mencionados anteriormente (Tabla 3). Los valores RMSEC yr para el conjunto de calibración de echinacósido fueron 27,6 y 0.9808, respectivamente. Los parámetros de rendimiento de otros modelos de compuestos químicos se enumeran en la Tabla 3, de la cual podemos concluir que los modelos establecidos obtienen resultados de predicción satisfactorios y pueden usarse para el análisis cuantitativo rápido de C. tubulosa. En la Figura 4 se muestran diagramas de dispersión de los seis compuestos químicos para que los modelos de calibración sean más descriptivos y se observen visualmente. Como se muestra en la Figura 4, se produjeron diferencias menores entre los valores predictivos y medidos, porque la mayoría de los puntos se distribuyeron alrededor de la curva regresiva con una ecuación como y=x. Por lo tanto, se observaron excelentes rendimientos predictivos en la Figura 4.

3. Materiales y métodos

3.1. Preparación de la muestra

Se recolectaron ciento dieciséis muestras de C. tubulosa de la prefectura de Hotan en la región autónoma de Xinjiang de 2013 a 2015. Todas las muestras fueron cultivadas, pero se recolectaron en diferentes etapas de crecimiento. El peso fresco de las muestras osciló entre 20 ga 1000 g. Después del secado al sol, las muestras secas se trituraron y tamizaron a través de un tamiz de malla 60-.

3.2. Recopilación de datos espectroscópicos NIR

Los espectros NIR de las muestras se recogieron en un intervalo de 8 cm-1 sobre la región espectral de 4000-10.000 cm-1 con un sistema Antaris MXFT-NIR (Thermo Scientific, Madison, WI, EE. UU.) equipado con un adaptador de reflectancia de fibra óptica portátil. Cada espectro se obtuvo promediando 64 exploraciones. Se permitió que todas las muestras se equilibraran a temperatura ambiente (25 ◦C) antes del escaneo de los espectros NIR para garantizar que las muestras se analizaran a la misma temperatura. La humedad en el laboratorio se mantuvo a nivel ambiental.

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3.3. Recopilación de datos de HPLC

3.3.1. Preparación de extracción

Se extrajo un gramo de polvo de C. tubulosa con 50 ml de metanol al 50% en un matraz cónico con ultrasonicación (500 W, 40 KHz) durante 30 min. El extracto se almacenó a 4 ◦C. El sobrenadante del extracto se filtró para obtener una muestra para análisis por HPLC.

3.3.2. Determinación simultánea de echinacósido y verbascósido con HPLC-UV

El análisis por cromatografía líquida se realizó en un sistema Shimadzu UHPLC (Shimadzu, Kyoto, Japón) que consta de dos unidades de administración de disolvente LC-20ADXR, una bomba LC-20AD, una bomba automática SIL-20ACXR. muestreador, un horno de columna CTO-20AC, un detector DAD SPD-M20A, un desgasificador DGU-20A3R y un controlador CBM-20A.

Una columna Grace Prevail Carbohidrato ES (150 × 2,1 mm, 2,7 mm) utilizada para las separaciones cromatográficas se mantuvo a 35 ◦C. La fase móvil consistía en acetonitrilo (A) y 0.ácido fórmico acuoso al 1 % (B) y se administró siguiendo el programa de gradiente de la siguiente manera: 0–7 min, gradiente lineal de 10–20 % A; 7 a 15 minutos, 20 % A; y 15–20 min, gradiente lineal de 20–10% A. El caudal de la fase móvil fue de 0,4 ml/min. La monitorización UV se realizó a 330 nm.

3.3.3. Determinación simultánea de manitol, sacarosa, glucosa y fructosa con HPLC-ELSD

La HPLC se realizó en un sistema LC Agilent serie 1100 (Palo Alto, CA, EE. UU.) que consta de un desgasificador G1322A, una bomba cuaternaria G1311A, un muestreador automático G1311A, un controlador de temperatura de columna G1316A y un detector DAD G1315B.

Se empleó una columna Sigma Prevail Carbohidrato ES (4,6 × 250 mm, 5 µm) para las separaciones cromatográficas y se mantuvo a una temperatura de la columna de 25 ◦C. La fase móvil estaba compuesta de acetonitrilo y agua (77:23, v/v) y se suministró aliado isocrático a un caudal de 0,7 ml/min. El efluente se monitoreó utilizando un detector de dispersión de luz evaporativa (ELSD) con parámetros predeterminados.

3.4. Procesamiento de datos

Se utilizó TQ Analyst (versión 8.0, Thermo Scientific, Madison, WI, EE. UU.) para realizar la división de los conjuntos de calibración y validación, el pretratamiento matemático de los espectros, el establecimiento de los modelos de calibración y otros cálculos. . Para realizar las figuras se utilizó Origin (versión 9.1).

4. Conclusiones

En este estudio, propusimos un método rápido y no destructivo para el análisis simultáneo deequinacósido, verbascósido, manitol, sacarosa, glucosa y fructosaenC. tubulosapor NIRS. Los análisis de los valores RMSEC, coeficiente de correlación, RMSEP y Rp demostraron que los modelos cuantitativos NIR establecidos podrían usarse para predecir con precisión el contenido de los seis componentes efectivos seleccionados enC. tubulosa. En comparación con HPLC, el método NIRS informado en este estudio puede ahorrar una cantidad significativa de trabajo y tiempo, al tiempo que mantiene una capacidad de análisis cuantitativo satisfactoria. Por lo tanto, el método aquí reportado tiene el potencial de ser utilizado en el control de calidad deC. tubulosay así guiar el desarrollo de la tecnología de cultivo y proceso paraC. tubulosa.

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