Caracterización estructural del polisacárido de cistanche deserticola y su efecto protector sobre la lesión de células HK {{1 1}}} inducida por glucosa

1.2.5.8 Detección del potencial de membrana mitocondrial

Las células HK -2 se inocularon en 6- placas de pozo y cultivadas. Después de la estimulación correspondiente, el medio de cultivo en las placas de pozo 6- se aspiró y se agregó un fuerte grupo de control positivo (POS) al grupo bajo "1.2.5.6". Enjuague una vez con PBS, agregue 1 ml de medio de cultivo celular y 1 ml JC -1 Solución de trabajo se mezcló a fondo y se colocó en una incubadora de cultivo celular en la oscuridad durante 20 minutos. Las células se lavaron dos veces con el tampón de tinción JC -1 (1 ×) y las imágenes se recogieron usando un microscopio de fluorescencia.

 

 

 

 

Beneficios de Cistanche

 

1.2.5.9 Hoechst33258 Método para detectar la apoptosis celular

Los portaobjetos celulares se colocaron en placas de pozos 6-, y las células HK -2 en la fase de crecimiento logarítmico se sembraron en las placas 6-} a una densidad celular de 1 × 105 celdas/pozo. Después de la intervención de drogas correspondiente, el kit de tinción HOECHST33258 se usó para la tinción. Se detectó la apoptosis celular y las imágenes se recogieron utilizando un microscopio de fluorescencia.

 

1.2.5.10 transferencia Western para detectar

La expresión de proteínas relacionadas con la vía de señalización TLR4/NF-κB se analizó agrupando y tratando las células de acuerdo con el método bajo "1.2.5.6". Después de eso, la proteína total en las células se extrajo de acuerdo con las instrucciones del kit de extracción de proteínas. La cuantificación de la proteína se realizó utilizando el método de cuantificación de proteínas de ácido bicinconínico (BCA), y la proteína se desnaturalizó y almacenó en un refrigerador de grado -20}.
El electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio al 10% (SDS-PAGE), transferencia de membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF), coloque la membrana en tampón Tween que contiene tris -20
Las células se incubaron en una solución salina tamponada Tris con la cámara Tween -20 (TBST) y se bloquearon a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios a TLR4, NF-κB p65, P-NF-κB p65 y -actina se usaron paradetectar el tejido renal(Los anticuerpos se diluyeron a la solución TBST a una relación de volumen de 1: 2000) a 4 grados durante la noche. TBST
La membrana se diluyó con anticuerpo secundario (la solución de anticuerpos y TBST se diluyó a una relación de volumen de 1: 2000) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Después de lavar la membrana 3 veces con TBST, se añadió reactivo luminiscente de ECL para la detección, y la expresión de proteínas se detectó mediante imágenes en gel. El software Image J se usó para analizar el valor de escala de grises proteínas, con -actina como referencia interna.

1.3 Procesamiento de datos

SPSS 23. Se utilizaron el software 0 y GraphPad Prism 6.01 para el análisis de datos. La prueba de Shapiro-Wilk se usó para probar la normalidad de los datos de la muestra, y la prueba de Brown-Forsythe o Bartlett se usó para probar la homogeneidad de la varianza de los datos de la muestra. Los datos de medición con distribución normal y homogeneidad de varianza se expresaron como media ± desviación estándar. (x ± S) indica una descripción, se usó ANOVA unidireccional para las pruebas, y el método de Dunnett se usó para la comparación por pares si estadísticamente significativo.
Para las comparaciones por pares post hoc de variaciones desiguales, se usó el método T3 de Dunnett, con p <0. 0 5 que indica una diferencia estadísticamente significativa, y p <0.01 que indica una diferencia significativa entre los dos grupos.

2 resultados y análisis

2.1 Determinación del azúcar total, ácido urónico y contenido de proteínas de CDPS

La ecuación de regresión lineal del contenido de polisacárido fue: y=5. 7628x - 0. 0004, r=0. 999. El experimento mostró que entre 7 y 70 µg/ml, hubo una buena relación lineal entre la concentración de glucosa estándar (X) y el valor de absorbancia (y). El porcentaje calculado del contenido de polisacárido en la muestra es: 81.02%.
La ecuación de regresión lineal del ácido urónico estándar es: y=1. 1571x + 0. 0015, R=0. 9968. El experimento mostró que entre 20 y 100 µg/ml, hubo una buena relación lineal entre la concentración estándar de ácido urónico (X) y el valor de absorbancia (y). El contenido de ácido urónico en la muestra es: 4.43%.
La ecuación de regresión lineal de proteína estándar es: y=1. 2671x + 0. 2145, R=0. 9969. El experimento mostró que entre 20 y 1 00 µg/ml, había una buena relación lineal entre la concentración de proteína estándar (x) y el valor de absorbancia (y). El contenido de proteína en la muestra es: 4.00%.

 

2.2 Distribución de peso molecular de CDP

El peso molecular de los CDP se determinó mediante detección de columna en tándem de cromatografía en gel de gel de alto rendimiento. Con rt as (x) y lgmp as (y), la ecuación de la curva de calibración LGMP-RT se calculó como: y=-0. 1951x + 11. 661, r²=0. 9956; Rt es (x), lgmw es (y), la ecuación de la curva de calibración LGMW-RT es: y=-0. 1973x + 11. 738, r²=0. 9956; Rt es (x), lgmn es (y), la curva de calibración LGMN-RT La ecuación es: y=-0. 1964x + 11. 7, r²=0. 9955; Según la curva estándar, la fórmula de cálculo se obtiene para calcular el peso molecular de cada muestra. El espectro de peso molecular de la muestra es el siguiente, y los resultados del cálculo se muestran en la Tabla 2. Los resultados mostraron que los CDP tenían múltiples picos de elución, y el peso molecular de los polisacáridos se distribuyó principalmente entre 3 y 8 kDa, que era un heteropolisacárido de peso molecular pequeño heterogéneo pequeño. Como se muestra en la Figura 1.

 

 

2.3 CDPS composición de monosacárido

Los CDP se analizaron por cromatografía iónica, y el cromatograma se muestra en la Figura 2. Los resultados mostraron que en comparación con el tiempo de retención de 16 estándares de monosacárido, se detectaron 5 monosacáridos en CDP. Al comparar los espectros con los de los estándares de monosacárido, los CDP estaban compuestos principalmente de glucosa, galactosa, ramnosa, manosa y sacarosa. , Arabinosa. La relación molar es 0. 734 0 5: 0. 0 5381: 0. 0502: 0.0255: 0.0178. A partir de la relación molar, se puede ver que los CDP están compuestos principalmente de glucosa, galactosa y ramnosa. Entre ellos, la glucosa representa el 73.405%, la galactosa representa el 5.381%y la ramnose representa el 5.02%.

 

Nota: Man.Mannose, GLC N.Glucosamine Hyidrocloruro, Rha.rhamnose, Glc-UA.Glucuronic Acid, Gal-UA.Galacturonic ácido, clorhidrato de Gal n.galactosamina, gl.glucosa, galacosa, xyl.xylosa, ARA. Arabinosa, Fuc. Fucosa.

2.4 CDPS Fourier Infrared Analysis

El pico cerca de 3246 cm -1 es causado por la vibración de estiramiento OH del grupo hidroxilo, el pico de absorción cerca de 2900 cm -1 es el pico de vibración de estiramiento de CH de -Ch3, y el pico de absorción a 1594 cm -1 es el pico de estiramiento de C {}}}}} O de la vibración, indica que la presencia de estiramiento de C {}}} O del estiramiento de vibración, indica que la presencia de estiramiento de C {10} ácido urónico, 1374.31 cm -1: este pico de absorción puede estar relacionado con la vibración de deformación de los enlaces CH, especialmente en los grupos de metilo (-ch3) o metileno (h 2-) de polisacáridos. El pico de absorción a 1018.38 cm -1 puede estar relacionado con la vibración de estiramiento del enlace CO, que se encuentra comúnmente en los enlaces de éter o enlaces éster de polisacáridos. Tres picos de absorción débiles en el rango de 1200-1000 cm -1 indican la presencia de piranosa en CDP. La absorción máxima a 870 y 930 cm -1 indica que los enlaces glucosídicos de tipo de tipo pueden existir en CDP. Ver Figura 3.

 

2.5 Efectos tóxicos de CDP en células HK -2 normales

En comparación con CON, a las 24 h después de la administración, la viabilidad celular comenzó a disminuir significativamente después de que la concentración de CDPS alcanzó 1000 ug/ml (P (P<0.05); at 48 h after administration, the cell viability decreased when the CDPs concentration reached 800 μg/mL and did not exceed 80 %; after 1000 µg/mL, the cell viability began to decline significantly (P<0.05); this may be related to the imbalance of cell osmotic pressure and cell membrane damage caused by the high concentration of polysaccharides. There was no significant difference in cell viability when compared with the concentrations of 25, 50, 100, 200, and 400 µg/mL, so the concentrations of CDPs of 100, 200, and 400 µg/mL when cell viability did not decrease significantly were selected as the drug intervention concentrations. See Table 3.

 

3 Discusión y conclusión

Polisacáridosson polímeros de alto peso molecular compuestos de más de 10 monosacáridos. Se ha informado que los polisacáridos tienenefectos inmunomoduladores, antioxidantes, antiinflamatorios e hipoglucémicos[15]. Como una de las principales sustancias farmacológicamente activas en la desértica de Cistanche, los CDP tienen un valor medicinal significativo. Este estudio caracterizó preliminarmente la estructura de los CDP y descubrió que pueden mejorar el daño de las células HK -2 inducidas por un entorno de alto azúcar.

 

La estructura compleja de los polisacáridos está estrechamente relacionada con su actividad biológica, entre las cuales el tipo y la proporción de monosacáridos, la masa molecular relativa de polisacáridos y el tipo de enlaces glucosídicos son factores de influencia clave [16]. La masa molecular relativa moderada proporciona a los polisacáridos más sitios activos y puede exhibir una actividad biológica más fuerte.
Sin embargo, el peso molecular grande aumentará la resistencia transmembrana, obstaculizará la absorción de polisacárido y afectará la actividad. Por el contrario, los polisacáridos de peso molecular pequeño pueden no ser capaces de formar estructuras activas efectivas, lo que resulta en una actividad reducida [17]. Al explorar la actividad biológica de los polisacáridos, es necesario considerar exhaustivamente la composición de monosacárido, la masa molecular relativa y el tipo de enlace glucosídico [18]. En este estudio, la cromatografía iónica determinó que los CDP estaban compuestos principalmente de glucosa, galactosa y ramnosa, lo que es consistente con el informe de Xu et al. [19]. Los pesos moleculares promedio de peso de los CDP medidos por la cromatografía de gel líquido de alto rendimiento fueron 3444, 4198 y 8031 ​​kDa, respectivamente. Los pesos moleculares de tres polisacáridos de Cistanche de cuatro materiales medicinales de tipo Cistanche medidos por Yang et al. [20] fueron similares. Los CDP pueden contener enlaces glucosídicos de tipo de tipo, y pueden contener -glucosa o -manosa. Los polisacáridos compuestos de -glucosa o -manosa son más fácilmente reconocidos por el receptor 4 (TLR4) o TLR2 [21].
DN es una de las complicaciones microvasculares más graves de la diabetes, y su patogénesis está estrechamente relacionada con el estrés oxidativo, la disfunción mitocondrial y la apoptosis celular [22]. Este estudio investigó el efecto protector de los CDP en las células HK -2 inducidas por glucosa altas mediante la regulación de la vía de señalización TLR4/NF-κB y su mecanismo molecular.

En condiciones de alta glucosa, las células HK -2 exhiben un estrés oxidativo significativo [23]. Los estudios han encontrado que los altos niveles de azúcar aumentan significativamente la producción de ROS intracelulares. Esta cantidad excesiva de ROS puede dañar directamente los lípidos de la membrana celular, lo que lleva a un aumento en el contenido del producto de peroxidación lipídica MDA [24]. Al mismo tiempo, las actividades de SOD y GSH-PX, importantes sistemas de defensa antioxidante, se redujeron significativamente, lo que indica que la capacidad antioxidante de las células se dañó severamente [25]. Este desequilibrio en el sistema de antioxidación de oxidación promueve aún más la expresión y activación de TLR4 [26]. Estudios anteriores han demostrado que ROS excesivos puede ser reconocido por TLR4 como patrones moleculares asociados al peligro (DAMPS), formando un circuito de retroalimentación positiva [27]. En este estudio, el pretratamiento de CDPS redujo significativamente los niveles de ROS, aumentó las actividades de SOD y GSH-PX, y disminuyó el contenido de MDA. Este efecto antioxidante integral sugiere que los CDP pueden regular las respuestas del estrés oxidativo a través de múltiples objetivos.
En la vía de señalización TLR4/NF-κB, el TLR4 activado promueve la activación del complejo IKK reclutando proteínas adaptador aguas abajo, lo que a su vez conduce a la fosforilación y degradación de IκB [28]. El presente estudio observó que la alta glucosa aumentó significativamente el nivel de fosforilación de IκB, lo que condujo a la translocación de NF-κB p65 del citoplasma al núcleo. Los estudios han demostrado que la translocación nuclear de P65 no solo agrava el estrés oxidativo sino que también afecta la función mitocondrial [29].
Se observó mediante la tinción de JC -1 que el tratamiento con alto contenido de glucosa causó una disminución significativa en el potencial de la membrana mitocondrial, mostrando un cambio de fluorescencia roja a fluorescencia verde, lo que indica que el gradiente de protones entre las membranas internas y externas de las mitocondrias se interrumpió. La disfunción mitocondrial exacerba aún más la producción de ROS, formando un círculo vicioso [30]. El pretratamiento de CDPS puede mantener la estabilidad del potencial de la membrana mitocondrial, y este efecto protector puede lograrse inhibiendo la expresión de TLR4 y la activación de NF-κB.
La disfunción mitocondrial y el estrés oxidativo persistente conducen en última instancia a la apoptosis celular [31]. La tinción de Hoechst reveló que los núcleos celulares en el grupo de tratamiento con alto contenido de glucosa mostraron cambios morfológicos apoptóticos típicos obvios como condensación, condensación y fragmentación [32]. Estos cambios están estrechamente relacionados con la vía de la apoptosis intrínseca mediada por mitocondrial: la pérdida de potencial de membrana mitocondrial conduce a la liberación de citocromo C, activación de la cascada de caspasa y, en última instancia, la apoptosis celular [33]. La morfología nuclear de las células en el grupo de pretratamiento de CDPS era básicamente normal y la tinción era uniforme, lo que sugiere que los CDP evitaban la apoptosis celular al mantener la función mitocondrial e inhibir el estrés oxidativo.
En resumen, este estudio detectó sistemáticamente indicadores de estrés oxidativo (ROS, MDA, SOD, GSH-PX), la función mitocondrial (JC -1) y la apoptosis celular (Hoechst), combinada con TLR4/NF-κB de la vía de señalización moléculas clave que elucidan el mecanismo de la acción: CDPS: CDPS: CDPS: CDPS: CDPS: CDPS: CDPS: CDP
Primero, mejorando la capacidad antioxidante de las células, reduciendo el nivel de ROS y reduciendo la activación de TLR4; En segundo lugar, al inhibir la expresión de TLR4 y la fosforilación de IκB, bloqueando la translocación nuclear de NF-κB; Finalmente, mejorando la función mitocondrial, inhibiendo la apoptosis celular. Muerte, desempeñando así un papel protector contra DN. Este efecto sinérgico multi-objetivo hace que los CDP muestren buenas perspectivas de aplicación en el tratamiento de DN. En estudios posteriores, la estructura de polisacárido se determinará adicionalmente por difracción de rayos X, espectroscopía de resonancia magnética nuclear y espectrometría de cromatografía de gases-masas. Además, los resultados promedio de peso molecular muestran que los CDP son polisacáridos heterogéneos. A continuación, separaremos y purificaremos polisacáridos homogéneos, detectaremos la estructura de polisacáridos y la actividad biológica y aclararemos la relación estructura-actividad.