Caracterización estructural y evaluación de las actividades antiinflamatorias y antitirosinasa de los polifenoles de Melastoma Normale Parte 1

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Resumen:Polyphenols, widely distributed in the genus Melastoma plants, possess extensive cellular protective effects such as anti-inflammatory, anti-tyrosinase, and anti-obesity, which makes it a potential anti-inflammatory drug or enzyme inhibitor. Therefore, the aim of this study is to screen for the anti-inflammatory and enzyme inhibitory activities of compounds from the title plant. Using silica gel, MCI, ODS C18, and Sephadex LH-20 column chromatography, as well as semipreparative HPLC, the extract of Melastoma normale roots was separated. Four new ellagitannins, Whiskey tannin C(1), 1-O-(4-methoxygalloyl)-6-O-galloyl-2,3-O-(S)-hexahydroxydiphenoyl-β-D-glucose (2), 1-O-galloyl-6-O-(3-methoxygalloyl)-2,3-O-(S)-hexahydroxydiphenoyl-β-D-glucose (3), and 1-O-galloyl-6-O-vanilloyl-2,3-O-(S)-hexahydroxydiphenoyl-β-D-glucose (4), along with eight known polyphenols were firstly obtained from this plant. The structures of all isolates were elucidated by HRMS, NMR, and CD analyses. Using lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW264.7 cells, we investigated the anti-inflammatory activities of compounds 1-4, unfortunately, none of them exhibit inhibit nitric oxide (NO) production, their IC50 values are all>50 uM. Los ensayos de actividad anti-tirosinasa se realizaron mediante el modelo de cribado de actividad de inhibición de tirosinasa. El compuesto 1 mostró una débil actividad inhibidora de la tirosinasa con valores de CI50 de 426,02 ± 11,31 µM. Los compuestos 2-4 mostraron actividades inhibidoras de tirosinasa moderadas con valores IC50 en el rango de 124,74±3,12-241,41±6,23 μM. Las relaciones estructura-actividad indican que la hidroxilación en C-3', C-4' y C-3 en las flavonas fue clave para sus actividades anti-tirosinasa. El aislamiento exitoso y la identificación de la estructura de la elagitanina proporcionan materiales para la detección de fármacos antiinflamatorios e inhibidores de enzimas y también contribuyen al desarrollo y la utilización de M. normale.

Palabras clave:melastoma normal;Melastoma; polifenoles; tirosinasa; antiinflamatorio;elagitaninos

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1. Introducción

La inflamación, como proceso clínico-patológico común, está estrechamente relacionada con muchas enfermedades como la artritis, la psicosis, las enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares y el cáncer[1]. La tirosinasa es la enzima clave de la síntesis de melanina, y su sobreexpresión puede provocar enfermedades de pigmentación como pecas, cloasma y melanoma [2]. En la actualidad, se ha demostrado que los fármacos antiinflamatorios como los glucocorticoides, la insulina y los inhibidores de la tirosinasa como el ácido kójico tienen efectos secundarios significativos [3,4]. Por lo tanto, es de gran importancia conocer los efectos secundarios efectivos y menores de los medicamentos antiinflamatorios y los inhibidores de la tirosinasa. Los polifenoles, el componente característico de las plantas de Melastoma, tienen amplios efectos citoprotectores, como antioxidantes, antiinflamatorios, antitirosinasa [5] y antiobesidad [6,7], lo que lo convierte en un potencial fármaco antiinflamatorio. o inhibidor enzimático. Melastoma normale D. Don, un arbusto de la familia Melastomaceae, está muy extendido en Nepal, India, Myanmar, Malasia, Filipinas y China [8]. Las raíces de M.normale, "Yang KaiKou" en chino, contienen abundantes polifenoles, que se han demostrado como constituyentes bioactivos correspondientes al efecto antiinflamatorio de esta planta [9-11]. Con el objetivo de detectar las actividades inhibidoras de enzimas y antiinflamatorias de los compuestos de la planta del título, se extrajeron las raíces de M.normale con acetona acuosa al 80 por ciento y posteriormente se separaron mediante varios métodos cromatográficos para generar doce polifenoles. Las estructuras de los aislamientos se caracterizaron mediante análisis de datos espectroscópicos exhaustivos. Además, se investigaron las actividades antiinflamatorias de nuevos compuestos 1-4 para desarrollar polifenoles como un nuevo fármaco antiinflamatorio. Además, se evaluaron las actividades antitirosinasa de los compuestos 1-12 y se estudiaron las relaciones estructura-actividad de los compuestos 7-12. En este estudio, se aislaron cinco elagitaninos de M. normale. Como todos sabemos, elagitanino es ésteres de ácido hexahidroxidifenoico y monosacárido. La separación de estos compuestos suele ser difícil debido a su alta polaridad, facilidad para ser adsorbidos por los materiales de separación e inestables a la luz y al calor. Además, debido a su gran peso molecular, muchas unidades estructurales idénticas en la estructura, así como la seria superposición de RMN, la determinación de su estructura siempre ha sido un problema difícil. Por lo tanto, la separación e identificación estructural de estos compuestos sigue siendo un problema difícil en el campo de la química de productos naturales. El aislamiento exitoso y la identificación estructural de los elagitaninos proporcionan materiales para este experimento y también contribuyen al desarrollo y utilización de la planta.

2. Resultados y Discusión

La fracción de EtOAc del extracto acuoso de acetona al 80 por ciento de las raíces de M. normale se purificó usando varios métodos cromatográficos para dar cuatro compuestos nuevos 1-4 y ocho compuestos conocidos 5-12. Las estructuras de 1-12 se muestran en el Esquema 1. Los compuestos conocidos 5-12 se identificaron como mongolicaína A(5) [12], 1-hidroxi-3,4,{{ 11}}trimetoxi fenil-1-O-[6'-O-(4"-carboxi-1",3",5"-trihidroxi)fenil-6-D-glucopiranósido (6) [13]kaempferol (7)[14], kaempferol-3-ramnósido (8)[15], ácido gentísico-5-O- -D-(6'-O-galoil)-glucopiranosa (9)[16], quercetina (10)[17], quercetina-3-O- -L-ramnósido (11)[18] y miricetina-3-O- - L-ramnopiranósido (12)[19], respectivamente. Todos los compuestos se aislaron primero de esta planta. Además, los elagitaninos se obtienen en primer lugar de las raíces de M.normale[10,11,20].

2.1.Elucidación de la estructura1

El compuesto 1 se obtuvo como un polvo amorfo amarillo y mostró la coloración positiva característica de los elagitaninos con el reactivo NaNO2-AcOH. La fórmula molecular C5H34O7 se estableció mediante el espectro HRESIMS con un pico de iones negativos en m/z[MH]-1005.1240 (calcd 1005.1215). Los datos de 1H-NMR (Tabla 1) revelaron al menos dos grupos hexahidroxidifenoilo (HHDP) (δ6.60, 6.70 y 6.83), seis grupos metino, tres grupos metileno portadores de oxígeno y dos grupos metilo. Los datos de RMN de 13C (Tabla 1) revelaron seis grupos éster carbonilo en δ170,5, 170,1, 168,9, 168,8, 167,6 y 163,3. La presencia de dos etoxilatos fue indicada por las correlaciones LH-1H COSY (Figura 1). Los datos de RMN (Tabla 1) y las correlaciones 'H-'H COSY (Figura 1) revelaron una unidad de polialcohol, que era similar a la unidad de glucosa de cadena abierta de vescalagina [21]. Los cambios químicos de carbono de campo relativamente bajo de las correlaciones de glucosa C-2-C-6 y HMBC (Figura 1) indicaron que los grupos hidroxilo en la glucosa C-2-C-6 eran acilado. Uno de los dos grupos HHDP unidos a la glucosa C-4 y C-6 fue confirmado por una gran diferencia en los cambios químicos entre H-6a（δ4.95）y H{ {52}}b（δ3.95）【22】, y correlaciones HMBC de la glucosa H-4 y H-6 con los carbonilos de carbono CHpp-,( 168.9) y CHpp-zw({{ 62}}.1), respectivamente. Se podría construir un anillo de ciclopentenona que posea un grupo metoxicarbonilo mediante el análisis de las señales de carbono debidas a un carbonilo (6 202.9 (Cp-3)), un éster carbonilo (170.5(Cp-7 ), dos olefínicos(6 143.8(Cp-4) y 158.2 (Cp-5)), un metino （δ46.3（Cp-1））, y un carbono cuaternario portador de oxígeno （6 84.9, Cp-2）.

Esto fue respaldado por las correlaciones HMBC de protones de metileno ({{0}}.25) con Cp-7 y HCp-1（δ5.46）con Cp-2, Cp-3, Cp-4, Cp-5 y Cp{{10}}. Además, la conexión de Cp-4 con la glucosa C-1 se demostró mediante las correlaciones HMBC de la glucosa H-1 con Cp-3, Cp{{15} } y Cp-5. El cambio químico de carbono de carbonilo de éster de campo relativamente alto en δ163.3 (Cp{{20}}) sugirió que este carbonilo estaba unido a un doble enlace y formaba un anillo de δ-lactona con la glucosa C{{ 22}} grupo hidroxilo. Esto fue confirmado por la correlación HMBC del éster carbonilo de carbono (6 163.3) con glucosa H-2. Las correlaciones de Hcp-1 con CHHpp.2（δ 125.0）, CHHpp-3（6 111.2） y CHHpP-4（0 146.4） en el espectro HMBC (Figura 1) indicó que Cp-1 estaba conjugado con CHHDP-3. Además, los grupos hidroxilo de glucosa C-3 y C-5 formaron otros dos anillos de lactona con dos grupos carbonilo unidos al resto hexahidroxibifenilo. Esto fue demostrado por las correlaciones de HMBC de glucosa H-3 con éster carbonilo de carbono (CHDP-7 δ 167.6) y la glucosa H-5 y el protón aromático HHpp-3 con éster carbonilo de carbono（CHHpp-7,δ168.9）. Las correlaciones clave de HMBC de los protones de metileno (63.60 y 3.52) con la glucosa C-1 (8 68.0) y la glucosa H-1（δ 4.34）con el carbono de metileno （δ 66.0） indicó que el resto etoxi estaba ubicado en la glucosa C-1. Por lo tanto, se estableció la estructura 2D de 1. Esto fue respaldado por la comparación de los datos espectroscópicos de 1 con los del whisky tanino B [23]. La pequeña constante de acoplamiento entre la glucosa H-1 y H-2(<2.0 hz)revealed="" that="" the="" configuration="" at="" glucose="" c-1="" of="" 1="" was="" the="" same="" as="" that="" of="" vescalagin="" (j="2.0" hz)[21],="" and="" different="" from="" that="" of="" whiskey="" tannin="" b(j="6.4" hz)[23].="" assuming="" that="" 1="" was="" derived="" from="" vescalagin,="" construction="" of="" a="" dreiding="" model="" of="" 1="" indicated="" that="" the="" benzyl="" methine="" proton="" (cp-1)of="" the="" cyclopentenone="" ring="" must="" be="" β-configuration,="" because="" its="" fused="" ring="" system,="" including="" two="" aromatic="" rings,="" a="" cyclopentene,="" and="" 6-and="" 10-membered="" lactone="" rings,="" was="" so="" rigid="" that="" an="" alternative="" model="" could="" not="" be="" constructed.="" the="" absence="" of="" roe="" correlations="" between="" the="" cp-1="" proton="" and="" the="" methoxyl="" group="" suggested="" an="" o-orientation="" of="" the="" methoxycarbonyl="" group.="" the="" cd="" spectrum="" of="" 1(figure="" s26)showed="" a="" positive="" cotton="" effect="" at="" 240="" nm="" and="" a="" negative="" one="" at="" 263="" nm="" indicating="" that="" the="" atropisomerism="" of="" the="" hhdpgroup="" had="" the="" s-configuration="" [24].="" based="" on="" these="" results,="" the="" structure="" of="" compound="" 1,="" named="" whiskey="" tannin="" c,="" was="" established="" as="" depicted="" in="" scheme="">

El compuesto 2 se aisló como un polvo amorfo marrón. La fórmula molecular C3sH28O2 se determinó basándose en el pico [MH] am/z799,0983 (calcd 799,0999) en su espectro HRESIMS. Los datos de RMN de 'H (Tabla 2) revelaron dos grupos galoilo (6H 7,12 (2H, s) y 7,11 (2H, s)), un grupo HHDP (6H 6,72 (1H, s) y 6,43 (1H, s)), y un grupo metoxilo (δH 3.87 (3H, s)). Los cambios químicos de campo relativamente bajo y los patrones de acoplamiento relativamente grandes de los protones de azúcar indicaron que los núcleos de glucosa en 2 adoptan la conformación 4C, y los grupos acilo deben ubicarse en O-1, O-2, O-3 y O-6. La ubicación del grupo HHDP en glucosa O-2/O-3 fue respaldada por la evidencia de las correlaciones HMBC, las correlaciones H-'H COSY (Figura 2), así como el cambio químico （δ 92.6） de las señales de carbono anomérico 【25】. La configuración (S) del grupo HHDP fue confirmada por el CDspectrum, que exhibió un efecto de algodón positivo a 238 nm y un efecto de algodón negativo a 264 nm [24]. La constante de acoplamiento del protón anomérico en 2 fue de 8,5 Hz, lo que indica que el resto de azúcar tenía una configuración. Comparación de sus datos de RMN (Tabla 2) con los de 1,6-di-O-galoil-2,3-O-(S)-hexahidroxidifenoil- -D-glucosa [20]reveló que el grupo hidroxi en galoil-C-4 en el último fue reemplazado por un grupo metoxilo en el primero. La fórmula molecular, los desplazamientos químicos de galoil-C-3(6c 151,5), galoil-C-4(c 141,3), galoil-C-5(c 151,5) y -OCH3 (c 60.8), y las correlaciones de un protón aromático (6H7.12) y un protón metoxilo (6H 3.87) con guante-C-4(6c 141.3) en el espectro HMBC apoyaron estos cambios en 2. Hidrólisis ácida y la metilación y sililación posteriores de 2 establecieron que el azúcar en la molécula era D-glucosa. Por lo tanto, la estructura de 2 se estableció como 1-O-(4-metoxigaloílo)-6-O-galoílo-2,3-O-(S)-hexahidroxidifenoílo{ {103}}D-glucosa.

Figura 1. Correlaciones clave HMBC(flechas) y 'H-1HCOSY(enlaces) de 1.

Este artículo está extraído de Molecules 2021, 26, 3913. https://doi.org/10.3390/molecules26133913https://www.mdpi.com/journal/molecules