Estudio sobre el mecanismo de protección de los glucósidos totales de Cistanche Deserticola contra las lesiones inducidas por el alcohol en células de hígado de ratón cultivadas primarias
Jun 04, 2025
Objetivo:
Estudiar el efecto protector de los glucósidos totales de Cistanche deserticola sobre hepatocitos de cultivo primario. Métodos: Los hepatocitos primarios se recolectaron mediante el método de perfusión in situ y el efecto de los glucósidos totales de Cistanche deserticola sobre la tasa de supervivencia de los hepatocitos primarios cultivados dañados por el alcohol se evaluó mediante el método MTT; Se evaluó mediante microscopía de fluorescencia el efecto de los glucósidos totales de Cistanche deserticola sobre la morfología de los hepatocitos de cultivo primario y de los núcleos dañados por el alcohol; El efecto de los glucósidos totales de Cistanche deserticola sobre la apoptosis de hepatocitos de cultivo primario dañados por el alcohol se detectó mediante citometría de flujo; Se utilizó tinción inmunocitoquímica para detectar el efecto de los glucósidos totales de Cistanche deserticola sobre la expresión de bcl-2 y c-fos. Resultados: Después de la lesión por alcohol, la tasa de supervivencia de los hepatocitos primarios disminuyó y hubo cambios obvios en la apoptosis y la necrosis. La expresión del gen inhibidor de la apoptosis bcl-2 disminuyó y la expresión del gen promotor de la apoptosis c-fos aumentó. Los glucósidos totales de Cistanche deserticola pueden mejorar significativamente la tasa de supervivencia celular, mejorar la apoptosis y la necrosis, mejorar la expresión de bcl-2 e inhibir la expresión de c-fos. El efecto dependió de la dosis. Conclusión: Los glucósidos de Cistanche deserticola pueden proteger los hepatocitos cultivados primarios al aumentar la expresión del gen inhibidor de la apoptosis bcl-2, reducir la expresión del gen promotor de la apoptosis c-fos, reducir la apoptosis y la necrosis y aumentar la tasa de supervivencia celular.
Palabras clave: glucósidos totales de Cistanche deserticola; Cultura primaria; hepatocitos; Lesión hepática alcohólica; apoptosis
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En los últimos años, con la mejora del nivel de vida de las personas, el consumo de alcohol ha aumentado rápidamente, acompañado por el aumento de diversas enfermedades relacionadas con el alcohol, y la lesión hepática por alcohol es uno de los problemas importantes. Los estudios han demostrado que Cistanche deserticola tiene efectos protectores de mejora de la función inmune, antienvejecimiento, antirradiación, antioxidante, antiperoxidación lipídica y lesión hepática inducida por el alcohol [1]. Los glucósidos son las principales sustancias activas de Cistanche deserticola.En experimentos anteriores, se verificó mediante experimentos con animales que los glucósidos totales de Cistanche deserticola pueden reducir la producción de radicales libres, mejorar la capacidad de eliminación de los radicales libres y sus metabolitos, inhibiendo así la peroxidación lipídica y desempeñar un papel protector en la lesión hepática inducida por el alcohol.[2]. Este experimento explorará el efecto protector de los glucósidos totales de Cistanche deserticola sobre la lesión hepática alcohólica a nivel celular mediante el cultivo primario de hepatocitos.
1. Materiales y métodos
1.1 Reactivo e instrumento Los glucósidos totales de Cistanche deserticola, polvo de color marrón oscuro, proporcionado por la Facultad de Farmacia de la Universidad de Lanzhou, contiene el 88,6% del total de glucósidos de feniletanol. Disolver en agua bidestilada y diluir la solución de cultivo a la concentración requerida. Marcador enzimático (Beckman Coulter AD340), microscopio de fluorescencia (Olympus, BX51), microscopio de contraste de fase invertida (Leica DMI3000B), citometría de flujo (Beckman colter cell, CellLabQuanta SC), etc.
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1.2 Los hepatocitos primarios se aislaron y cultivaron mediante el método de perfusión in situ [3].
Un ratón Kunming fue anestesiado mediante una inyección intraperitoneal de 0,5 ml de pentobarbital al 0,5%. Después de la desinfección rutinaria de la piel, abra el abdomen, mueva el tracto gastrointestinal hacia la izquierda, exponga la vena porta, pinche con cuidado la aguja de infusión del dispositivo de infusión desde el extremo más alejado de la vena porta, ligue y fíjela. Gire el flujo del equipo de infusión al máximo (aproximadamente 4 ml/min) y deje caer la solución de preperfusión sin calcio precalentada a 37 grados. Cuando el hígado esté inflamado, corte rápidamente el extremo distal de la vena cava inferior y comprima el extremo proximal de la vena cava inferior de forma intermitente para que el hígado se retraiga y se expanda alternativamente. Cuando se elimina la sangre residual y el hígado es uniformemente amarillo y blanco, se utiliza la solución de perfusión tibia de colagenasa al 0,05% (Sigma) para la perfusión de digestión. La digestión se detiene cuando el hígado se vuelve blando e inelástico, aparecen pequeñas vacuolas debajo de la cápsula hepática o incluso aparecen grietas en el tejido hepático. Disociar con cuidado el hígado, transferirlo a una placa estéril que contenga una cantidad adecuada de medio de cultivo DMEM con alto contenido de azúcar (Sigma), retirar la envoltura del hígado y agitarlo suavemente, luego dispersar los hepatocitos en el medio de cultivo, recogerlos en un tubo cónico, agitar y cultivar durante 10 minutos (la frecuencia de vibración es 100 veces/min), centrifugar durante 3 minutos (4 grados, 1000 r/min) y desechar el sobrenadante. Las células se suspendieron con el medio de cultivo, se filtraron con una malla de nailon de 200 mallas y el filtrado se centrifugó repetidamente 3 veces (4 grados, 1000 r/min) para obtener células de parénquima hepático. Ajustar la concentración celular a 5 × 106 células/ml, inocularlas en un matraz de cultivo de 25 ml pretratado con colágeno de cola de rata y luego incubarlas en una incubadora de 37 grados y 5% de CO2. Después de 24 h, cambie la solución, deseche las células no adherentes y continúe cultivando para usar en experimentos posteriores.
1.3 Determinación de la curva de crecimiento de hepatocitos de ratón en cultivo primario
Ajuste los hepatocitos purificados a 5 x 106 células/ml, inocúlelos en la placa de 24 pocillos y se inoculó 1 ml de suspensión celular en cada pocillo. Se inocularon un total de 21 pocillos y se cultivó medio de cultivo DMEM con alto contenido de azúcar que contenía suero bovino fetal al 10% (Sigma) durante 7 días. Haga 3 hoyos al azar todos los días, digiera y sople tripsina al 0,25% de manera uniforme, cuente en el tablero de conteo y dibuje la curva de crecimiento.
1.4 Establecimiento del modelo de lesión de hepatocitos alcohólicos.
Los hepatocitos logarítmicos obtenidos mediante el método anterior se inocularon en la placa de 96 pocillos pretratada con colágeno de cola de rata, y se inocularon 100 células en cada pocillo con 50 µl. El medio de cultivo DMEM con suero bovino fetal al 10% se cultivó durante 24 horas y luego se cambió por otras 24 horas. Se creó un grupo en blanco y cinco grupos de intervención con alcohol (50, 75, 100, 125, 150 mmol/L), y cada grupo se creó con cinco repeticiones. Después de cultivar los hepatocitos con diferentes concentraciones de alcohol durante 24 h, se añadió MTT al 0,5 % (Sigma) 20 a cada pocillo (μ 50 μL). Continúe cultivando durante 4 h, deseche el sobrenadante y agregue DMSO 150 a cada pocillo μ 50. Colóquelo en una mesa agitadora y mézclelo durante 15 minutos, mida el valor de absorbancia a 570 nm y calcule la tasa de supervivencia celular. Valor de la tasa de supervivencia celular del grupo de administración/grupo de control × 100%
1.5 Efecto de los glucósidos totales de Cistanche deserticola sobre la tasa de supervivencia de hepatocitos de cultivo primario
Herido por el alcohol. Inocular los hepatocitos obtenidos mediante los métodos anteriores en la placa de 96 pocillos pretratada con colágeno de cola de rata e inocular cada pocillo con 100 l o 50 l. El medio de cultivo DMEM con suero bovino fetal al 10% se cultivó durante 24 horas y luego se cambió. Después de otras 24 horas, se agregaron al grupo de administración GC con una concentración final de 0,2, 0,4 y 0,8 g/l, respectivamente. El grupo del modelo de etanol y el grupo en blanco continuaron cultivando sin agregar fármacos, y cada grupo se configuró con cinco pocillos múltiples. Después de 24 horas, al grupo modelo y al grupo de intervención de GC se les añadió alcohol con una concentración final de 100 mmol/L, respectivamente. Después de 12 horas de cultivo, se midió la tasa de supervivencia celular mediante el método MTT.
1.6 Efecto de los glucósidos totales de Cistanche deserticola sobre la morfología de hepatocitos de cultivo primario y núcleos lesionados por el alcohol
Coloque el cubreobjetos preesterilizado en una placa de 6 pocillos con la concentración de inoculación de 5 × 106 células/ml de suspensión celular, grupo modelo, grupo Cistanche deserticola (0,2, 0,4, 0,8 g/l) y el grupo en blanco. Después de 24 h de cultivo, agregue 100 mmol/L de alcohol hasta la concentración final. Después de 24 h de cultivo, saque el 95% de etanol del portaobjetos de vidrio y fíjelo durante 15 minutos. El PBS se lava dos veces y luego se redispersa en PBS. Ajuste la concentración celular a 5 × 104 células/ml, agregue 10 μl de naranja de acridina - mezcla de bromuro de etilideno (Sigma) (solución de naranja de acridina de 0,01 μg/ml, solución de prometazina de 0,02 μg/ml, relación de volumen de mezcla: 1/1), se incubó durante 30 minutos, se observó y se fotografió bajo el microscopio de fluorescencia.
1.7 Efecto de los glucósidos totales de Cistanche deserticola sobre la apoptosis de hepatocitos de cultivo primario lesionados por el alcohol
Ajustar la densidad de la suspensión de células digeridas a 5 × 106 células/ml, inocular en una placa de seis pocillos y cultivar durante 24 horas. Configure el grupo modelo, el grupo cistanche deserticola (0,2, 0,4, 0,8 g/L) y el grupo en blanco. Después de 24 horas de cultivo, agregue alcohol con una concentración final de 100 mmol/L, incube durante 24 horas, digiera y recoja las células, lávelas con PBS dos veces, fíjelas a 4 grados durante la noche con etanol preenfriado al 70%, lávelas con solución de PBS dos veces, agregue enzima de ARN (Sigma), PI (100 μ G/mL) (Sigma) y colóquelo en un baño de agua a 37 grados durante 30 minutos. La tasa de apoptosis se midió mediante citometría de flujo.
1.8 Los glucósidos totales de Cistanche deserticola pueden inhibir la apoptosis de hepatocitos de cultivo primario dañados por alcohol, bcl-2 y el gen proapoptótico c-fos
El efecto de la expresión de fos se tomó de tres placas de cultivo de seis pocillos, cada una de las cuales era un grupo de tres pocillos. Se crearon el grupo modelo, el grupo Cistanche deserticola (0,2, 0,4, 0,8 g/L) y el grupo en blanco. Se colocó un portaobjetos estéril en cada orificio. Se tomaron las células de la fase de crecimiento logarítmico y se usó digestión con tripsina para preparar la suspensión de células individuales, y la densidad celular se ajustó a 5 x 106/ml y se inoculó en una placa de 6 pocillos, 2 ml/pocillo. Después de 24 horas de cultivo, agregue alcohol con una concentración final de 100 mmol/L y continúe el cultivo durante 24 horas. Saque los portaobjetos llenos de células, lávelos con PBS dos veces y teñirlos con el método inmunohistoquímico ABC de rutina. Los breves pasos son los siguientes: fijarlos con paraformaldehído al 40% durante 10 minutos, sellarlos con suero normal de oveja durante 30 minutos, dejar caer y agregar el anticuerpo policlonal bcl-2 (Invitrogen) (1:75) o el anticuerpo policlonal c-fos (Invitrogen) (1:50), reaccionar a temperatura ambiente durante 1,5 horas, agregar el complejo ABC a temperatura ambiente durante 2 horas, colorear DAB y sellarlos con gelatina. La expresión de las proteínas Bcl-2 y c-fos se comparó mediante microscopía óptica y fotografía.
1.9 Procesamiento estadístico Los datos experimentales se procesaron con el software SPSS 13.5. Se expresa como media ± desviación estándar (x ± s) y se utiliza una prueba t para comparar entre grupos. PAG<0.05 indicates that the difference is statistically significant.
2 resultados
2.1 La curva de crecimiento de los hepatocitos de ratón de cultivo primario se muestra en la Figura 1. Se puede observar que el número de hepatocitos aumentó con el tiempo de incubación y entró en la fase de crecimiento logarítmico al cuarto día.
2.2 El efecto de diferentes concentraciones de alcohol en la tasa de supervivencia de hepatocitos de ratón en cultivo primario
Puede verse en la Tabla 1 que el alcohol tiene un fuerte efecto dañino sobre los hepatocitos cultivados primarios y el efecto depende de la dosis. Según las necesidades de la prueba, se utilizarán 100 mmol/L como concentración de trabajo en la prueba posterior y la tasa de supervivencia celular es del 43,40 %.
2.3 El efecto de los glucósidos totales de Cistanche deserticola sobre la tasa de supervivencia de hepatocitos de cultivo primario dañados por el alcohol
Puede verse en la Tabla 2. Después de una lesión por alcohol, la tasa de supervivencia de los hepatocitos se reduce significativamente. Los glucósidos totales de Cistanche deserticola pueden aumentar significativamente la tasa de supervivencia de los hepatocitos (P<0.05), and the effect is dose-dependent (P<0.05).
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2.4 Efecto de los glucósidos totales de Cistanche deserticola sobre la morfología de hepatocitos de cultivo primario y núcleos dañados por el alcohol.
El naranja de azidina muestra una fluorescencia verde después de entrar en las células, mientras que la prometazina sólo puede teñir las células necróticas con una membrana celular incompleta. Se encontró mediante observación (Fig. 2) que los hepatocitos en el grupo en blanco eran uniformemente verdes y no había tinción con rojo de bromo de las células necróticas (A); Después del tratamiento con alcohol, los hepatocitos se hicieron más pequeños y apareció una gran cantidad de células necróticas teñidas con rojo de bromo y células apoptóticas con concentración de cromatina en el núcleo (el núcleo era de color verde brillante) (B). Por tanto, se cree que el alcohol también puede provocar necrosis celular al tiempo que induce la apoptosis de los hepatocitos. Los GC pueden reducir significativamente la necrosis y la apoptosis, y el efecto se correlaciona positivamente con la dosis (C, D, E).
Fig. 2 Observación del efecto de los glucósidos totales de Cistanche deserticola sobre la morfología de núcleos de hígado cultivados primarios bajo un microscopio de fluorescencia (tinción de naranja de acridina, 400)
A: grupo en blanco; B: grupo modelo; C:0.2g/L-GC; D:0.4g/L-GC; E:0.8g/L-GC
2.5 El efecto de los glucósidos totales de cistanche deserticola sobre la apoptosis de hepatocitos de cultivo primario lesionados por el alcohol
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Como se puede observar en la Figura 3-B, la tasa de apoptosis de los hepatocitos después de una lesión por alcohol aumenta significativamente (34,7%), y los glucósidos totales de Cistanche deserticola pueden aumentar significativamente la tasa de supervivencia de los hepatocitos de una manera dependiente de la dosis, lo que es consistente con los resultados observados bajo el microscopio de fluorescencia.
Fig. 3 Efecto de los glucósidos totales de Cistanche deserticola sobre la apoptosis de hepatocitos de cultivo primario dañados por el alcohol
A: grupo en blanco; B: grupo modelo; C:0.2g/L-GC; D:0.4g/L-GC; E:0.8g/L-GC
Mediante inmunocitoquímica, se encontró que la expresión del factor inhibidor de la apoptosis bcl-2 disminuyó (4-B) y la expresión de c-fos aumentó (5-B) después de que el alcohol dañara las células hepáticas. Los glucósidos totales de Cistanche deserticola pueden mejorar significativamente la expresión de bcl-2 (4-C, D, E) e inhibir la expresión de c-fos (5-C, D, E). Los resultados se muestran en la Fig. 4-5.
Fig. 4 Efecto de los glucósidos totales de Cistanche deserticola sobre la expresión de bcl-2 en hepatocitos de cultivo primario dañados por el alcohol (400)
A: grupo en blanco; B: grupo modelo; C:0.2g/L-GC; D:0.4g/L-GC; E:0.8g/L-GC
Fig. 5 Efecto de los glucósidos totales de Cistanche deserticola sobre la expresión de c-fos en hepatocitos de cultivo primario dañados por el alcohol (400)
A: grupo en blanco; B: grupo modelo; C:0.2g/L-GC; D:0.4g/L-GC; E:0.8g/L-GC
3 Discusión
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Berry y cols. Estableció por primera vez el método de perfusión in situ mediante el uso de colagenasa para perfundir el hígado para obtener hepatocitos en condiciones fisiológicas, y luego fue desarrollado por Seglen et al. [4] para hacer más perfecta esta tecnología de perfusión de colagenasa. Este método tiene un alto rendimiento celular y una alta tasa de supervivencia. En este experimento, se obtuvieron hepatocitos primarios mediante perfusión in situ de hepatocitos de ratón y se cultivaron. El método fue estable y la actividad celular fue fuerte. Mediante la prueba de la curva de crecimiento se encontró que los hepatocitos primarios obtenidos entraron en la fase de crecimiento logarítmico después de 4 días.
El microanálisis colorimétrico MTT es un método sensible para detectar el crecimiento y la supervivencia celular con buena repetibilidad. La succinato deshidrogenasa en las mitocondrias de las células vivas puede reducir el MTT amarillo a cristales azul violeta, mientras que las células muertas no tienen esa función [5]. La actividad celular se puede reflejar midiendo la densidad óptica. En este experimento, se utilizó el método MTT para detectar que la tasa de supervivencia de los hepatocitos después de una lesión por alcohol se redujo significativamente, y los glucósidos totales de Cistanche deserticola podrían aumentar significativamente la tasa de supervivencia de los hepatocitos (P<0.05), and the effect was dose-dependent (P<0.05).
La apoptosis es una forma especial de muerte celular. Cuando las células sufren apoptosis, se producirán cambios morfológicos y bioquímicos especiales [6-8]. El experimento confirmó que la mayoría de los hepatocitos eran apoptóticos después del tratamiento con alcohol, y las células mostraron cambios morfológicos obvios, que fueron los siguientes: las células se hicieron más pequeñas, las microvellosidades de la superficie celular desaparecieron, la superficie celular se encogió, hubo vacuolas, condensación nuclear y formación de cuerpos apoptóticos; Se acompaña de necrosis. Después del tratamiento con glucósidos totales de Cistanche deserticola, la tasa de apoptosis disminuyó significativamente y la situación de necrosis también mejoró.
El gen bcl-2 es un protooncogén. En la actualidad, se han encontrado cinco familias de genes bcl-2 (bcl-2, bcl-2 x, bax, mcl-1 y A1), en las que bcl-2 puede inhibir la muerte celular programada (PCD). El trabajo del mecanismo puede incluir: (1) inhibir la liberación de Ca2+. Bcl-2 es una proteína transmembrana, que se encuentra principalmente en la membrana nuclear. Las membranas nucleares interna y externa están conectadas por la luz del retículo endoplásmico. Este último es el principal sitio de almacenamiento de Ca2+ intracelular, que juega un papel importante en el proceso de apoptosis celular. Utilizando métodos transgénicos, se encontró que la alta expresión de bcl-2 podría inhibir la liberación de Ca2+ del retículo endoplásmico, por lo que se especuló que el efecto inhibidor de bcl-2 sobre la apoptosis podría estar relacionado con el Ca2+ en el retículo endoplásmico [9]. (2) Bcl-2 desempeña un papel antiapoptótico al bloquear la transmisión de señales de genes proapoptóticos o al bloquear estos productos genéticos inducibles. Los estudios han demostrado que la proteína bcl-2 puede inhibir la apoptosis inducida por P53 y c-fos [10]. (3) Bcl-2 puede desempeñar un papel antiapoptótico al inhibir los radicales libres. Bcl-2 tiene la función de antioxidante, que puede inhibir la producción y acción del superóxido, inhibiendo así la aparición de apoptosis [11].
Los genes inmediatos tempranos (IEG) son genes que aparecen temprano y tienen una duración corta bajo diversos estímulos dañinos. c-fos es uno de los protooncogenes, ubicado en el cromosoma 14q21-q31. Es un ADN de 9 kb, compuesto por cuatro exones y tres intrones [12]. La transcripción básica es baja, pero puede ser desencadenada por diferentes moléculas de segundo mensajero para una expresión rápida y transitoria. El producto proteico de c-fos es FOS y la proteína codificada por el protooncogén c-Jun es JUN. FOS contiene una cremallera de leucina (LZ) [13]. FOS y JUN forman un heterodímero en el núcleo a través de la estructura LZ, llamado factor de transcripción AP-1, que se combina con el sitio AP-1 del gen diana y actúa como tercer mensajero del núcleo, permitiendo la expresión del gen diana durante mucho tiempo [14]. Morgan cree que las diferentes expresiones de c-fos indican la diversidad y complejidad de sus funciones. La expresión transitoria puede estar involucrada en la protección, reparación, remodelación y regeneración celular, mientras que la sobreexpresión sostenida está relacionada con daño secundario. El mecanismo de expresión de los dos es diferente. Por tanto, se puede considerar que los IEG como c-fos desempeñan un doble papel. Cuando el sistema de defensa reparador está completamente inhibido, participan en la apoptosis; Cuando no está inhibido, tiene un efecto protector sobre las células alrededor de la lesión y participa en el proceso de reparación y regeneración celular [15]. WebsterKR utiliza nucleótidos antisentido para reducir la transcripción de c-fos y prevenir la aparición de apoptosis, lo que indica que la sobreexpresión de c-fos está indisolublemente relacionada con la aparición y el desarrollo de diversas enfermedades [16].
En este experimento, después de que el alcohol dañara las células hepáticas, la expresión del factor inhibidor de la apoptosis bcl-2 se redujo significativamente y la expresión de c-fos aumentó, lo que sugiere que los glucósidos totales de Cistanche deserticola podrían proteger las células hepáticas al mejorar la expresión de bcl-2, inhibir la expresión de c-fos y reducir la lesión de las células hepáticas y la apoptosis.
