La lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos secretada muestra una mayor capacidad para inhibir el agrandamiento de los quistes de las células de la PQRAD en comparación con la forma no secretada

Palabras clave: PQRAD;lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos; cultura 3D

NUEVAS HIERBAS PARA

1. Introducción

La enfermedad renal poliquística (PKD), una de las enfermedades hereditarias más comunes, se caracteriza por el desarrollo de quistes llenos de líquido a lo largo de múltiples segmentos de la nefrona [1]. La PKD es la forma más común de PKD, que es una PKD que comienza en la edad adulta y la mayoría de los pacientes no desarrollan síntomas hasta los cuarenta años [2]. La PQRAD es el resultado de mutaciones en los genes PKD1 (85%) o PKD2 (15%) que codifican la policistina-1 (PC1) y la policistina-2 (PC2), respectivamente [3,4]. Los defectos en PC1 o PC2 se asocian con aumentos anormales en la proliferación de células epiteliales renales y causan además la formación de quistes [5-7]. A medida que avanza la PQRAD, los quistes se agrandan y alteran la arquitectura normal del riñón, lo que eventualmente conduce a insuficiencia renal. Sin embargo, el mecanismo implicado en la PQRAD es complicado y aún está por explorar. La pérdida funcional de PC1 y/o PC2 en la PQRAD conduce a una reducción de las concentraciones de calcio intracelular, lo que alivia la adenilil ciclasa (AC) sensible al calcio y produce además un aumento del nivel de monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) intracelular [8,9]. El AMPc estimula la proliferación de células epiteliales y la secreción de líquido para promover el agrandamiento del quiste mediante la activación de la proteína quinasa A (PKA) y la vía Ras/B-Raf/MEK/ERK aguas abajo [10,11]. Se ha demostrado que la disfunción de la autofagia se produce en modelos de pez cebra y ratones con PQRAD in vitro [12] y en modelos de rata in vivo [13]. La autofagia es un mecanismo crucial que mantiene la homeostasis de células y órganos mediante la degradación y el reciclaje de orgánulos, proteínas de larga vida y nutrientes [14,15]. Se produce una comunicación cruzada entre la vía mTOR de la autofagia y la apoptosis, que está desregulada en la PKD [16]. El tratamiento con activadores de la autofagia, como la rapamicina y la carbamazepina, puede atenuar significativamente la formación de quistes [12]. Anteriormente, establecimos un modelo de ratón con ADPKD llamado Pkd1L3/L3 (con antecedentes genéticos C57BL/6) [17] mediante la inserción de un sitio loxP y un casete mc1-neo flanqueado por loxP en los intrones 30 y 34 del gen Pkd1. , respectivamente (L3 significa tres sitios loxP dentro del alelo), para generar la mutación genética condicional. Los ratones Pkd1L3/L3 produjeron niveles bajos (20% del control) de PC1, lo que indujo un crecimiento agresivo de quistes y una expansión del volumen renal con la edad [17]. Además, se estableció un modelo celular de PQRAD (línea celular 2L3) mediante la transducción del virus SV40 de células epiteliales renales primarias de ratones Pkd1L3/L3 para inducir líneas celulares inmortalizadas [18].

La lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL), una proteína secretada de 22-kD, se considera un biomarcador de lesiones renales, incluida la PKD en adultos [19] (pero no en niños [20]), la enfermedad renal crónica [21 ] e isquemia renal aguda [22]. El mecanismo por el que la proteína NGAL aumenta en la orina del paciente no está claro; se ha propuesto que la NGAL acumulada en la orina se relaciona con la deciliación de las células epiteliales renales como resultado de una lesión [23]. Algunos estudios han indicado que la NGAL desempeña un papel protector contra las lesiones renales, la localización de la isquemia [24] y la supresión de la progresión del quiste [25], mientras que algunos estudios sugirieron que la NGAL podría estar implicada en la progresión del quiste [26] y el desarrollo de tumores [27 ]. El receptor NGAL (NGAL-R, Slc22a17) se expresa en múltiples tejidos epiteliales, incluidas las nefronas renales [28]. El acoplamiento de NGAL y NGAL-R puede secuestrar hierro intracelular e inducir aún más apoptosis [29], que se asocia con una estrategia de agotamiento de hierro del sistema inmunológico innato contra la infección bacteriana [30].

Se ha demostrado que la administración de NGAL exógena aumenta la apoptosis de las células Pkd1-/- y disminuye aún más el crecimiento de quistes in vitro [25]. En trabajos anteriores, generamos ratones Pkd1L3/L3 × NGAL-/- y ratones Pkd1L3/L3 × NGALTg/Tg cruzando ratones Pkd1L3/L3 con ratones transgénicos y knockout para NGAL, respectivamente [31]. Encontramos que la sobreexpresión de NGAL en un modelo de ratón con ADPKD (ratones Pkd1L3/L3 × NGALTg/Tg) redujo la progresión del quiste y prolongó la vida útil de los ratones Pkd1L3/L3, acompañado de cambios en una serie de vías moleculares involucradas en la proliferación, la apoptosis y fibrosis [31]. Sin embargo, el mecanismo subyacente de los efectos de NGAL para aliviar la progresión de la PQRAD sigue siendo enigmático.

En este estudio, se estableció una plataforma de cultivo celular en 3D para probar la progresión del quiste de las células epiteliales renales Pkd1L3/L3 (células 2L3) con la adición de proteína NGAL recombinante de ratón (mNGAL) o la sobreexpresión de NGAL transgénica in vitro. Además, se exploraron los efectos de lo mental sobre las vías relacionadas con la proliferación, la apoptosis y la autofagia. Además, el mecanismo de NGAL en células 2L3 se aclaró examinando los efectos de la sobreexpresión de NGAL secretada (pN + LS) y NGAL no secretada (pN - LS) en células 2L3. En este estudio se exploraron parcialmente el efecto y el posible mecanismo de la proteína NGAL en las células ADPKD.

2. Materiales y métodos

2.1. Líneas celulares

La línea celular Pkd1L3/L3 (2L3) se estableció mediante la transducción del virus SV40 de células epiteliales renales primarias de ratones 2L3, un modelo de ratón con PQRAD, para inducir una línea celular inmortalizada [17,18]. Las células renales primarias se infectaron en su segundo pase utilizando un kit de inmortalización del virus Lenti SV40 (Capital Biosciences Inc., Gaithersburg, MD, EE. UU.). Las células se incubaron en CO2 al 5% a 37 ◦C y se trataron con polibreno (8 µg/mL) durante la noche en una placa de seis pocillos. Al día siguiente, se descartó el sobrenadante viral y las células se incubaron en un medio nuevo. Después de alcanzar la confluencia, las células se subcultivaron en una placa de 10- cm con medio de cultivo y se consideraron células de paso uno (P1). Se seleccionaron clones transformados SV40- y se aislaron mediante anillos de clonación [17,18]. La línea celular M-1 (Pkd1+/+) adquirida en BCRC (Hsinchu, Taiwán) se utilizó como línea celular de tipo salvaje.

2.2. Cultivo celular

Las células se pasaron cada tres días. Para probar la IC50 de mNGAL en células ADPKD, se sembraron células 2L3 en placas de 24-pocillos (6000 células/pocillo) con 500 µL del medio descrito anteriormente y se incubaron durante 16 h. Luego, las células se trataron con mNGAL recombinante (0, 20, 40, 80, 160, 320 µg/ml) o rapamicina (1 µM, de Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) durante otros 0, 8, 24 o 48 h (n=4).

2.3. Tinción con lectina

Para comprobar si las células M{{0}} y 2L3 provenían de túbulos renales de orígenes similares, se realizó tinción con lectina de Lotus tetragonolobus (LTL, que es un marcador diferenciado del túbulo proximal marcado con fluoresceína) y aglutinina de Dolichos biflorus (DBA). , que es un marcador diferenciado del conducto colector marcado con rodamina). LTL y DBA se adquirieron en Vector Laboratories (Burlingame, CA, EE. UU.). Para la observación de las células, las células cultivadas en el cubreobjetos se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) tres veces durante 10 minutos y luego se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS durante 30 minutos. Después de la permeabilización con Triton X-100 al 0,4% en PBS (PBST) durante 20 minutos, las células se bloquearon con suero de caballo al 10% en PBST durante 1,5 h. Las células se tiñeron con LTL (20 µg/mL) y DBA (20 µg/mL) durante 1 h a 37 ◦C. Los núcleos se tiñeron con DAPI (1 µg/ml) durante 5 min. Las muestras se lavaron con PBST tres veces durante 10 minutos entre los pasos.

2.4. Lisado de ADN y genotipado

Para el genotipado del gen Pkd1, se utilizaron cebadores directos (50 -TGTGTTGTTCTTTGTGGCAGTCAG-30) e inversos (50 -ATTCTCAATGACTGACTTGGGCTC-30) para amplificar secuencias de ADN genómico. Las muestras se calentaron a 94 ◦C durante 5 min y luego se realizaron 30 ciclos (94 ◦C durante 1 min, 56 ◦C durante 1 min, 72 ◦C durante 1 min), seguidos de 72 ◦C durante 10 min y 25 ◦ C durante 5 min. Después de amplificar por PCR, los productos de ADN se mezclaron con tinte de carga 6X y se analizaron usando gel de agarosa Tris-borato-EDTA (TBE) al 1%.

2.5. Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real con transcripción inversa cuantitativa (RT-qPCR)

El ARN total de la línea celular se aisló utilizando un kit de extracción de ADNg MagQu (MagQu, New Taipei City, Taiwán) seguido de un tratamiento con DNasa I (Worthington, Lakewood, Nueva Jersey, EE. UU.) y se almacenó en ddH2O a −80 ◦C. La calidad y concentración del ARN se determinaron utilizando un gel de agarosa TBE al 1% y un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). El ARN molde se transcribió inversamente a ADNc utilizando un kit de síntesis de ADNc RevertAid First Strand (Thermo Fisher Scientific) en presencia del inhibidor de ARNasa RNaseOUTTM (G-Biosciences, St. Louis, MO, EE. UU.). Cada reacción se preparó en un volumen total de 20 µL, incluido ARN total (100 ng), cebador Oligo (dT)18 (1 µL), tampón de reacción 5X (4 µL), inhibidor de ARNasa RiboLock (20 U), mezcla dNTP ( 1 mM), transcriptasa inversa RevertAid (200 U) y agua libre de nucleasas. Para la síntesis de ADNc de primera cadena, las muestras se calentaron a 42 ◦C durante 1 h y luego la reacción se terminó calentando a 70 ◦C durante 1 min.

La cuantificación de la expresión génica se realizó utilizando un sistema de PCR en tiempo real StepOne™ (Applied Biosystems, Norwalk, CT, EE. UU.). Cada muestra se preparó en un volumen total de 20 µL, incluidos cebadores directos (100 nM) e inversos (100 nM) específicos del gen (Tabla 1), plantilla de ADNc (100 ng), ORATM SEE qPCR Green ROX H Mix (1× , high GmbH, Kraichtal, Alemania) y agua PCR. Las muestras se calentaron a 95 ◦C durante 2 min, seguido de 40 ciclos (95 ◦C durante 5 s, 65 ◦C durante 25 s) y luego análisis de la curva de fusión (95 ◦C durante 15 s, 60 ◦C durante 1 min). , 95 ◦C durante 15 s) utilizando un sistema de PCR en tiempo real StepOne™. Los datos se analizaron con el software StepOne™ (v2.3). La expresión genética de Gapdh se utilizó para la normalización.

2.6. Ensayo de viabilidad celular

La viabilidad celular se determinó utilizando bromuro de tetrazolio azul de tiazolilo (ensayo MTT) (Sigma). Se añadió solución de MTT (0.5 mg/mL) a cada pocillo y se incubó a 37 ◦C durante 2 h. Para solubilizar los cristales de formazán púrpura, se añadió dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma) a cada pocillo después de retirarlos. el medio y la solución MTT. La densidad óptica (DO) de cada muestra a 570 nm se midió utilizando un lector ELISA (Thermo Fisher Scientific).

2.7. Ensayo de proliferación celular

Se realizó el ensayo de proliferación celular con bromodesoxiuridina (BrdU) (Millipore, Burlington, MA, EE. UU.) para analizar la proliferación de células M-1 y 2L3. Para comparar la capacidad de proliferación de las células M-1 y 2L3, las células se cultivaron en placas de 96-pocillos (5 x 103 células/pocillo) durante 24 h. Se añadió BrdU al medio 2 h antes del final del período de incubación. Para explorar el efecto de mNGAL sobre la proliferación de células 2L3, primero se cultivaron células 2L3 en placas 96-pocillos (2 x 103 células/pocillo) durante 16 h, seguido de tratamiento con mNGAL durante otras 8, 24 y 48 h. Se añadió BrdU al medio 2 h antes del final del período de incubación de la comida. Luego, las células se fijaron con solución fijadora (200 µL/pocillo) a 37 ◦C durante 30 min, seguido de incubación con anticuerpo de detección BrdU (100 µL/pocillo) a 37 ◦C durante 1 h y anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa. (100 µL/pocillo) a 37 ◦C durante 30 min. Las células se lavaron tres veces con tampón de lavado y se secaron con toallas de papel entre los pasos descritos anteriormente.

Después de la incubación con sustrato de peroxidasa TMB (100 µL/pocillo) a 37 ◦C durante 30 min en la oscuridad, la reacción se detuvo con solución de parada (100 µL/pocillo). Finalmente, se midió la DO450 de cada muestra utilizando un lector ELISA (Thermo Fisher Scientific).

2.8. Ensayo de apoptosis

Para el análisis de la apoptosis mediante citometría de flujo, se sembraron células 2L3 en placas 6-pocillos (1,8 × 105 células/pocillo) con 2 ml de medio y se incubaron durante 16 h. Luego, las células se trataron con mNGAL (0, 600, 1200 µg/mL) durante otras 0, 4 o 12 h, se recogieron y se tiñeron con Anexina V-FITC y PI (BD Biosciences, San José, CA, EE. UU. ) para análisis por citometría de flujo a las 4 y 12 h, respectivamente (n=3, para control y mNGAL). Para establecer la compensación y los cuadrantes antes del análisis, se utilizaron células no teñidas, células teñidas solo con Anexina V-FITC y células teñidas solo con PI.

2.9. Análisis de transferencia Western

Las células se recogieron y se lisaron con RIPA suplementado con un cóctel de inhibidor de proteasa (1:100) y fosfatasa (1:100). Después de la incubación durante 30 minutos a 4 ◦C, los lisados ​​celulares se centrifugaron durante 15 minutos a 13.400 x g (Eppendorf 5415R, Hamburgo, Alemania) a 4 ◦C. Las concentraciones de proteína se midieron utilizando el ensayo BCA. Se separaron electroforéticamente cantidades iguales de proteína (25 µg de proteína con tinte de carga 1:2/pocillo) mediante SDS-PAGE (10%) y se transfirieron durante 1 h a membranas de PVDF. Luego se bloquearon las membranas con leche desnatada al 5 % en solución salina tamponada con Tris con Tween-20 (TBST) al 0,1 % durante 2 h a temperatura ambiente. Después de lavar con TBST tres veces durante 10 minutos, las membranas se incubaron con anticuerpos primarios (Tabla 2) durante la noche a 4 ◦C, seguido de una incubación de 1- h con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Tabla 3).

2.10. Cultivo celular tridimensional (cultivo 3D)

El cultivo 3D se realizó utilizando la matriz Matrigel (Corning, NY, EE. UU.) para evaluar la formación de quistes. Las células 2L3 se sembraron en placas 96-pocillos (1000 células/pocillo) sobre Matrigel preformado (40% en medio). Después de unir las células al gel, se añadió más Matrigel a las células para formar un patrón similar a un sándwich (Figura 6). Las células se mantuvieron en cultivo 3D a 37 ◦C y 5% de CO2. Las células se trataron con forskolina (20 mM, Sigma) desde el día 1 al día 3 para inducir la formación de quistes. Después de la inducción de la formación de quistes con forskolina, las células se trataron con o sin mNGAL (2 mg/ml) desde los días 4 al 8 y el medio se cambió todos los días. La formación de quistes se observó bajo un microscopio todos los días y el diámetro, el área y el número del quiste se midieron con ImageJ. La inmunocitoquímica (ICC) se realizó el día 8 en la placa o cubreobjetos. La observación de los quistes se realizó mediante microscopía confocal (ZEISS, Oberkochen, Alemania).

2.11. Inmunocitoquímica (ICC)

Para la observación de quistes, los quistes cultivados con Matrigel en pocillos o en cubreobjetos se lavaron tres veces con PBS durante 10 min y luego se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS durante 30 min. Después de la permeabilización con PBST al 0,4% durante 20 minutos, los quistes se bloquearon con suero de caballo al 10% en PBST durante 2 h. Los quistes se tiñeron con anticuerpos primarios contra E-cadherina (1:500; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.) y actina (1:1000; Millipore) durante la noche a 4 ◦C y luego se tiñeron con anticuerpo secundario fluorescente (Tabla 3). en oscuridad durante 1 h a temperatura ambiente. Los núcleos se tiñeron con DAPI (1 µg/ml) durante 5 min. Las muestras se lavaron con PBST tres veces durante 10 minutos entre los pasos.

2.12. Microscopía confocal

Para confirmar que las construcciones esféricas observadas en el cultivo 3D eran quistes, se montaron cubreobjetos del cultivo 3D en portaobjetos con medio de montaje Fluoromount-G (SouthernBiotech, Birmingham, AL, EE. UU.) y se tomaron imágenes con un microscopio confocal. Las imágenes confocales se realizaron con un objetivo de inmersión en aceite de 63 ×. Se obtuvieron diferentes secciones ópticas en Z de un quiste 2L3 en cultivo 3D utilizando el módulo Z-stack en el software de microscopio ZEISS ZEN (Oberkochen, Alemania). Las secciones ópticas de quistes se reconstruyeron en Z-stack o video 3D utilizando el software de microscopio ZEISS ZEN.

2.13. Construcción de plásmidos e infección por virus

La secuencia NGAL de ratón (534 pb) se insertó en el vector pSecTag2B (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) en el marco y aguas abajo de una secuencia líder de cadena Igκ murina para sobreexpresar la proteína NGAL secretada. Por el contrario, la secuencia líder de la cadena de Igκ murina en el plásmido descrito anteriormente se eliminó para sobreexpresar la proteína NGAL no secretada. pSecTag2B-NGAL con o sin la secuencia líder (pN + LS o pN - LS, respectivamente) se diseñó para estudiar la asociación entre NGAL y el receptor de NGAL. Para garantizar la inserción correcta de las construcciones, se utilizaron NheI y NotI para digerir pN + LS o pN − LS con NEBuffer 2 (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE. UU.) a 37 ◦C durante 2 h, seguido del análisis utilizando una solución al 1%. Gel TBE.

Para generar clones estables, se incubaron células 2L3 en medio DMEM/F12 (300 µl/pocillo) suplementado con 10 % de FBS termoinactivo, 1 % de P/S, polibreno (8 µg/ml) y lentivirus (200 µl) en una placa de pocillos 6- a 37 ◦C durante 24 h. Luego se descartó el sobrenadante del virus y las células se lavaron con PBS y se incubaron con medio nuevo que contenía blasticidina (4 µg/ml) para la selección de células infectadas. El medio de selección se cambió cada 3 días. Las células infectadas se recolectaron una semana después de la selección con blasticidina para transferencia Western y RT-QPCR para analizar el nivel de expresión de mNGAL.

2.14. Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)

La cuantificación de NGAL secretada por las células se realizó utilizando un kit ELISA sándwich en fase sólida de lipocalina de ratón {{0}} (Lcn2) (Thermo Fisher Scientific). El medio sobrenadante de las células se recogió, se centrifugó para eliminar los restos celulares y se almacenó a −80 ◦C. Para la curva estándar, se prepararon diluciones en serie 8X de proteína NGAL de ratón estándar (0, 0,024, 0,195, 1,563, 12,5, 100 ng/ml). Se agregaron estándares (100 µl/pocillo) y muestras (100 µl/pocillo de 10 µg de proteína total del lisado celular o sobrenadante no diluido) a la placa de pocillos 96- y se incubaron a 37 ◦C durante 2,5 h. Cada pocillo se incubó con conjugado de biotina (100 µL/pocillo) a 37 ◦C durante 1 h y luego con solución de estreptavidina-HPR (100 µL/pocillo) a 37 ◦C durante 45 min con agitación suave. Se descartó la solución y se lavó el pocillo con

Después de la incubación con sustrato TMB (100 µL/pocillo) a 37 ◦C durante 30 minutos en la oscuridad, la reacción se detuvo mediante la adición de solución de parada (50 µL/pocillo). Finalmente, se midió la DO450 de cada muestra utilizando un lector ELISA (Thermo Fisher Scientific).

2.15. Análisis estadístico

Todos los datos se muestran como media ± desviación estándar (DE). Para comparaciones de medias múltiples, los datos se analizaron utilizando la prueba t de Student y el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con las pruebas post hoc de Tukey en R Studio. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando el valor de p < 0.05.