Abstracto

Lesión renal aguda (IRA)Es una condición crítica caracterizada por una rápida disminución enfunción renaldebido a múltiples factores como nefrotoxicidad, sepsis e isquemia.Lesión renalEs un proceso complejo y a largo plazo, en el que el daño inicial puede progresar aenfermedad renal crónicae inclusoinsuficiencia renal terminal. La IRA se manifiesta a través de daño del parénquima renal, necrosis tubular y reducción de la tasa de filtración glomerular, lo que conduce a una disminución de la producción de orina, desequilibrio electrolítico, acumulación de desechos metabólicos y niveles elevados de nitrógeno ureico en sangre (BUN), creatinina sérica (Scr) y ácido úrico. La IRA suele aparecer como parte de síndromes clínicos como insuficiencia cardíaca o insuficiencia hepática y afecta entre el 10 y el 15% de los pacientes hospitalizados y hasta el 50% de los que se encuentran en unidades de cuidados intensivos (UCI). La rápida aparición y el mal pronóstico de la IRA la han convertido en un desafío de salud pública mundial. Los tratamientos médicos occidentales actuales se basan principalmente en terapias de apoyo y de reemplazo, que son costosas y a menudo producen resultados subóptimos. La medicina tradicional china y mongola, arraigada en miles de años de práctica holística, ofrece un enfoque de múltiples objetivos, múltiples vías y múltiples efectos con alta eficacia y seguridad. En los últimos años, la medicina tradicional se ha convertido en un tema de investigación candente para el tratamiento de la IRA. Por lo tanto, explorar el mecanismo de la medicina mongol que contiene Cistanche en el tratamiento de la IRA tiene un valor significativo.

La medicina compuesta mongol basada en Cistanche es una prescripción clásica compuesta deCistanche, granada, canela, pimiento largo (Piper longum), Alpinia officinarum, Amomum villosum, yborneol. Según la teoría médica tradicional de Mongolia, el riñón reside en la posición "Badagan" entre las cinco vísceras, y las enfermedades renales suelen ser del tipo Badagan, provocadas por el frío. Se cree que las fórmulas que contienen cistanche, al ser cálidas por naturaleza, expulsan el frío de los riñones y ejercen efectos protectores sobre la función renal, de acuerdo con el principio mongol de "tratar el frío con calor". Estudios anteriores han demostrado que dichas fórmulas, cuando se usan en combinación con otros medicamentos mongoles, brindan protección renal en modelos de IRA. Con base en esto, el presente estudio tiene como objetivo utilizar la farmacología en red y la validación experimental para explorar los componentes bioactivos, los objetivos terapéuticos y las vías clave deMedicina mongol que contiene cistanche para mejorar la IRA, sentando una base teórica para su aplicación clínica y desarrollo posterior.

 

 

 

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1. Materiales y Métodos

1.1 Análisis de farmacología de la red

1.1.1 Identificación de compuestos activos y objetivos

Utilizando las palabras clave "Cistanche, Piper longum, Alpinia officinarum, canela, granada, Amomum villosum, Borneol", buscamos enBase de datos de farmacología de sistemas de medicina tradicional china (TCMSP)[http://tcmsp-e.com] para recuperar compuestos bioactivos y sus objetivos. Los criterios de selección fueron:biodisponibilidad oral (OB) Mayor o igual al 30%ysemejanza a las drogas (DL) Mayor o igual a 0,18. Para Cistanche y canela, que carecen de componentes que cumplan con estos umbrales, complementamos los datos del compuesto/objetivo utilizando la revisión de la literatura yPredicción SwissTarget[https://www.swisstargetprediction.ch/]. Dado que el componente principal del borneol es el cloruro de amonio, se excluyó de análisis adicionales. Todos los objetivos de proteínas recolectados se estandarizaron paraNombres de los genes del Homo sapiensusando elUniProtbase de datos [https://www.uniprot.org].

1.1.2 Construcción de una red objetivo compuesto

Los datos recopilados se organizaron en archivos RED y TIPO y se analizaron utilizandoCitoscape 3.9.1construir una red de interacción compuesto-objetivo para la medicina mongol basada en Cistanche.

1.1.3 Detección de objetivos relacionados con IRA

Los objetivos asociados a la IRA se obtuvieron utilizando las palabras clave "lesión renal aguda" e "insuficiencia renal aguda" de:

Tarjetas genéticas[https://www.genecards.org/]

OMIM[https://omim.org/]

Base de datos de objetivos terapéuticos (TTD)[https://db.idrblab.net/ttd/]

banco de medicamentos[https://www.drugbank.com/]

FarmaGKB[https://www.pharmgkb.org/]

Los diagramas de Venn se crearon utilizando una herramienta en línea [https://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/] para identificar objetivos superpuestos entre las bases de datos.

1.1.4 Identificación de compuestos principales y objetivos, construcción de red PPI

Usando elAnalizador de redfunción en Cytoscape, analizamos la red de objetivo compuesto. Nodos concentralidad de grado, centralidad de intermediación, ycentralidad de cercaníapor encima de la mediana ylongitud promedio del camino más cortodebajo de la mediana, fueron seleccionados a través de cuatro rondas para identificar los compuestos principales. Se introdujeron objetivos comunes entre el compuesto y los objetivos relacionados con la enfermedad en elCADENAbase de datos [https://cn.string-db.org/], especie establecida en Homo sapiens, para construir elinteracción proteína-proteína (PPI)red. La red se exportó en formato TSV para su posterior análisis en Cytoscape. Se obtuvieron tres rondas de selecciónobjetivos potenciales, y seis rondas dieronobjetivos centrales. Elobjetivo central-red objetivo potencialTambién fue construido en Cytoscape.

1.1.5 Análisis de enriquecimiento GO y KEGG

El análisis de enriquecimiento se realizó enRStudio 4.3.1usandoBioconductor y ClusterProfilerpaquetes. Las anotaciones de ontología genética (GO) incluyeron procesos biológicos (BP), componentes celulares (CC) y funciones moleculares (MF).Enriquecimiento de la vía KEGGTambién se llevó a cabo. La visualización se completó medianteBioinformática.com.cn[https://www.bioinformatics.com.cn/].

1.1.6 Construcción de la red principal compuesto-objetivo-enfermedad-vía

Los compuestos centrales identificados, objetivos potenciales, enfermedades asociadas y vías de señalización se integraron para construir unred principal compuesto-objetivo-enfermedad-víautilizando Cytoscape 3.9.1.

1.1.7 Acoplamiento molecular

Las estructuras compuestas centrales se descargaron dePubChem[https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/] en formato SDF y convertido a MOL2 usandoAbrir Babel 2.4.1. Las estructuras proteicas centrales se recuperaron de laPDB[https://www.rcsb.org/], seleccionado en base al origen del Homo sapiens, alta resolución y preferiblemente cadenas simples. El acoplamiento molecular se realizó utilizandoAutoDockTools 1.5.7, con 50 ejecuciones utilizando el método del Algoritmo Genético. Se seleccionó la mejor conformación de unión con la mayor afinidad de unión y la mayor cantidad de enlaces de hidrógeno. Los resultados se visualizaron enPyMOL 2.5.7.

1.2 Validación experimental

1.2.1 Animales de experimentación

Se adquirieron ratones KM macho de 4 semanas de edad con grado SPF (22 ± 2 g) de SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. (licencia número SCXK (Jing) 2024-0001). Los ratones fueron alojados en el laboratorio de animales de la Facultad de Medicina de Baotou, de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Mongolia Interior. Condiciones: ciclo de luz/oscuridad de 12 h, 24 ± 2 grados, 55 ± 5% de humedad, alimentación ad libitum. Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Institucional (Aprobación No. BYDY-DL2023-36).

1.2.2 Preparación de medicamentos

Se trituró medicina mongol a base de cistanche (número de lote . 907031) a través de un tamiz de malla 100 y se suspendió en CMC-Na al 0,5 %.

1.2.3 Reactivos e Instrumentos

Reactivos clave:

CMC-Na (Solarbio, Pekín)

Lipopolisacárido (Sigma-Aldrich, Shanghai)

Kits de extracción de ARN y transcripción inversa (Sevier Biotech, Wuhan)

Mezcla maestra de qPCR, tampón de lisis RIPA, kit BCA, anticuerpos: PI3K, Akt, p-Akt, -actina (Proteintech, Wuhan)

Kit de detección de ECL (Sevier Biotech, Wuhan)

Instrumentos clave:

Lector de microplacas (Thermo Fisher)

Centrífuga (JIDI-16R)

Sistema de PCR en tiempo real (Thermo Fisher)

Sistema de imágenes en gel (Tanon, Shanghai)

1.2.4 Agrupación, modelado y administración

32 ratones se dividieron aleatoriamente en 4 grupos (n=8):

Control

Modelo

Grupo de Cistanche en dosis bajas (450 mg/kg)

Grupo de Cistanche en dosis altas (900 mg/kg)

Los grupos de Cistanche recibieron sonda oral diaria durante 7 días. El día 7, 2 h después de la dosificación, a todos los grupos excepto al Control se les inyectó por vía intraperitonealLPS (10 mg/kg)para inducir IRA. El grupo de control recibió solución salina.

1.2.5 Morfología renal, peso corporal e índice renal

24 h después del modelado, se registraron el peso corporal y el peso de los riñones. Índice renal=peso total de los riñones (g) / peso corporal (kg).

1.2.6 Pruebas bioquímicas

Los niveles séricos de BUN, Scr y ácido úrico se midieron utilizando kits comerciales.

1.2.7 Análisis histopatológico

Los tejidos renales se fijaron en paraformaldehído al 4%, se deshidrataron, se incluyeron en parafina, se seccionaron y se tiñeron usandotinción HE. El daño tisular se evaluó bajo un microscopio óptico.

1.2.8 qRT-PCR para TNF-, IL-6, IL-1

El ARN total del tejido renal se extrajo, se transcribió de forma inversa y se amplificó utilizando SYBR Green qPCR. Se utilizó GAPDH como control interno. La expresión relativa de ARNm se calculó utilizando elMétodo 2^-ΔΔCt.

1.2.9 Western Blot para la vía PI3K/Akt

Las proteínas se extrajeron del tejido renal utilizando tampón RIPA. La concentración de proteínas se midió mediante el ensayo BCA. Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF, se bloquearon y se sondaron con anticuerpos primarios y secundarios. Las señales se desarrollaron usando ECL y se cuantificaron usandoImagenJsoftware.

1.3 Análisis estadístico

Los datos fueron analizados usandoPrisma GraphPad 9.5. Los resultados se expresaron comomedia ± DE. Para datos distribuidos normalmente con igual varianza,ANOVA unidireccionalseguido porprueba de LSD-tfue usado. Para datos de varianza no normales o desiguales,Prueba de Kruskal-Wallis Hfue aplicado. AValor p < 0,05se consideró estadísticamente significativo.