Clonación de genes, identificación funcional, análisis estructural y de expresión de sacarosa sintasa de Cistanche Tubulosa Ⅱ

Resultados y análisis

1 Minería de genes de sacarosa sintasa en Cistanche tubulosa y clonación del gen CtSus

Using the amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 as a template[16], the sequence was aligned in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data. They were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>parte aérea.

Cistanche Tubulosa de alta calidad para la salud masculina

Por lo tanto, los valores de FPKM del nivel de expresión de los dos genes candidatos de sacarosa sintasa obtenidos en la selección inicial en los datos del transcriptoma de diferentes partes de Cistanche tubulosa se normalizaron mediante Z-Score y se realizó un análisis diferencial (Figura 1A). Los resultados mostraron que el gen CtSus tuvo el nivel de expresión más alto en el haustorio, y el nivel de expresión en la parte subterránea fue mayor que en la parte aérea, lo que fue consistente con el patrón de acumulación de compuestos glucósidos en diferentes partes de Cistanche tubulosa. mientras que el nivel de expresión del gen CtSus1 en el haustorio fue bajo. Por lo tanto, basándose en los resultados anteriores, se seleccionó el gen CtSus para la posterior amplificación de secuencia, expresión exógena e identificación funcional. Utilizando el ADNc de Cistanche tubulosa como plantilla, se obtuvo un producto de banda única a ~2500 pb después de la amplificación por PCR (Figura 1B). El producto de la PCR se recuperó del gel y se ligó al vector de clonación, y la región codificante de longitud completa del gen diana se obtuvo mediante secuenciación. La longitud de la secuencia CtSus fue de 2418 pb.

Figura 1 Exploración genética y clonación de CtSus de C. tubulosa y análisis bioinformático de su proteína codificada. A: Niveles de expresión de los genes CtSus y CtSus1 en diferentes partes de C. tubulosa normalizados como puntuaciones Z en función de sus valores de FPKM; B: amplificación genética de CtSus; M: marcador de ADN; C: dominio conservador de la proteína CtSus predicho por SMART; D: Alineamiento de secuencias múltiples de CtSus y sacarosa sintasas identificadas de otras plantas, incluidas Arabidopsis thaliana, Solanumtuberosum y Albuca bracteata. El dominio de síntesis de sacarosa y el dominio de transferencia de azúcar están representados por cuadros rojos y azules, respectivamente; E: Análisis filogenético de CtSus y sacaroseintasas de otras plantas; F: Análisis SDS-PAGE de la expresión heteróloga de CtSus usando el vector pCold™ I en E. coli. Carril 1: marcador de proteína; Carril 2: fracción sobrenadante; Carril 3: Fracción de precipitado. La flecha roja muestra la proteína CtSus. G: PCR de colonias de un único clon que contiene ambos plásmidos recombinantes. M: marcador de ADN; 1: pET-28a-UGT71BD1; 2: pCold™ I-CtSus

Tabla 2 Similitudes en la secuencia de aminoácidos entre CtSus y sacarosa sintasas identificadas en otras plantas

2.3 Análisis filogenético

El árbol filogenético construido por el software MEGA se utilizó para analizar la relación filogenética entre la sacarosa sintasa CtSus de Cistanche tubulosa y otras sacarosa sintasas derivadas de plantas. Los resultados se muestran en la Figura 1E. Las sacarosa sintasas de origen vegetal muestran distintas ramas evolutivas en dicotiledóneas (regiones I y II) y monocotiledóneas (región III). CtSus está en la rama dicotiledónea, y las secuencias que están más estrechamente relacionadas con CtSus son todas de plantas Lamiaceae (Cistanche tubulosa es una planta Lamiaceae Orobanchaceae), mientras que la otra rama está compuesta principalmente por plantas Solanales, lo que indica aún más la alta conservación y Homología de genes de sacarosa sintasa derivados de plantas en la evolución de plantas en el mismo orden. Entre ellos, la sacarosa sintasa PrSus (AEN79500.1) de Phelipanche ramosa de la planta Orobanchaceae está más estrechamente relacionada con CtSus.

3 Expresión exógena y análisis de actividad de CtSus.

3.1 Expresión exógena del gen CtSus Los plásmidos pET-28a-CtSus, pET-24b-CtSus y pCold™ I-CtSus verificados mediante secuenciación se transfirieron a la expresión competente E. coli Transetta (DE3), y los clones positivos se examinaron mediante PCR de colonias para verificación de secuenciación. Las cepas de expresión recombinante obtenidas se indujeron mediante IPTG a baja temperatura para la expresión de proteínas, las bacterias se recogieron mediante centrifugación y se añadió el tampón de lisis para romper las bacterias para obtener el sobrenadante y el precipitado, y se realizó SDS-PAGE para la detección. Los resultados mostraron que cuando se usaron pET-28a y pET-24b como vectores de expresión, CtSus no se expresó en E. coli, mientras que cuando se usó pCold™ I como vector de expresión, se obtuvo un CtSus claro. Se detectó una banda de proteína recombinante en la región de ~ 100 kDa, lo que era consistente con su masa molecular relativa teóricamente predicha de 92,2 kDa (Figura 1F).

3.2 Transformación de células completas

Para verificar preliminarmente la función catalítica de CtSus, se construyó una cepa de coexpresión de CtSus y el gen de la glicosiltransferasa UGT71BD1. UGT71BD1 fue clonado e identificado a partir de Cistanche tubulosa y es una UDP-glucosiltransferasa que puede aceptar ampliamente compuestos aromáticos como glucósidos feniletanoides, diferentes tipos de flavonoides, estilbeno y cumarina como receptores y catalizar la reacción de glucosilación del grupo hidroxilo fenólico del sustrato utilizando UDP-glucosa. como donante de azúcar [18]. En teoría, la introducción de CtSus puede proporcionar más UDP-glucosa donante de glicosilo suficiente para la reacción de glucosilación catalizada por UGT71BD1, promoviendo así el equilibrio de la reacción para avanzar hacia la formación de productos de glicosilación, aumentando así el rendimiento de productos de glicosilación. El plásmido pCold™ I-CtSus y el plásmido pET-28a-UGT71BD1 se transformaron simultáneamente en la expresión competente E. coli Transetta (DE3). Se examinaron clones individuales que contenían ambos plásmidos recombinantes mediante PCR de colonias y se obtuvieron cepas de expresión recombinante positivas mediante verificación de secuenciación (Figura 1G). La coexpresión del gen dual se indujo in vitro y la cepa de expresión del gen único pET-28aUGT71BD1 se utilizó como grupo de control. La actividad de CtSus para catalizar la generación de donante de glucosa UDP se verificó preliminarmente mediante transformación de células completas. Los resultados de HPLC y espectrometría de masas de alta resolución mostraron que cuando se llevó a cabo la reacción de transformación de células completas con aconitina 1 y resveratrol 2 como sustratos, se detectó la generación de productos de glicosilación obvios después de 24 horas de transformación, como se muestra en la Figura 2.

Figura 2 Biotransformación de células completas del sustrato 1 o 2 mediante una cepa recombinante que alberga UGT71BD1 o una cepa recombinante que alberga un acoplamiento de UGT71BD1 con CtSus, respectivamente. A: cromatogramas de HPLC de la biotransformación de células completas del sustrato 1. La longitud de onda de detección fue de 360 ​​nm; B: espectros HRESI-MS y MS2 del producto 1a; C: cromatogramas de HPLC de la biotransformación de células completas del sustrato 2; La longitud de onda de detección fue de 330 nm. D: espectros HRESI-MS de los productos 2a y 2b

Cuando 1 (m/z 179.034 4 [M+H]+, fórmula molecular C9H6O4) se usó como sustrato, el pico cromatográfico del producto 1a (m/z 341.087 2 [M+H]+, fórmula molecular prevista C15H16O9) se detectó a 5,39 min, lo que fue consistente con la radiación UV. Absorción del sustrato y del producto de control. Al mismo tiempo, se detectó un pico de fragmento de m/z 179.033 4 [M+H]+ en el espectro MS2 de 1a, que se produjo cuando 1a perdió una molécula de glucosa (162 Da), lo que indica que 1a era el producto del sustrato 1 conectado a una molécula de glucosa. La tasa de conversión se calculó integrando el área del pico. Se encontró que la tasa de conversión de células enteras UGT71BD1 que catalizaban el sustrato 1 para generar el producto glicosilado 1a era del 71,87 %, mientras que la adición de CtSus aumentaba la tasa de conversión de la reacción al 95,84 %, 1,3 veces la del grupo de control. Cuando el sustrato era el compuesto 2 (m/z 227.072 5 [MH]-, fórmula molecular C14H12O3), el pico cromatográfico del producto 2a (m/z 389.123 4 [MH]-, peso molecular predicho fórmula C20H22O8) y 2b (m/z 575.175 9 [M+Na]+, fórmula molecular prevista C26H32O13) consistentes con la absorción UV característica del sustrato y el producto de control se detectaron a 10,32 y 6,52 min, respectivamente . Se detectó un pico de fragmento en 3 [MH]-, que se generó por la pérdida de una molécula de glucosa (162 Da), lo que indica que 2a era el producto del sustrato 2 conectado a una molécula de glucosa. Al comparar con los datos de la literatura [18] y la información de predicción de espectrometría de masas, se determinó que el producto 2b era el producto del sustrato 2 conectado a dos moléculas de glucosa. La tasa de conversión se calculó utilizando el área del pico integrado. Se encontró que la adición de CtSus podría aumentar la tasa de conversión de la reacción de glicosilación del sustrato 2 del 64,01% al 78,51%, entre los cuales el rendimiento del producto monosacárido 2a aumentó del 45,09% al 63,58%, y el rendimiento del producto disacárido 2b. pasó del 18,92% al 14,93%.

3.3 Purificación de la proteína recombinante CtSus e identificación de la actividad enzimática in vitro

Los resultados del experimento de transformación de células completas sugieren que CtSus tiene la actividad de catalizar la producción de UDP-glucosa donante de glucosa activa. Para verificar más directamente esta actividad catalítica mediante una reacción catalítica enzimática in vitro, la proteína de fusión del gen CtSus en el sistema de expresión pCold™ se separó y purificó mediante cromatografía de afinidad. Los resultados mostraron que cuando se usó pCold™ I como vector de expresión, la proteína recombinante se expresó en grandes cantidades, pero principalmente en el precipitado. Cuando se utilizó pCold™ TF como vector de expresión, el gen CtSus se expresó en grandes cantidades en E. coli (Figura 3A). La proteína de fusión se purificó mediante cromatografía de afinidad HisTrap FF y se sometió a una reacción catalítica enzimática in vitro. Los resultados se muestran en la Figura 3B. Cuando se utilizaron sacarosa y UDP como sustratos, en comparación con el grupo de control negativo, se detectó un nuevo pico de producto a los 10,32 min. Su tiempo de retención y absorción de UV fueron consistentes con la UDP-glucosa. En comparación con el estándar se demostró que el producto era UDP-glucosa. Sin embargo, dado que la proteína de fusión expresada por el vector de expresión pCold™ TF contiene una etiqueta soluble de factor desencadenante grande (el tamaño de la proteína de la etiqueta es de 48 kDa), tendrá un gran impacto en la actividad catalítica de la proteína. Por lo tanto, la enzima Factor Xa cortó aún más la etiqueta de la proteína de fusión y se purificó la proteína CtSus sin etiquetas exógenas (Figura 3A). La proteína se sometió a catálisis enzimática in vitro y los resultados mostraron que el rendimiento de UDP-glucosa aumentó del 3,53% al 10,66%.

(Figura 3B). Los resultados anteriores confirmaron la actividad de CtSus para catalizar la producción de UDP-glucosa mediante catálisis enzimática in vitro, y también mostraron que la presencia de una etiqueta de afinidad grande favorece la expresión soluble de CtSus, pero también afectará significativamente la Actividad catalítica in vitro de la enzima.

Figura 3 Expresión heteróloga e identificación funcional de CtSus. A: Análisis SDS-PAGE de proteínas CtSus. Carril 1: marcador de proteína; Carril 2: CtSus recombinante con factor desencadenante; Carril 3: Escisión de la etiqueta del factor desencadenante utilizando la proteasa del factor Xa para dar la proteína CtSus marcada con la flecha roja. B: Ensayos enzimáticos in vitro que utilizan proteína de fusión y proteínas CtSus sin factor desencadenante para catalizar la síntesis de UDP-glucosa en presencia de sacarosa y UDP, respectivamente, con UDP-glucosa estándar de referencia. Se utilizó proteína hervida como grupo de control en las mismas condiciones. La longitud de onda de detección fue de 260 nm.