Estudio sobre el método de determinación del contenido de glucósido pineal y glucósido de ergosterol en Cistanche tubulosa

Cistanche tubulosa es un tallo carnoso seco con hojas escamosas perteneciente al género Cistanche de la familia Ledaceae. Es de naturaleza cálida, de sabor dulce y salado y pertenece a los meridianos del riñón y del intestino grueso. Tiene efectos tradicionales como tonificar el yang del riñón, nutrir la esencia y la sangre, humedecer los intestinos y promover las deposiciones y retrasar el envejecimiento. Se le conoce como el "Ginseng del Desierto". A partir de la edición de 2010 de la Farmacopea de la República Popular China, Cistanche tubulosa (Schrenk) R. Wight se agregó como una de las plantas basales legales de Cistanche y se incluyó junto con C. deserticola.

Cistanche tubulosa se produce principalmente a lo largo del borde sur de la cuenca del Tarim en la Región Autónoma Uygur de Xinjiang y crece de forma parásita en las raíces de las plantas de Tamarix. Actualmente es la principal fuente de materiales medicinales de Cistanche tubulosa en el mercado chino, con una producción anual que representa más del 60%. Debido a la creciente escasez de recursos silvestres, ha sido incluida como una planta protegida de segunda clase en la Lista Nacional de Plantas Silvestres Protegidas Clave (edición 2021).

La investigación farmacológica moderna ha demostrado que la sustancia farmacológica principal de Cistanche tubulosa se basa en glucósidos feniletanoides (PhG), entre los cuales el echinacósido (C35H46O20) y el acteosido/verbascósido (C29H36O15) tienen el mayor contenido y la mayor actividad, y la farmacopea china los designa explícitamente como componentes característicos para el control de calidad de los materiales medicinales de Cistanche tubulosa. Según la edición de 2020 de la Farmacopea China, la cantidad total de echinacrosido y verbascosido en el producto seco de Cistanche tubulosa no debe ser inferior al 1,5 %, que es mucho más alto que el estándar del 0,30 % para la Cistanche tubulosa del desierto. Por lo tanto, establecer métodos de determinación del contenido precisos, eficientes y reproducibles es de gran importancia para el control de calidad, la evaluación del origen, la optimización de la plantación y el desarrollo de productos de los materiales medicinales de Cistanche tubulosa.

Equinósido, el principal componente químico de Cistanche tubulosa

Acteoside, el principal componente químico de Cistanche tubulosa

Características químicas del glucósido de crisantemo de piña y del glucósido de ergotamina

estructura química

El glucósido de piña y el glucósido de ergosterol son glucósidos feniletanoideos, cuyo esqueleto básico está compuesto por un núcleo feniletanoide conectado por enlaces glucosídicos a grupos de azúcar (generalmente glucosa y ramnosa), y grupos sustituidos como los grupos cafeoílo se introducen en la posición hidroxilo fenólico. La fórmula molecular del equinacósido es C35H46O20, con un peso molecular relativo de 786,72. Su estructura contiene un grupo cafeoilo, un grupo glucosa y un grupo ramnosa. La fórmula molecular del glucósido de ergosterol (verbascósido) es C29H36O15, con un peso molecular relativo de 624,59. Su estructura es similar a la del pinealósido, pero carece de ramnosa y algunas sustituciones de cafeoilo. Ambos son fácilmente solubles en disolventes polares como metanol, etanol y agua, y tienen una absorción característica en la región ultravioleta (longitud de onda de absorción máxima alrededor de 330 nm), lo que proporciona una base teórica para la detección por HPLC-UV.

Actividad farmacológica

El glucósido de crisantemo de piña y el glucósido de ergosterol tienen una amplia gama de actividades farmacológicas: (1) efecto antioxidante, al eliminar aniones superóxido (O2 · -), radicales hidroxilo (· OH) y peróxido de hidrógeno (H2O2), activando la vía de señalización Nrf2/ARE y regulando positivamente la actividad de enzimas antioxidantes como SOD y GSH Px; (2) Efecto neuroprotector: promueve la expresión de factores neurotróficos como el GDNF, que tiene un efecto mejorado en los modelos de enfermedad de Alzheimer y Parkinson; (3) Efectos similares a los de las hormonas: promueven la expresión de enzimas relacionadas con la síntesis de testosterona y mejoran la función reproductiva; (4) Efecto hepatoprotector: reduce el daño hepático alcohólico y el estrés oxidativo; (5) Efecto antitumoral: induce la apoptosis de células cancerosas de esófago a través de vías dependientes de mitocondrias. Las actividades anteriores los convierten en componentes indicadores insustituibles para la evaluación de la calidad de Cistanche tubulosa.

Efectos del cistanche-antitumoral.

Descripción general de los métodos de determinación del contenido

En la actualidad, los métodos para determinar el contenido de glucósido pineal y glucósido de ergosterol en Cistanche tubulosa incluyen principalmente cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UPLC), digitalización de imágenes de cromatografía de capa fina (TLC ImageJ) y espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida (LC-MS/MS). Entre ellos, el método HPLC ha sido adoptado como método de determinación legal por la Farmacopea China debido a su gran popularidad en el equipo, operación simple y buena reproducibilidad, y actualmente es el método más ampliamente reportado en la literatura. Lo siguiente se centra en el proceso de establecimiento y optimización del sistema del método HPLC.

La influencia de diferentes orígenes y anfitriones en el contenido.

Diferencias de origen

Múltiples estudios han demostrado consistentemente que existen diferencias significativas en el contenido de echinacrosido y ergosterol en Cistanche tubulosa de diferentes regiones. Tomando Xinjiang como ejemplo, la diferencia en el contenido de dos componentes en muestras de lugares como el condado de Hetian Moyu, el condado de Kashgar Jiashi y la ciudad de Alar puede llegar a ser de 2 a 5 veces. En términos generales, la cantidad total de glucósidos de feniletanoides en Cistanche tubulosa producida en el área de Hotan (especialmente los condados de Moyu, Minfeng y Yutian) es relativamente alta, y el contenido de glucósidos de feniletanoides en algunas muestras de alta calidad puede alcanzar del 2,5% al ​​5,0%, superando con creces el estándar de la farmacopea del 1,5%.

Diferentes influencias del anfitrión

Cistanche tubulosa parasita las raíces de diferentes plantas del género Tamarix y las especies hospedadoras tienen un impacto significativo en la calidad de los materiales medicinales. Chen et al. (2005) informaron que el contenido de ácido feniletanólico en muestras parasitadas con T. talama kanensis era generalmente mayor que el parasitado con T. ramosissima. Además, existen diferencias entre productos silvestres y cultivados. Generalmente, el contenido de dos componentes en los productos silvestres es mayor que el de los productos cultivados, pero los productos cultivados de alta calidad también pueden alcanzar niveles más altos optimizando las condiciones de plantación.

Diferencias en especificaciones y piezas.

Las especificaciones (diámetro, longitud) y las partes medicinales de Cistanche tubulosa también influyen en su contenido. Las investigaciones han demostrado que el contenido de echinacósido y ergosterol en los tallos carnosos más delgados suele ser mayor que en los tallos más gruesos; El contenido en la parte superior del tallo (cerca del extremo de la inflorescencia) suele ser mayor que el de la base. Esta regla proporciona una referencia para la selección de piezas durante la recolección y procesamiento de hierbas medicinales.

Introducción a otros métodos de medición.

Cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UPLC)

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El método UPLC utiliza una columna de cromatografía con un tamaño de partícula más pequeño (como Waters HSS T3, 1,8 μ m, 100 × 2,1 mm), un caudal de 0,3 ml/min, un volumen de inyección de solo 1 μ L y el tiempo de análisis se puede acortar a 10-15 min (la HPLC tradicional requiere 30-50 min), con mejor separación y sensibilidad. Liang Jiansong et al. (2021) establecieron un método UPLC para la determinación simultánea de seis glucósidos feniletanólicos, que tiene un amplio rango lineal y una alta tasa de recuperación, y es adecuado para la detección rápida de grandes cantidades de muestras.

Método LC-MS/MS

El método de espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida tiene una sensibilidad extremadamente alta y puede determinar simultáneamente docenas de componentes en Cistanche tubulosa, incluidos echinacósido, glucósido de ergosterol, glucósido de isoergosterol y guanosina A. Es adecuado para la investigación metabolómica y la evaluación integral de la calidad. La tecnología combinada RPLC-HILIC puede incluso medir 23 componentes polares y no polares a la vez, cubriendo un rango de contenido de 5 órdenes de magnitud.

Método HPLC de cromatografía por corrientes de Foucault de microextracción con disolvente presurizado en línea

Este método combina la extracción, purificación y separación cromatográfica de muestras en línea, lo que reduce significativamente el consumo de disolventes orgánicos y el uso de muestras. Los LOQ de los tres glucósidos feniletanólicos son 0,50 mg/L (equinacósido), 0,25 mg/L (ergosterol glucósido) y 0,38 mg/L (isoergosterol glucósido), respectivamente, que son adecuados para el análisis rápido de muestras valiosas.

Método de digitalización de imágenes TLC

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Basado en el software ImageJ, se realizó un análisis cuantitativo de los valores de gris de las manchas de cromatografía de capa fina. Los coeficientes de correlación r del glucósido de crisantemo pineal, guanosina A, glucósido de ergosterol y glucósido de isoergosterol fueron 0,9974, 0,9931, 0,9923 y 0,9890, respectivamente, que fueron consistentes con el método de HPLC. Este método es de bajo costo, fácil de operar y adecuado para una detección rápida en unidades de base y en el campo.

discusión

Cuestiones clave para optimizar las condiciones cromatográficas.

La selección de la fase móvil es crucial en el desarrollo de métodos de HPLC. La comparación de la literatura muestra que: (1) el sistema de acetonitrilo de agua es propenso a provocar colas en el pico del glucósido feniletanol, y agregar 0,1 % de ácido fórmico o 1 % de ácido acético puede mejorar significativamente la forma del pico; (2) La eficiencia de separación del sistema ternario de ácido acético de metanol acetonitrilo es superior a la del sistema binario de metanol puro o acetonitrilo puro; (3) La selección de la longitud de onda de detección de 330-334 nm puede equilibrar la intensidad de absorción de ambos componentes, con una respuesta ligeramente mayor a 334 nm y menos interferencia del ergosterol a 330 nm. La temperatura de la columna tiene un impacto en el tiempo de retención pero no cambia significativamente el grado de separación, con un rango razonable de 30 a 35 grados.

Optimización de métodos de extracción

La concentración de disolvente, la relación sólido-líquido, la temperatura del ultrasonido y el tiempo afectan la eficiencia de la extracción. Las investigaciones han demostrado que: (1) 50%~80% de metanol o etanol pueden extraer eficazmente ambos componentes de glucósidos, con una tasa de extracción ligeramente mayor de 60%~80% de etanol; (2) Una proporción sólido-líquido de 1:30~1:50 (g/mL) es suficiente para una extracción completa; (3) La combinación óptima es una temperatura de ultrasonido de 50 a 60 grados y un tiempo de 40 minutos; (4) La extracción ultrasónica es superior a la extracción por reflujo, ya que esta última puede conducir fácilmente a la degradación de los glucósidos feniletanólicos termosensibles.

Discusión sobre la racionalidad de las normas de la farmacopea

La farmacopea actual estipula que la cantidad total de paeoniflorina y glucósidos de ergosterol en Cistanche tubulosa debe ser superior o igual al 1,5%. Este estándar es relativamente flexible: las muestras de alta calidad de Xinjiang generalmente alcanzan entre el 3% y el 5%, y sólo unas pocas muestras de baja calidad se acercan al límite inferior. Algunos investigadores sugieren aumentar el estándar entre 2,0% y 2,5% para garantizar mejor la calidad de los materiales medicinales. Además, la farmacopea sólo utiliza dos componentes como indicadores, mientras que Cistanche tubulosa también contiene varios glucósidos feniletanólicos activos como la guanosina A, los glucósidos de isoergosterol y la hesperidina. La evaluación integral de indicadores múltiples es la dirección del desarrollo futuro.

Sugerencias para la selección del método

Para la inspección de calidad de materiales medicinales generales y el control de calidad de la producción diaria, se recomienda utilizar el método HPLC de la farmacopea. El método está maduro, los requisitos de equipamiento son bajos y los resultados son muy comparables. Para el cribado de muestras a gran escala o el análisis de muestras valiosas, los métodos UPLC o PLME-TFC-HPLC en línea son más eficientes. El método de clasificación LC-MS/MS es el método preferido para la evaluación de calidad en profundidad y la identificación de variedades. El método de imagen TLC es adecuado para una detección inicial rápida a nivel de base. Los investigadores deben tomar decisiones razonables basadas en las necesidades reales.

extracto de cistanche en polvo

Conclusión

Este artículo detalla sistemáticamente el método HPLC para determinar el contenido de equinacósido y ergosterol en Cistanche tubulosa. Este método ha sido validado mediante metodología multidimensional y tiene las características de un amplio rango lineal (r mayor o igual a 0,999), buena precisión (RSD<3%), high accuracy (recovery rate 95.7%~100.7%), and easy operation, fully meeting the quality control requirements of the Chinese Pharmacopoeia for Cistanche tubulosa.

Un análisis exhaustivo muestra que: (1) el contenido de glucósido pineal en Cistanche tubulosa suele ser de 3 a 8 veces mayor que el de glucósido de ergosterol, y la cantidad total de los dos varía según el lugar de origen, el huésped, el tamaño y la ubicación; (2) La cantidad total de ácido feniltanólico en muestras de alta calidad de Hotan, Xinjiang, puede alcanzar de 2 a 3 veces o más el estándar de la farmacopea; (3) Las nuevas tecnologías como UPLC y LC-MS/MS proporcionan herramientas poderosas para la determinación sincrónica de múltiples componentes y una evaluación profunda de la calidad.

Las investigaciones futuras deberían centrarse en: (1) establecer un sistema de evaluación de calidad de índices múltiples que cubra más glucósidos feniletanoides; (2) investigar exhaustivamente el impacto integral del entorno de plantación, el período de cosecha del huésped y el método de procesamiento en el contenido; (3) promover la estandarización de toda la cadena industrial de Guanhua Cistanche, desde hierbas medicinales hasta alimentos naturales y materias primas cosméticas.

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