Información estructural y funcional sobre el polimorfismo de fibrillas de -sinucleína, parte 3

4.3. -Cepas Syn en muestras de sinucleinopatía humana

Las diferencias estructurales y funcionales observadas en las cepas recombinantes pueden validarse identificando y caracterizando fibrillas directamente de muestras de pacientes con sinucleinopatía.

Las cepas recombinantes se refieren a especies microbianas que han sido recombinadas a nivel genético. Se han logrado enormes avances en esta área, lo que nos brinda muchas oportunidades. Al mismo tiempo, los científicos estudian constantemente el impacto de las cepas recombinantes en los seres humanos y el medio ambiente. Los resultados de las investigaciones de los últimos años han demostrado que las cepas recombinantes tienen un impacto positivo en la memoria humana.

Los estudios han encontrado que las cepas recombinantes pueden afectar la capacidad cognitiva y la memoria humana al mejorar la actividad metabólica de los microorganismos en los intestinos y aumentar la flora beneficiosa en los intestinos. Este mecanismo de comunicación del eje intestino-cerebro se denomina "interacción intestino-cerebro".

En concreto, la cepa recombinante puede promover la reparación de la barrera hematoencefálica aumentando la flora beneficiosa en el intestino, promoviendo así el funcionamiento normal del cerebro. Además, la cepa recombinante pudo aumentar la liberación de dopamina y neuropéptidos, que son fundamentales para la memoria y el aprendizaje a largo plazo.

Por lo tanto, los científicos sugieren que las personas deberían comer más alimentos ricos en probióticos y prebióticos, como yogur, café y alimentos integrales. Además, las personas también pueden complementar los probióticos en los intestinos consumiendo algunas cepas recombinantes específicas, promoviendo así aún más el efecto de la interacción intestino-cerebro.

En resumen, existe una relación positiva entre las cepas recombinantes y la memoria. Las personas deberían tomar algunas medidas efectivas para promover la comunicación entre los intestinos y el cerebro, mejorando así su memoria y sus capacidades cognitivas. Se puede ver que necesitamos mejorar la memoria, y Cistanche deserticola puede mejorar significativamente la memoria, porque Cistanche deserticola también puede regular el equilibrio de los neurotransmisores, como aumentar los niveles de acetilcolina y factores de crecimiento. Estas sustancias son muy importantes para la memoria y el aprendizaje. Además, Cistanche deserticola también puede mejorar el flujo sanguíneo y promover el suministro de oxígeno, lo que puede garantizar que el cerebro reciba suficientes nutrientes y energía, mejorando así la vitalidad y la resistencia del cerebro.

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La primera evidencia de una cepa derivada del cerebro provino de un estudio fundamental realizado por Prusineret al. [270], que demostró que los extractos cerebrales de MSA son transmisibles a células y ratones transgénicos, lo que resulta en abundante patología -Syn [270]. Por el contrario, esto no se observó utilizando extractos cerebrales de EP, lo que sugiere que la cepa derivada de la EP puede diferir de la MSA [270].

Luego viene la pregunta, ¿qué podría llevar a -Syn a adoptar una conformación diferente en MSA o PD? In vitro, diversas condiciones de la solución (como la presencia o ausencia de sal) dan lugar a fibrillas con diferentes propiedades estructurales y funcionales [29]. De manera similar, -Syn también está expuesto a varios microambientes in vivo, lo que afecta su agregación [271].

Las neuronas dopaminérgicas en la EP y los oligodendrocitos afectados en la AMS pertenecen a diferentes linajes celulares y tienen entornos celulares distintos. Lee y sus colaboradores demostraron que los distintos ambientes intracelulares de dos líneas celulares imparten formación de tensión en MSA y PD [34]. -Las fibrillas Syn derivadas de GCI en oligodendrocitos (GCI- -Syn) y LB en neuronas (LB- -Syn) de cerebros enfermos difieren significativamente y exhiben distintas capacidades de siembra [34].

La cepa GCI- -Syn es muy eficaz en la siembra -Synaggregation en comparación con LB- -Syn, lo que contribuye a la agresividad de MSA [34]. -También se han detectado agregados de Syn en fluidos biológicos como el líquido cefalorraquídeo (LCR) y el plasma de pacientes con EP [272,273]. -La agregación de Syn comienza años antes de la aparición de los síntomas reales de la enfermedad y, por lo tanto, la detección de estos agregados en etapas tempranas puede permitir la identificación y caracterización de una cepa particular en estos fluidos.

En este contexto, recientemente se ha desarrollado la amplificación de agregados -Syn a partir de extractos cerebrales de pacientes con EP y MSA mediante la técnica de amplificación cíclica por plegamiento incorrecto de proteínas (PMCA). Esta técnica implica la amplificación de proteínas mal plegadas in vitro, como la amplificación del ADN mediante PCR [274]. Consiste en ciclos alternos de incubación y sonicación, lo que da como resultado la replicación amiloide.

Primero, se incuba una pequeña cantidad de amiloide con un exceso de proteína nativa para inducir el crecimiento del polímero. Luego, la mezcla de muestra se somete a sonicación, lo que descompondrá las fibrillas y dará como resultado varios núcleos.

Cada núcleo recién formado actuará como una semilla en el siguiente ciclo e inducirá aún más el crecimiento de fibrillas. De esta manera, después de cada ciclo, el número de semillas aumentará exponencialmente y permitirá detectar la mínima cantidad de agregados mal plegados presentes al inicio [274]. Soto y sus colaboradores utilizaron PMCA para amplificar los agregados -Syn del LCR de los pacientes diagnosticados con EP y MSA [52].

Descubrieron que las fibrillas derivadas de PD y MSA exhiben diferentes propiedades biofísicas y bioquímicas y corresponden a distintas cepas conformacionales de -Syn [52]. Incluso se ha demostrado que los agregados de -Syn amplificados a partir de homogenados cerebrales de EP y MSA ejercen una toxicidad y neurodegeneración variables en neuronas dopaminérgicas humanas, lo que refleja la diferente gravedad de la enfermedad observada en pacientes con EP y MSA debido a diferentes cepas de -Syn [275].

Estos hallazgos sugieren de manera concluyente que las sinucleinopatías se pueden distinguir según el tipo de cepa -Syn presente en el cerebro. Sin embargo, la complejidad en la detección de agregados surge cuando se observa heterogeneidad entre pacientes en la misma enfermedad. Esta heterogeneidad en los agregados -Syn amplificados a partir de extractos cerebrales de pacientes con EP es mayor que en los extractos cerebrales de MSA [276].

Strohaker y cols. informaron que las fibrillas derivadas de la EP y la MSA no exhiben propiedades estructurales marcadamente distintas [276], en contraste con los hallazgos informados por Soto y colaboradores [52].

La posible razón de las observaciones contrastantes podrían ser las diferencias en los protocolos PMCA utilizados por los dos grupos [277]. Además, Strohaker et al. utilizó un tamaño de muestra mucho más pequeño que el grupo de Soto [52,276]. Otros factores, como los antecedentes genéticos de los pacientes, la edad de los pacientes seleccionados, una carga de agregados -Syn en diferentes pacientes, la presencia de otros componentes en los extractos y la región del cerebro de donde se realizó la extracción, también podrían ser responsable de estas diferencias [276].

También existen contradicciones similares en el campo de la patología de la EA. Hallazgos recientes en muestras de tau derivadas del cerebro han sugerido que existe heterogeneidad entre pacientes en las conformaciones de las fibrillas de tau dentro de la misma enfermedad, la EA [278]. Sin embargo, Goedert y sus colegas observaron el mismo tipo de conformación tau en todos los casos de EA analizados hasta ahora, lo que sugiere que las fibrillas tau de una única enfermedad (como la EA o la enfermedad de Pick) adoptan un pliegue estructural común [218,219].

Aunque las razones y factores que impulsan esta especificidad estructural en las tauopatías no están claros, podría deberse a múltiples isoformas de tau, PTM, interacciones con otras moléculas de proteínas, cofactores, etc.

Recientemente, Scheres y Godert presentaron una clasificación jerárquica de taufibrillas de diferentes tauopatías basada en los pliegues de sus filamentos [279]. Queda por determinar si existe una clasificación similar para las fibrillas -Syn aisladas de muestras de sinucleinopatía. Recientemente, Schweighauser et al. han realizado un gran esfuerzo para resolver la estructura de -Synder derivada del cerebro humano, utilizando Cryo-EM [280].

El grupo descubrió que los filamentos -Syn del cerebro de pacientes con DCL no se tuercen y son más delgados que los derivados del cerebro de pacientes con MSA [280], lo que coincide con los hallazgos anteriores [3]. La falta de torsiones en las fibrillas derivadas de DLB impidió la determinación de la estructura 3D mediante crio-EM y las diferencias en las fibrillas -Syn derivadas de pacientes con MSA y DLB se extrajeron basándose en un promedio de clase bidimensional [280].

Aunque necesitamos más estructuras de alta resolución derivadas de pacientes con sinucleinopatía para llegar a una conclusión definitiva, los informes actuales ciertamente fortalecen las afirmaciones sobre la existencia de distintos tipos de fibrillas de -Syn.

Además, las estructuras de los filamentos -Syn de los casos de EP aún no están disponibles, pero resolverlas en el futuro puede ayudar significativamente a comprender el mecanismo de la enfermedad y generar enfoques terapéuticos contra las sinucleinopatías.

5. Modelos estructurales de alta resolución de cepas de fibrillas sintéticas existentes

Hasta ahora se han utilizado varias técnicas biofísicas, como ssNMR, microdifracción de electrones, EPR, dicroísmo circular (CD), RMN de intercambio de hidrógeno/deuterio (HDXNMR) y crio-EM, para determinar la estructura de las fibrillas -Syn a diferentes resoluciones.

Estas técnicas han sentado las bases del polimorfismo a nivel molecular en las fibrillas. La estructura de lámina del núcleo de fibrillas utilizando ssNMR reveló dos fibrillas, la forma A y la forma B, mediante la asignación secuencial de 48 residuos del núcleo [56].

El estudio aclaró la presencia de dos polimorfos de fibrillas que pueden haberse formado debido a diferentes mecanismos de fibrilación [56]. Del mismo modo, las dos estructuras de fibrillas contrastantes, 'cintas' y 'fibrillas', generadas in vitro mostraron diferencias en la longitud, distribución y número de elementos de la hoja en su estructura de fibrillas analizadas por ssNMR [29].

Sin embargo, a pesar de varios intentos, sigue siendo en gran medida desconocido en qué se diferencian los polimorfos de fibrillas -Syn en la estructura atómica. La revolución en el polimorfismo estructural se produjo después de que se resolvió la estructura de la fibrilla -Syn utilizando crio-EM a nivel de resolución atómica. Stahlberg y el grupo revelaron que las fibrillas -Syn (residuos 1 a 121) constan de dos protofilamentos idénticos [61].

Las láminas de cada protofilamento interactúan y estabilizan la estructura mediante una geometría de cremallera hidrofóbica [61]. En particular, los residuos 50 a 57 ubicados en la interfaz del protofilamento también son el sitio de mutantes familiares de PD (A53T/V/E), H50Q y G51D [61]. En este sentido, se predijo que estas mutaciones podrían cambiar la estructura fibrilar, dando lugar a diferentes tipos de fibrillas.

Estudios crio-EM posteriores de la estructura de -Syn de longitud completa han mostrado una diferencia en quiralidad y torsión helicoidal [281] en comparación con la estructura de fibrillas -Syn truncada C-terminal (residuos 1-121) [61]. Se creía que estas diferencias en las estructuras de las fibrillas de longitud completa (1-140) y truncadas en el extremo C-terminal podrían deberse al polimorfismo de las fibrillas.

La prueba directa de estas teorías se obtuvo mediante estudios fundamentales recientes que utilizaron crio-EM para delinear los modelos de polimorfos de fibrillas -Syn. Li y col. identificaron dos polimorfos de fibrillas, 'barra' y 'tornado', con una estructura de núcleo de protofilamento común pero diferentes interfaces entre protofilamentos [57]. Los polimorfos de tornado muestran un archmotivo doblado - - ordenado, mientras que los polimorfos de varilla reclutan algunos residuos adicionales para formar un motivo de "llave griega", como también informaron otros grupos [55,61,281].

La existencia de polimorfos en formas de varilla y tornado sugiere que las diferencias en el empaquetamiento de la misma estructura del núcleo pueden conducir al polimorfismo. También se han realizado observaciones similares para otras proteínas amiloides, como la -amiloide y la tau, donde los protofilamentos con la misma estructura del núcleo pero con diferentes disposiciones de empaquetamiento conducen a estructuras polimórficas [40,282].

Además, las dos nuevas formas polimórficas de fibrillas -Syn generadas in vitro, denominadas polimorfos 2a y 2b, respectivamente, son diferentes de los polimorfos 1a y 1b previamente informados [57,61,281]. En el polimorfo 1a [61], las interacciones entre los residuos en el Las interfaces de protofilamentos están mediadas por la formación de una geometría de cremallera estérica hidrófoba, mientras que en los polimorfos 2a y 2b, están mediadas por puentes salinos [41,61].

Una inspección más cercana de las diferencias estructurales entre los polimorfos 1a/1b y los nuevos polimorfos 2a/2b reveló más diferencias en la disposición de los motivos del arco, que cambian la interfaz de los protofilamentos entre los polimorfos 1 y 2 [41].

Estos estudios refuerzan la hipótesis de que la misma proteína precursora -Syn puede ensamblarse en múltiples polimorfos de fibrillas in vitro, que difieren radicalmente entre sí en términos de resolución atómica. Goedert y sus colegas estudiaron recientemente estructuras crio-EM de fibrillas tau derivadas de la enfermedad de Alzheimer y de Pick. cerebros de los pacientes [40,218,219].

Encontraron distintos pliegues de filamentos de tau en ambas enfermedades, lo que indica que existen diferentes conformadores de tau en diferentes tauopatías. El mismo grupo informó sobre dos tipos de filamentos -Syn, tipo I y tipo II, en el cerebro de personas que padecían MSA [280]. Descubrieron que cada filamento está formado por dos protofilamentos no idénticos.

La cavidad formada por el empaquetamiento estrecho de los protofilamentos encierra moléculas adicionales que aún están por determinarse [280]. El promedio de clase 2D también reveló diferentes fibrillas de pacientes con MSA y DLB, lo que sugiere la existencia de distintos conformadores asociados con la sinucleinopatía.

Además, sería interesante preguntar si las fibrillas derivadas del paciente presentan algún nivel de similitud con las fibrillas generadas in vitro. La caracterización a nivel molecular y la comparación de muestras de fibrillas derivadas del cerebro con fibrillas generadas in vitro revelaron que estas dos son estructuralmente diferentes [276,280]. La principal diferencia entre los filamentos derivados de MSA y los sintéticos es el tamaño y el empaquetamiento de los protofilamentos en las fibrillas de MSA [280].

Además, los investigadores utilizan condiciones duras para generar y aislar fibrillas sintéticas como agitación, concentración de sal, etc., que afectan el empaquetamiento y la disposición de las láminas de los filamentos [10,283–285]. Como resultado, resulta difícil correlacionar los resultados in vitro con escenarios in vivo.

Por otro lado, es posible que sólo se obtengan fibrillas preformadas de muestras extraídas de enfermedades, pero es posible que no se entienda cómo se originaron y qué factores han gobernado la formación de diferentes fibrillas en diferentes muestras de cerebro. Es un desafío aislar las especies tóxicas transitorias o los intermediarios de las muestras de cerebro para comprender la patogénesis de la enfermedad.

En consecuencia, debemos confiar en muestras in vitro para delinear los mecanismos de fibrilformación, las vías y el análisis cinético. De manera similar, tenemos que probar lo mismo utilizando fibrillas derivadas del cerebro para desarrollar una base de conocimientos más extensa. En general, las estructuras de alta resolución de los polimorfos -Syn podrían ayudar a los investigadores en su búsqueda de posibles objetivos terapéuticos.

Sin embargo, se requiere una investigación exhaustiva para comprender el impacto de las condiciones celulares, mutaciones, PTM, presencia de cofactores, etc., en la estructura de las fibrillas -Syn y el vínculo de diferentes polimorfos de fibrillas con la variabilidad clínica observada en la EP.

6. Mutaciones familiares de conformaciones de fibrillas distintas en forma -Syn

-La oligomerización y agregación de sintetizadores están asociadas con la patogénesis de la EP. Hasta ahora se han descubierto siete mutaciones familiares sin sentido en el gen SNCA, asociadas con la EP de aparición temprana y tardía [83-90].

Entre estas mutaciones asociadas a la EP, los mutantes E46K, H50Q, A53T y A53V recientemente descubiertos aceleran la tasa de agregación -Syn, mientras que las mutaciones A30P, G51D y A53E ralentizan la cinética de agregación in vitro [91,93,96]. Sin embargo, el vínculo entre la tasa de agregación (in vitro) y la edad de aparición de la enfermedad (in vivo) no es sencillo [103].

Aunque los oligómeros formados durante las primeras etapas de la cinética de agregación son potencialmente tóxicos [286], sólo A30P muestra una oligomerización más rápida y una conversión retardada de oligómeros en fibrillas [102]. G51D, por otro lado, presenta una oligomerización y una formación de fibrillas lentas [287,288], aunque se asocia con la aparición temprana de la enfermedad.

Debido a esta complejidad en el comportamiento de los mutantes familiares, es un desafío establecer un mecanismo unificador por el cual causen la enfermedad. Informes anteriores han sugerido que -Syn adopta una estructura helicoidal al unirse con membranas in vivo [289,290].

Cualquier cambio de un solo aminoácido en el dominio N-terminal de -Syn puede alterar la capacidad de unión a la membrana y aumentar la concentración citosólica de la proteína al promover una agregación más rápida [291,292]. Los datos de unión a membrana de mutantes -Syn familiares de nuestro laboratorio [92] y otros [110,288,292,293] han demostrado que los mutantes H50Q, A53T y E46K exhiben una mayor unión a la membrana, mientras que los mutantes A53E, G51D y A30P exhiben una unión a la membrana disminuida.

Esto sugiere que, de manera similar a la agregación, la capacidad de unión a la membrana no se correlaciona con una mayor propensión a enfermedades por mutaciones familiares -Syn. Por lo tanto, existe una falta de correlación entre la capacidad de agregación y unión a la membrana con la patogénesis real de la enfermedad causada por los mutantes familiares de -Syn.

Esto plantea la cuestión de cómo una mutación puntual en una proteína no estructurada de forma nativa muestra diferencias drásticas en el inicio y la progresión de la enfermedad. Creemos que podría ser posible que diferentes mutantes -Syn produzcan diferentes tipos y cantidades de oligómeros y también puedan alterar de manera única la capacidad de siembra de la proteína de tipo salvaje [103].

Es por eso que los mutantes afectan no sólo la tasa de agregación general de la proteína sino también los pasos microscópicos involucrados en la formación de amiloide, es decir, la iniciación y amplificación de -Syn a través del proceso de nucleación secundaria [294]. Curiosamente, Lazaro et al. descubrieron que, a pesar de tener una propensión a la oligomerización idéntica en células cultivadas, A30P, E46K, H50Q, G51D y A53T exhiben distintas capacidades para formar inclusiones [295]. A30P mostró una menor propensión a formar inclusiones en las células, mientras que los mutantes E46K y G51D mostraron un efecto opuesto [295].

Nuevamente, la formación de inclusiones en las células [295] no se correlacionó con la propensión a la agregación de mutantes in vitro [12,91–93,102]. Por lo tanto, abordar estas preguntas sobre cómo el -Syn de tipo salvaje y sus mutantes contribuyen a la aparición temprana y tardía de la EP se vuelve importante para comprender la patogénesis diferencial de las sinucleinopatías.

La formación de fibrillas es muy sensible a cambios en el microambiente local y/o global de la proteína. Esto sugiere que un solo cambio de aminoácido puede resultar en polimorfismo debido a diferentes dinámicas conformacionales específicas del sitio, como se muestra para el tipo salvaje y las fibrillas de E46K, A30P y A53T [296]. En este contexto, Knowles y sus compañeros de trabajo estudiaron recientemente la comparación sistemática de -Syn y sus mutantes asociados a enfermedades utilizando técnicas biofísicas [297]. Los mutantes de PD generan polimorfos de fibrillas con morfología y estructuras secundarias distintas en comparación con la proteína de tipo salvaje [297].

De hecho, varios informes han confirmado de forma independiente que diferentes mutantes -Syn forman fibrillas con una morfología característica revelada por estudios de microscopía electrónica de transmisión (TEM) y microscopía de fuerza atómica (AFM), patrones únicos de difracción de rayos X (DRX) y diferencias en los elementos de la estructura secundaria (Figura 4A, B).

Además, la interfaz de los dos protofilamentos en la estructura de las fibrillas -Syn está formada por los residuos 50 a 57, que también albergan tres mutaciones familiares [61]. Esto sugiere que incluso una mutación puntual puede alterar la dinámica y el empaquetamiento de los protofilamentos.

Una inspección más cercana de las fibrillas formadas por mutantes mediante crio-EM [298–300] reveló la plasticidad de dichas fibrillas en términos de giros, número de protofilamentos que interactúan, disposición del empaque, elementos de la estructura secundaria y forma cuaternaria, etc. (Figura 4C, D).Boyer y su grupo estudiaron mutantes H50Q y encontraron fibrillas estrechas (1c) y anchas (1d) con uno o dos protofilamentos, respectivamente [300].

A pesar de compartir la misma estructura del núcleo conservada que se informó anteriormente para el -Syn de tipo salvaje, las fibrillas mutantes mostraron una nueva disposición de protofilamentos y redes de enlaces de hidrógeno [300]. Además, A53 se encuentra en el centro de la interfaz de los protofilamentos que interactúan en -Syn de tipo salvaje [61] y también es un punto caliente para muchas mutaciones puntuales [16,89,90].

Los estudios crio-EM con el mutante A53T acetilado en el extremo N-terminal no revelaron cambios en el pliegue del -Syn de tipo salvaje [299]. Sin embargo, la mutación interrumpe las interacciones de los residuos y reorganiza la orientación de la interfaz del protofilamento, lo que resulta en una diferente tipo de fibrillas [299]. Este también podría ser el caso con las otras dos mutaciones A53, es decir, A53E y A53V, pero esta posibilidad aún no se ha descubierto.

El modelado crio-EM de fibrillas formadas por la mutación E46K también ha respaldado la hipótesis predominante. Reveló la formación de polimorfos de fibrillas con empaquetamiento e interfaces de protofilamentos distintos en comparación con el -Syn de tipo salvaje [298,301]. Además, formó una variante más estable y patógena del -Syn de tipo salvaje [298]. En general, estos estudios sugieren que el empaquetamiento de protofilamentos y la interfaz son críticos para determinar la estructura de las fibrillas.

Cada mutación familiar puede comportarse como una cepa de -Syn, alterando de manera única la estructura y dinámica de las fibrillas resultantes. Estas diferencias en la estructura de las fibrillas pueden conducir a diferentes resultados clínicos y patológicos, contribuyendo así a la heterogeneidad de la enfermedad en las sinucleinopatías.

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