Caracterización estructural del polisacárido de cistanche deserticola y su efecto protector sobre la lesión de células HK {{1 1}}} inducida por glucosa

Abstracto:

 

Objetivo: estudiar la estructura de los polisacáridos de deserticola de Cistanche (CDP) y el efecto protector y el mecanismo de las células epiteliales tubulares proximales humanas (HK {{0}}}). Métodos: La composición química, el peso molecular, la composición de monosacárido y la posible estructura de los CDP se detectaron mediante el método de fenol de ácido sulfúrico, método de bifenilo de hidroxilo, método de azul brillante de coomassie, método de cromatografía iónica, cromatografía de permeación gel de alto rendimiento y cromatografía infrarroja. El efecto protector de los CDP en la lesión HK -2 y su mecanismo se evaluaron estableciendo un modelo de daño de células HK -2 inducidas por glucosa alta. y arabinosa, y puede haber unión glucosídica. Puede reducir el daño oxidativo de las células HK -2 inducidas por la alta glucosa y el daño del potencial de membrana mitocondrial de las células HK -2 inducidas por la glucosa alta. La expresión relativa de la proteína 4 (TLR4) del receptor de Toll (TLR4) y la relación de factor p -nuclear (NF) -κB p65 / -actina y p -iκB / -actina en HK -2} disminuyeron significativamente después de la intervención con diferentes concentraciones de CDP (P <0.05, p <0.01). Conclusión: los CDP pueden reducir el altocélula epitelial tubular renal inducida por glucosaLesión al inhibir TLR4 / NF-κB para promover la proliferación celular e inhibir el estrés oxidativo y la apoptosis.

 

Palabras clave: Cistanche deserticola polisacárido; Células epiteliales tubulares renales humanas; Estrés oxidativo; Vía TLR4/NF-κB

 

 

 

Cistanche para la nefropatía por diabetes (DN)

 

Nefropatía por diabetes (DN)es la principal causa de enfermedad renal en etapa terminal y amenaza seriamente la vida y la salud de los pacientes [1]. La lesión tubular renal juega un papel clave en la ocurrencia y el desarrollo de DN. Las anormalidades hemodinámicas, el estrés oxidativo, la respuesta inflamatoria y las anormalidades metabólicas causadas por un ambiente alto en azúcar pueden inducir apoptosis y necrosis de las células epiteliales tubulares renales, lo que provoca daños tubulares renales [2,3]. TLR4 en el riñón es miembro de la familia TLRS, y su transducción de señales relacionada juega un papel importante en la ocurrencia y el desarrollo de DN [4]. En condiciones de glucosa altas, la alta expresión de TLR4 en el riñón puede activar la vía NF-κB, agravando el daño oxidativo celular y causando HK -2 apoptosis celular [5, 6].
Cistanches Herba es el tallo carnoso seco con hojas de fósforo de Deserticola ycma y (o) Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, una planta tradicional medicinal y comestible. Sabe dulce, salado,

Es calentador y entra en elMeridianos de riñón e intestino grueso. Tiene los efectos de tonificar el yang del riñón, mejorar la esencia y la sangre, y humedecer los intestinos y aliviar el estreñimiento. [7] Los polisacáridos son uno de los principales ingredientes activos de Cistanche Deserticola. El contenido de los polisacáridos en el extracto de agua de la desértica de Cistanche es relativamente alto, con literatura que informa que el contenido es de 29.598 a 39.609 mg/g [8]. Se compone principalmente de glucosa, galactosa, ramnosa, arabinosa, fructosa, etc. Se compone de monosacáridos y tiene muchos efectos farmacológicos, incluida la regulación de la actividad inmune, el antienvejecimiento, la mejora del aprendizaje y la memoria, la protección de los nervios, la resistencia al daño hepático, el antivirus y el antitumoral [9]. En los últimos años, una gran cantidad de estudios han demostrado que los polisacáridos en la medicina tradicional china pueden mejorar la nefropatía diabética. Las características de múltiples ataques múltiples y los efectos significativos de los polisacáridos herbales chinos muestran un gran potencial en la intervención en la nefropatía diabética [10]. En el estudio de Wang et al. [11], los polisacáridos de Banyan mostraron efectos significativos en la mejora del metabolismo de la glucosa y los lípidos, reducen las respuestas inflamatorias y regulan la microbiota intestinal de los ratones diabéticos tipo 2 a través del eje del hígado intestinal. Estudios anteriores del equipo de investigación han demostrado que el extracto de agua de la desérticola de Cistanche puede aumentar la tasa de supervivencia de las células HK -2 en un entorno de alto nivel y alto en grasas, regular la apoptosis celular, el estrés oxidativo y los niveles de inflamación, y tiene un efecto terapéutico potencial sobre la nefropatía diabética [12]. Los resultados experimentales animales mostraron que los CDP pueden mejorar efectivamente la nefropatía diabética en ratones, y los resultados patológicos mostraron que la fibrosis tubular renal mejoró significativamente [13]. Sin embargo, hay pocos estudios sobre el papel de los polisacáridos de Deserticola de Cistanche en la protección del modelo de células HK -2} inducida por glucosa. En vista de la potencial actividad farmacológica y el mecanismo de los polisacáridos, este estudio tiene como objetivo detectar la composición química, la estructura molecular y la estructura molecular de los CDP mediante el uso del método de fenol de ácido sulfúrico, el método hidroxibifenilo, el método azul brillante de la coomástica, la cromatografía iónica, la cromatografía del gel de alto rendimiento y la cromatografía infraredada. Se analizaron la masa, la composición del monosacárido y la posible estructura, y se estableció un modelo de daño de células HK -2 inducidas por alta glucosa para evaluar el efecto protector de los CDP en el daño HK -2 y su mecanismo de acción. Proporcionar base teórica y evidencia experimental para la aplicación potencial de CDP en el tratamiento de DN.

1 Materiales y métodos
1.1 Materiales e instrumentos

CDPS (contenido de polisacárido> 8 0%, número de lotes: 2306019, Shaanxi xintianyu Company); dapagliflozin (dapa, número de lotes: BMS -512148, AstraZeneca Pharmaceuticals Co., Ltd.); Células epiteliales tubulares renales humanas HK -2 (número de lotes: 20231014, Actt Company, EE. UU.); MEME MEMMUT MEM, suero bovino fetal (número de lote: 20231014, 20231014, Gibco Company, EE. UU.); PBS Buffer (número de lote: 20230906, Hyclone Company, EE. UU.); Solución de digestión con tripsina que contiene EDTA al 0,25% (número de lote: 20240411, Anhui BioSharp Company); CCK -8 Kit de detección de viabilidad celular (número de lotes: 20240415, Wuhan Elarite Biotechnology Co., Ltd.); superóxido dismutasa (SOD), malondialdehído (MDA), glutatión peroxidasa
Kit de detección de peroxidasa, GSH-PX) (lote no.: 20240505, 20240423, 20240423, Shanghai Yoxuan Biotechnology Co., Ltd.); Kit de apoptosis de tinción HOECHST33258 (Batch No.: 20240223, Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.); JC -1 tinción
Kit de detección de potencial de membrana mitocondrial (lote no.: 20240319, Wuhan Elarite Biotechnology Co., Ltd.); Reactivo de detección de oxígeno (ROS) de diacetato de diclorofluoresceína (DCF-DA) reactivo de detección de oxígeno (ROS)
Kit (lote no.: 20231225, Beijing Solebow Technology Co., Ltd.); Anticuerpo monoclonal TLR4, factor nuclear fosforilado κB p65 (Phosfo-NF-κB p65, P-NF-κB p65) Anticuerpo monoclonal (lote no.: 10032512, 00128965, Wuhan Sanying Biotechnology Co., Ltd..

Cromatógrafo de iones ICS5000, lector de microplacas MUL-TIGO (Thermo Fisher, EE. UU.); Instrumento de electroforesis PowerPac HC+Mini proteína (Biorad, EE. UU.); Microscopio invertido TS2 (Nikon, Japón); LC -10 Un cromatógrafo líquido de alto rendimiento, ri -20 un detector diferencial (Shimadzu Technology Co., Ltd., Japón); 105-103-101 (8 mm × 300 mm) columna de gel en tándem (BRT Company, Reino Unido); Balance electrónico CPA225D, Eppendorf5424 Centrifuge (Sartorio, Alemania).

 

1.2 Métodos experimentales
1.2.1 Determinación del contenido total de azúcar, ácido urónico y proteína de CDPS

El método se siguió según la referencia [14]. El contenido total de azúcar de los CDP se determinó mediante el método de ácido fenol-sulfúrico; El contenido de ácido urónico de CDP se determinó mediante el método colorimétrico m-hidroxibifenilo; y el contenido de proteína de los CDP se determinó mediante el método azul brillante Coomassie.

 

1.2.2 Determinación de la masa molecular

La distribución del peso molecular de los polisacáridos se detectó mediante columnas en tándem de cromatografía de permeación en gel de alto rendimiento. Una serie de dextran estándar (dextran p {{0}}, p -10, p -20, p -50}, p -100, p {{5}, p -400}}}}}}}}}}} en 0. 0 5 mol/l antes de usar. La concentración final fue de 5 mg/ml, se vórtex para disolver y centrifugarse a 12 0 00 R/min durante 10 min. El sobrenadante se aspiró y se filtró con una membrana microporosa de agua de 0.22 μm. Después de la centrifugación de alta velocidad, se usó NaCl de 0.05 mol/L como fase móvil. La columna cromatográfica fue BRT 105-103-101 (8 mm × 300 mm); El caudal fue de 0,7 ml /min; Temperatura de la columna: 40 grados; Volumen de inyección: 25 μl; detector: detector diferencial Rid -20 a; Tiempo de análisis: 62 min. Seleccione el método cromatográfico anterior para el análisis, obtenga el tiempo de retención y traza el logaritmo del peso molecular máximo (MP) en la ordenada (LGMP) y el tiempo de retención (RT) en la abscisa (LGMP-RT). Curva estándar: de acuerdo con el método anterior, el peso molecular promedio de peso (MW) Tiempo de retención estándar LGMW-RT y el número de peso molecular promedio (MN) Curva estándar LGMN-RT para obtener el peso molecular. Fórmula de cálculo. Sustituyendo el tiempo de retención de la muestra en la fórmula, se puede obtener el peso molecular (MP, MW, MN).

1.2.3 Composición de monosacárido

La composición del monosacárido se determinó mediante cromatografía iónica. Tome cantidades apropiadas de 16 estándares de monosacárido (fucosa, ramnosa, arabinosa, galactosa, glucosa, xilosa, manosa, fructosa, ribosa, ácido galacturónico, ácido glucurónico, clorhidrato de aminogalactosa), ácido de glucosamina, hidrocloruro, n-acetil-d-glucosamina, ácido de gulururononic, mannurononic, mannuronic), mannuronic ácido). Ml de ácido trifluoroacético de 3 mol/l (TFA), hidrolizado a 120 grados durante 3 h, secado con nitrógeno y agregado para eliminar el vórtice el agua desionizada para mezclar bien y preparar la solución madre estándar. Tome cada solución estándar de monosacárido y prepare con precisión el estándar de concentración como estándar mixto. De acuerdo con el método de cuantificación absoluta, se determinaron las masas de diferentes monosacáridos, y la relación molar se calculó en función de la masa molar de los monosacáridos.
Agregue 2 ml de 3 mol/l de TFA al polisacárido y reaccione a 12 0 grado durante 3 h. Durante la reacción, se usó N2 para la protección. Disolver después de la evaporación a presión reducida. Agregue 5 ml de agua y vórtice para mezclar. Tome 5 0 µl y agregue 950 µl de agua desionizada. Centrífuga a las rpm durante 5 min. El sobrenadante se filtró a través de una membrana de microfiltración de 0.22 µM y se analizó por cromatografía iónica. La columna fue DionEx Carbopactm PA20 (3 mm × 150 mm); La fase móvil fue A: H2O; B: 15 mol/LNAOH; C: 15 mol/ L NaOH y 100 mol/ L NAAC; caudal: 0.3 ml/min; Volumen de inyección: 25 µl; Temperatura de la columna: 30 grados ;. Detector: detector electroquímico; Gradiente de elución Ver Tabla 1.

 

Tabla 1 Tabla de elución de gradiente de fase móvil

 

 

1.2.4 Detección de espectro infrarrojo

Pese 1 mg de polisacárido seco y en polvo KBR, muele y mezcle en un mortero, y presione en láminas delgadas con una prensa de tableta. El análisis se llevó a cabo utilizando el espectrómetro infrarrojo de transformación de Fourier en el rango de número de onda de 4500 ~ 400cm -1.

 

1.2.5 Efecto protector de CDP en células HK -2 inducidas por glucosa alta en nefropatía diabética

1.2.5.1 HK -2 cultivo celular

Después de revivir las células HK {{0}}}, se cultivaron en MEM Complete Medium que contenía su suero bovino fetal al 10% y un anticuerpo doble al 1%, y las células se colocaron en una incubadora de cultivo celular a 37 grados, al 5% de CO2 y humedad saturada para adherirse a la pared. . Cuando las células crecen a 80% a 90%, se digieren con tripsina al 0,25% y subcultivadas. Las células HK -2 en la fase de crecimiento logarítmico se usaron para experimentos posteriores.

 

1.2.5.2 Preparación de la solución madre de CDP y concentración de dosificación.

Pese con precisión 3 0 mg de CDP, agregue 6 ml de MEM Glucose Complete Medium para preparar una solución madre de 5 mg/ml de CDPS y guárdelo en un refrigerador de 4 grados. Al usar, mida un cierto volumen de solución madre CDPS, agregue medio de cultivo, mezcle bien, esterilice con un filtro estéril de 0.22 µM y prepare una solución de muestra de concentración adecuada.

 

1.2.5.3 Efectos de CDP en celdas HK HK normales

Las células HK -2 en la fase de crecimiento logarítmico se sembraron en placas de pozos 96- a una densidad de 3000 células/pocillo. Según los resultados experimentales preliminares, las células se dividieron en un grupo de control normal (grupo de control, CON), diferentes concentraciones de masa (25, 50, 100, 200, 400, 800, 1000, 1600 ug/ml)
Se estableció un grupo en blanco que contenía solo medio de cultivo; Después de cultivar con medio de cultivo o medicamentos durante 24 hy 48 h, se añadieron 100 μl de medio de cultivo que contenía CCK al 10% -8 a cada pocillo y las células se incubaron a 37 grados para evitar la licencia a la luz durante 1,5 h. La densidad óptica (OD) de cada pocillo se midió a una longitud de onda de 450 nm usando un lector de microplacas, y la viabilidad celular (%) se calculó de acuerdo con la fórmula "Viabilidad celular (%)=[(OD del pozo de fármaco del fármaco de un pozo en blanco) (OD del pozo de control / OD de en blanco)] × 100%" a calcular la tasa de supervivencia y la tasa de supervivencia de la célula de la célula de la célula de control). Medicamentos a las células normales.

1.2.5.4 HK -2 Celda Tiempo de modelado de glucosa alto y detección de concentración
Prepare la solución madre de glucosa (glucosa, GLC) (10 mg/ml) y diluya con medio de cultivo completo a concentraciones de modelado de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 y 80 mmol/L respectivamente para su uso. Las células HK -2 en la fase de crecimiento logarítmico se sembraron en placas de pozos 96- a 3000/pozo, y con, grupo de modelos (modelo, mod) y grupo de ajuste en blanco se establecieron y se les dieron medio de cultivo completo y medio de cultivo de glucosa alto de diferentes concentraciones, respectivamente. , igual cantidad de medio de cultivo completo, cultivo durante 24 hy 48 h, y detectar la viabilidad celular de acuerdo con el método bajo "1.2.5.3".

 

1.2.5.5 Efecto de los CDP en la tasa de supervivencia de las células modelo

De acuerdo con los resultados experimentales de "1.2.5.4", las células HK -2 en la fase de crecimiento logarítmico se sembraron en placas de pozos 96- a una densidad de 3000 células por pozo. Las células se dividieron en concentraciones de masa CON, mod y diferentes de 50, 100 y 200, las células se cultivaron a 400 ug/ml, 400 ug/ml y 800 ug/ml de CDP. Se estableció un grupo de ajuste en blanco sin celdas. Los grupos de ajuste de estafa y en blanco se agregaron con una cantidad igual de medio completo. Mod y cada grupo tratado con drogas se agregaron con 60 mmol/L GLC y se cultivaron durante 24 h. , deseche el medio de cultivo, agregue el medio de cultivo o los medicamentos y el cultivo correspondientes durante 24 hy 48 h, y detecten la tasa de supervivencia celular de acuerdo con el método bajo "1.2.5.3".

 

1.2.5.6 Efectos de los CDP en los indicadores de estrés oxidativo en células modelo

Según los resultados del experimento en "1.2.5.5", las células se dividieron en el grupo CDPS CDPS con dosis al altas (CDPS-H, 400 mg/kg), el grupo CDPS de dosis media (CDPS-M, 200 mg/kg), grupo de dosis baja (CDPS-L, 100 mg/kg) y grupo de dapagliflozina (DAPA, 10 μMol/l, un grupo en blanco) y un grupo en blanco). Grupo de ajuste cero, después del modelado, el medio de cultivo o las drogas correspondientes se agregaron y cultivaron durante 24 h. Se recogieron proteínas y los lisados ​​se normalizaron al mismo nivel por corrección de concentración de proteínas. Según las instrucciones de cada kit de indicadores, se detectó la actividad MDA, el contenido de GSH-PX y la actividad de SOD en cada grupo de células.

 

1.2.5.7 Detección de ROS en HK -2 celdas

Agregue la suspensión celular a una placa de pozo 6- y colóquela en una incubadora de cultivo celular hasta que las células se conviertan en una monocapa y reciban la estimulación correspondiente. Lave las células 3 veces con PBS precoludido y diluido con medio MEM sin suero. El colorante fluorescente DCF-DA se diluyó a una concentración final de 10 µmol/L. El colorante se agregó a una placa de pozo 6-, las células se lavaron 3 veces con PBS precoludido y el colorante fluorescente DCFH-DA se diluyó a una concentración final de 10 µmol/L con medio MEM sin suero. µmol/L, el tinte se agregó a una placa de pozo 6-, se desechó el tinte, las células se lavaron tres veces con medio MEM sin suero y luego las imágenes se recogieron bajo un microscopio de fluorescencia.