Supresión del daño renal asociado a la inflamación después del trasplante usando el nuevo eliminador de radicales libres PrC-210 en ratas
Mar 18, 2022
Torsten R. Goesch 1, Nancy A. Wilson2, Weifeng Zeng2, Bret M. Verhoven2, Weixiong Zhong2,Maya M. Coumbe Gitter3y William E. Fahl1,3,*
Resumen:
aloinjertoriñóntrasplante, que desencadena el rechazo del huésped mediado por células y anticuerposriñón, es uno de los principales contribuyentes al daño renal durante el trasplante. Aquí, preguntamos si PRC-210 suprimiría el daño observado en los trasplantes de riñón con aloinjerto. Se perfundieron riñones de rata Brown Norway (BN) in situ (solución UW) con o sin PrC-210 30 mM añadido y luego se trasplantaron inmediatamente a ratas Lewis (LEW). 20 h más tarde, se analizaron los riñones BN trasplantados y el plasma LEWrat.Riñónse midieron la histología y los niveles renales/séricos de varias citocinas asociadas a la inflamación para evaluar la patología renal relacionada con la falta de compatibilidad y la eficacia protectora de PrC-210. Veinte horas después de los trasplantes de aloinjerto: (i) se observaron daños histológicos significativos en los túbulos renales e infiltración de células inflamatorias mononucleares en los riñones de aloinjerto; (ii)riñónlas métricas de función (creatinina y BUN) estaban significativamente elevadas; (iii) se observaron cambios significativos en citocinas clave, es decir, TIMP-1, TNF-alfa y MIP-3A/CCL20, y niveles de caspasa activada por riñón. En riñones tratados con PRC-210-y ratas receptoras, (i) el daño histológico renal (puntuaciones de Banff) y la infiltración mononuclear se redujeron a niveles de fondo no tratados; (ii) la creatinina y el BUN se redujeron significativamente; y (iii) los cambios de caspasa y citocina activadas se redujeron significativamente, algunos a un segundo plano. En conclusión, los resultados sugieren que PrC-210 podría proporcionar una protección de órganos ampliamente aplicable para muchas condiciones de trasplante de aloinjerto; podría proteger los riñones trasplantados durante y después de todas las etapas del proceso de trasplante, desde la donación de órganos hasta el transporte, la reimplantación y la inflamación posoperatoria, para minimizar el rechazo agudo y crónico.
Koyewords: riñónaloinjerto; rechazo renal; isquemia
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1. Introducción
La insuficiencia renal terminal causa más de 1,2 millones de muertes al año en todo el mundo [1].Riñónel trasplante es el tratamiento preferido para los pacientes con enfermedad renal en etapa terminal. Cada año se realizan más de 90000 trasplantes de riñón en todo el mundo.
El proceso de trasplante, en sí mismo, induce una lesión significativa de órganos y células en elriñón, lo que reduce la supervivencia a largo plazo del órgano. Los tres daños principales a un riñón durante un trasplante de aloinjerto son (i) daño inducido por especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS y RNS) durante la isquemia fría ("almacenamiento en frío") [2], (ii) daño inducido por ROS tras el implante ('lesión por reperfusión') [3], y (iii) inflamación posterior al trasplante de aloinjerto, que desencadena la respuesta inmunitaria innata y el rechazo mediado por anticuerpos (ABMR) [4].
Los neutrófilos y los macrófagos migran al trasplante dañado dentro de las 6 h posteriores a la reperfusión y estimulan la síntesis de quimiocinas en las células dendríticas residentes que luego activan los linfocitos T y reclutan células inmunitarias adaptativas. Una vez que estas células inmunitarias se infiltran en las células epiteliales del túbulo proximal, producen mieloperoxidasa en los neutrófilos y nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) oxidasa en los macrófagos, los cuales contribuyen a la producción local de radicales libres. Estos procesos inflamatorios conducen a una activación de la vía del complemento y una mayor remodelación celular y lisis en elriñónaloinjerto [5]. La ABMR puede ocurrir como resultado de aloanticuerpos preformados contra el injerto, o de ambos, o mediante el desarrollo de novo de anticuerpos específicos del donante (dnDSA) [5–7]. La respuesta inflamatoria aguda (min/días), en transición a crónica (días/semanas), dentro del riñón del aloinjerto, con producción continua de ROS y citocinas inflamatorias, puede establecer una respuesta grave que se autoperpetúa y causariñónFalla de organo.
Para comprender mejor las vías celulares y moleculares involucradas en la patogenia deriñóninflamación y rechazo del aloinjerto, desarrollamos y caracterizamos un modelo de rata que replica la mayoría de los criterios clínicos de la respuesta inmune innata, ABMR y pérdida de órganos renales [8]. Este modelo se ha utilizado para evaluar una serie de nuevas estrategias de trasplante post-aloinjerto.
Los dos enfoques actualmente reconocidos para reducir la respuesta inmune aguda y a largo plazo contra elriñónaloinjerto son: (i) aumentar la probabilidad de encontrar un donante compatible y (ii) eliminar los anticuerpos preexistentes contra elriñónaloinjerto utilizando protocolos de desensibilización [9,10].
En el trabajo descrito en este manuscrito, preguntamos si sería beneficioso un tercer enfoque para suprimir la gravedad de la inflamación aguda y a largo plazo. Administramos el eliminador de radicales libres de acción inmediata, PRC-210, tanto al aloinjerto implantadoriñónya la rata receptora, para determinar si se podía suprimir el daño por ROS asociado a la inflamación. Aunque el concepto de suprimir la ROSin asociada a la inflamaciónriñóntrasplante no es nuevo, el uso aquí del nuevo PRC-210 ROSscavenger de acción inmediata sí lo es. Eliminación e inactivación tanto inmediata como crónica de la inflamación que genera y genera radicales libres dentro del aloinjerto recién trasplantadoriñónwould significantly enhance the existing strategies to suppress allograft rejection and would provide another pathway to reduce post-transplant kidney cell damage, and with it, suppress Delayed Graft Function to improve survival of the kidney allograft.PRC-210 is a new small-molecule, aminothiol, free radical scavenger [11]; it has no measurable nausea/emesis nor hypotension side effects [12]. Unlike traditional antioxidants that act indirectly over hours to days via NrF-2 to activate the expression of protective genes [13], PRC-210 directly scavenges ROS to confer 100% protection in seconds [11]. PRC- 210 was the most potent of the 13 commonly studied "antioxidants" screened in an assay that scored the ability of molecules to prevent x-ray-induced damage to naked DNA; the majority of the tested "antioxidants" showed no protection [14,15]. In a related essay, the addition of PrC-210 30 s before a 60 s pulse of •OH to naked DNA provided complete protection against the •OH insult that induced >95 por ciento de daño en el ADN en controles sin protección [16]. En dos estudios previos de trasplante de riñón en roedores [16,17], se demostró que PRC-210 suprime el daño renal inducido por ROS inducido durante (i) 30 h de almacenamiento en frío [17] y (ii) lesión por reperfusión tras el implante [16 ] a niveles de fondo, eliminando así dos fuentes sustanciales de daño a los riñones trasplantados. También se ha demostrado que la molécula PRC-210 suprime la lesión inducida por radicales libres en varios otros órganos [15,18]. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que PrC-210 también debería ser capaz de proteger un aloinjerto contra el estrés oxidativo generado por AMBOS (i) procesos de rechazo mediados por células y (ii) por anticuerpos que producen radicales libres como subproducto.
Para explorar esta hipótesis, desarrollamos un nuevo modelo de rata que evitó la inducción de eventos isquémicos y de reperfusión importantes y administró PrC-210 tanto antes como después de la implantación. Se lavaron riñones de ratas marrones con una solución UW que contenía PrC-210 y se trasplantaron inmediatamente a receptores de ratas Lewis singénicas. El tiempo de isquemia fría fue virtualmente eliminado. Inmediatamente al implante siguiente, y durante las 8 h siguientesriñónimplante, las ratas receptoras recibieron inyecciones sistémicas de PrC-210 en dosis que permitirían la eliminación continua de radicales libres dentro del trasplanteriñón. Luego, los riñones y el plasma sanguíneo trasplantados se recolectaron 20 h después del trasplante para permitir la medición de la PrC-210-conferida (i) la supresión de los subproductos inflamatorios y (ii)riñónproteccion.
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2. Materiales y métodos
2.1. animales
Se compraron ratas macho Lewis y BN adultas (200–250 g) de Envigo (Indian-napolis, IN, EE. UU.) y se alojaron en las instalaciones de cuidado de animales de la Universidad de Wisconsin en Madison, WI, EE. UU. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las Políticas de uso y cuidado de animales de la Universidad de Wisconsin. El personal de cuidado de los animales realizó diariamente el mantenimiento de la salud de los animales, incluidas las muertes de los animales, la temperatura ambiente, los ciclos de luz/oscuridad de 12 horas y la limpieza de las jaulas, entre otras tareas de saneamiento. Comida y agua estaban disponibles a voluntad. Esta investigación fue aprobada prospectivamente por la Escuela de Medicina y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Salud Pública de la Universidad de Wisconsin (Protocolo Animal #M005204). Todos los grupos contenían de 4 a 6 animales.
2.2. Materiales
La síntesis del PrC-210 HCl aminotiol, una molécula preclínica, se describió por separado [19,20]. Los cristales de PrC-210HCl (3-(metilamino)-2-(metilmonometil)propano-1-tiol) se almacenan en una atmósfera de nitrógeno a −20 ◦C, e incluso con la rutina descongelación, uso y re-almacenamiento, PrC-210 cristalina es completamente estable por más de 4 años por análisis de espectrometría de masas. Otros reactivos químicos se obtuvieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). La solución de preservación de órganos UW se adquirió de Bridge to Life, Columbia, SC, EE. UU.
2.3. Procedimiento Quirúrgico y Experimental
El procedimiento de trasplante utilizado en estos experimentos se muestra en la Figura 1. En la rata donante BN, después de la doble ligadura de la aorta, la ligadura de la arteria y la vena renales derechas y la sección quirúrgica de la vena renal izquierda, la rata izquierdariñónse perfundió in situ usando 5 ml de solución UW a temperatura ambiente (durante un período de 15 s). El perfundido era solución UW sola (para los grupos "0 h" y "20 h Sin tratamiento"), o solución UW a la que se le aplicó PrC cristalina-210, para lograr 30 mM [17], se había agregado, disuelto inmediatamente y luego se ajustó el pH al pH inicial de la solución UW de 7,4 mediante la adición de 0,0619 µl de NaOH 5N por µmol de sal PrC-210 HCL (FW: 220). La vida media del tiol PrC-210 (forma activa) es de aproximadamente 3,5 h en soluciones de pH fisiológico como la solución UW y sangre humana [14]. Después de la perfusión in situ, el BN izquierdoriñónse extirpó quirúrgicamente y luego se suturó mediante anastomosis roma de los vasos y el uréter en el sitio del riñón izquierdo desocupado de la rata receptora LEW. El derecho LEWriñónfue ligado y removido inmediatamente antes. Cinco minutos después del cierre quirúrgico de la rata LEW, la rata recibió una dosis sistémica de PrC{{0}} (121 ug de PrC-210 HCl por g de peso corporal, lo que equivale a 0.24 X dosis máxima tolerada) por inyección intraperitoneal. Como se muestra en el esquema de la Figura 1, la rata también recibió dosis de inyección intraperitoneal de PrC-210 (0,24 MTD) más de 4 h y más de 8 h después del trasplante. Las ratas se sacrificaron más de 20 h después del trasplante, yriñonesy se recogieron muestras de plasma para su análisis. Había un mínimo de cinco ratas en cada grupo de tratamiento.
2.4. Mediciones séricas de BUN y creatinina
El BUN y la creatinina se midieron en muestras de suero utilizando la tecnología Catalyst One Analyzer (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, EE. UU.).
2.5. Ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas
Los ensayos se realizaron como se describe en los protocolos del kit ELISA (Rat TIMP-1, Cat# RTM- 100; Rat MIP3-A, Cat# DY540; Rat TNF-alpha, Cat# RTA{ {5}}; R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.). Brevemente, se agregaron diluciones de plasma de rata a placas precubiertas, se incubaron durante 2 h a 37 О C. Luego se agregó el anticuerpo conjugado con biotina específico para la proteína analizada y se incubó durante 1 h a 37 О C, se lavó, se conjugó con avidina. Se añadió peroxidasa de rábano picante, seguido de lavado y adición de sustrato TMB. La reacción se incubó durante 10 a 30 min, se detuvo con ácido sulfúrico y se leyó a 450 nm.
2.6. Matriz de citocinas de rata perfiladora de proteomas
Los ensayos se realizaron esencialmente como se describe en el protocolo del producto. Brevemente, el plasma se incubó con membranas de nitrocelulosa manchadas con anticuerpos de captura y control. Después de la incubación, las membranas se lavaron y se incubaron con estreptavidina HRP. En una desviación del protocolo, utilizamos SuperSignal West Femto (ThermoFisher, Madison, WI, EE. UU.; Cat# 34094) para la detección quimioluminiscente, ya que dio una señal más fuerte. Las transferencias se visualizaron en un sistema de documentación en gel FotoDyne.
2.7. Histología
Fijado en formalina (10 por ciento de formalina), incluido en parafina,riñonesse cortaron en secciones de 5 um. Los portaobjetos se desparafinizaron, se rehidrataron desde xileno a través de una serie graduada de etanol hasta agua y, posteriormente, se trataron como se describe a continuación. Los portaobjetos se escanearon con un objetivo 20- en un escáner de portaobjetos de patología digital Aperio. Todos los portaobjetos de H&E fueron revisados por el Dr. Weixiong Zhong, MD, PhD, patólogo de trasplantes y puntuados para PTC, glomerulitis (g), vasculitis (v)/arteritis de la íntima, inflamación intersticial (I) y tinción C4d, según Banff 2009 [21].
Por separado, a los portaobjetos se les asignó un número ciego y se tomaron imágenes digitales no superpuestas de los túbulos renales en la interfaz entre la médula y la corteza de cada portaobjetos H/E. Se tuvo cuidado de no incluir lúmenes de vasos grandes y glomérulos. Cuantificación automatizada de píxeles rojos y azules en cada 10-riñónla imagen se realizó utilizando una macro personalizada escrita en el software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html
consultado el 13 de abril de 2021). Los píxeles rojos reflejaban el grosor del túbulo proximal, incluido el borde en cepillo. Los núcleos se cuantificaron en el canal azul. La proporción de píxeles nucleares azules a túbulos rojos proporcionó una puntuación de infiltración inflamatoria para la infiltración de glóbulos blancos en el postrasplante.riñones. Las puntuaciones se promediaron y trazaron utilizando Graphpad Prism.
2.8. Actividad de la enzima caspasa activada
Actividad de caspasa 3 y 7 activada enriñónlos sobrenadantes homogeneizados se determinaron utilizando el sustrato fluorescente Apo-ONE (Promega, Madison, WI, EE. UU.) [16]. Brevemente, descongeladoriñonesse mezclaron con 8-veces en exceso de tampón de lisis que contenía Na HEPES 50 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, DTT 10 mM, glicerol al 10 % y se homogeneizaron a 4 О C durante 30 s con un homogeneizador de tejidos Omni . El homogeneizado de riñón se centrifugó a 4°C (16,000- g) en una microcentrífuga Eppendorf durante 20 min. Se analizó inmediatamente la actividad de caspasa y el contenido de proteínas de los sobrenadantes mediante el método de Bradford utilizando albúmina de suero bovino como estándar. El ensayo de caspasa activada se realizó de la siguiente manera: se diluyeron 5 ul del sobrenadante (~40 ug de proteína del sobrenadante) hasta un volumen total de 50 ul con el tampón de lisis anterior, se mezcló con 50 ul del sustrato Apo-ONE sin diluir en el pocillo de una placa negra opaca de 96 pocillos para iniciar la reacción de 60 min. Las placas se agitaron a 200 rpm a 37 °C durante 60 min. La escisión del péptido sustrato de caspasa DEVD se midió utilizando un lector de placas fluorescentes BMG Clariostar a una longitud de onda de excitación de 499 nm y una longitud de onda de emisión de 521 nm. Se incluyó un estándar de caspasa en cada experimento.
2.9. Mitocondrias de Riñón de Rata
La fracción mitocondrial purificada se preparó a partir de ratas homogeneizadas.riñonespor una técnica de centrifugación estándar [22]. Las mitocondrias purificadas se suspendieron en 0tampón Tris HCl 15 M, pH 7,4.
Para determinar si la adición de PrC exógena{{0}} suprime la fragmentación del ADN mitocondrial inducida por ROS [22], en un volumen de reacción de 25 uL (en un tubo PCR), añadimos: 1{{29} } uL de mitocondrias purificadas, 5 uL de dilución de PrC-210 o agua (se agregó PrC-210 10 min antes del generador de Fe más más más ADP más H2O2 ●OH) y 10 uL que contenían FeCl2 (2,5 mM; FW:127), sal sódica de adenosina 5'-difosfato (10 mM; FW: 427) y H2O2 (0,003 por ciento de concentración final). Después de 20 min a 37 ºC, se mezclaron 10 ul de la reacción con 5 ul de colorante de carga de gel 6- que contenía SDS al 0,3 por ciento; los tubos se colocaron en agua a 60 ºC durante 1 minuto, luego se cargaron 10 ul en un pocillo de un gel TAE de agarosa al 1 por ciento, y después de 60 minutos a 60 voltios, los geles se tiñeron y fotografiaron. Se realizaron un mínimo de tres repeticiones para cada punto de ensayo para permitir la comparación estadística.
2.10. Análisis estadístico
Los datos se expresan como la media más /一 STD. Se usaron pruebas t de Student para determinar la diferencia estadística y los valores de p usando el software GraphPad Prism 7.03. Los valores de p inferiores a 0,05 se consideraron significativos.
3. Resultados
3.1. PrC-210 Supresión de la patología del aloinjerto de riñón
A las 20 h postrasplante, la histología del BN trasplantadoriñones(Figura 2A-D) tratada con solución UW sola mostró claramente un aumento en las puntuaciones de Banff para tubulitis y capilaritis peritubular (flechas rojas y amarillas); las puntuaciones de patología sumadas se muestran en el panel E. BNriñonesperfundido con PrC{{0}}que contiene solución UW y recibió dosis sistémicas intraperitoneales posteriores al implante de PrC-210 (Figura 2D) mostró una patología inflamatoria claramente suprimida en el riñón y puntuaciones de Banff suprimidas para tubulitis y peritubular. capilaritis igual a las puntuaciones de Banff del grupo BN de control "0 h" (Figura 2E). La administración de PrC-210 confirió reducciones significativas en los marcadores de daño renal de creatina (p=0.032) y BUN (p=0.046).
3.2. Niveles de Caspasa Activada en Riñones Post-Trasplante
Niveles de caspasa activada en BNriñónlos homogeneizados se redujeron significativamente en el aloinjerto BNriñonesque no estuvieron expuestos al tratamiento con PrC{{0}} durante las 20 h posteriores al trasplante (Figura 5). La perfusión de riñones BN con solución UW que contiene PrC-210-y el trasplante en ratas Lewis que recibieron dosis sistémicas de PrC-210 dio como resultado la misma actividad de caspasa activada que la observada en los riñones de control "0 h".
3.3. Niveles de citoquinas inflamatorias después del aloinjerto de riñón BN
En los experimentos de cribado,riñónsobrenadante homogeneizado de 0 h controles y 20 h Sin tratamientoriñonesfueron examinados con la matriz de citoquinas Proteome Profiler 29 para detectar niveles de expresión de citoquinas y quimioquinas alterados, asociados con la inflamación, 20 h después del trasplante. Como se muestra en las dos inserciones de microarrays de la Figura 6, se observaron cambios en TIMP-1, TNF-alfa y MIP-3a/CCL20. A continuación, se usaron placas ELISA individuales para cuantificar estos cambios en homogeneizados de riñón y sueros, que ahora también incluyen ratas tratadas con PrC-210. Los niveles de TIMP-1 y TNF-alfa aumentaron 20 h después del trasplante y, en ambos casos, sus niveles disminuyeron en presencia de PrC-210 (Figura 6A-C). Los niveles de MIP-3a/CCL20 aumentaron a las 20 h, pero aumentaron significativamente más en las ratas tratadas con PrC-210-(Figura 6D).
3.4. PrC-210 Protección de mitocondrias de riñón de rata
Función mitocondrial sostenida durante y despuésriñónse requiere un trasplante para la supervivencia del órgano trasplantado. Las ROS generadas durante la isquemia asociada al trasplante, la isquemia-reperfusión y la inflamación posterior al implante pueden afectar el rendimiento y la supervivencia de las mitocondrias renales. Debido a la importante función mitocondrial, aislamos mitocondrias de riñones de rata y determinamos si PrC-210 en concentraciones farmacológicas alcanzables podría proteger estos orgánulos de un ataque de ROS.
En la Figura 7, rata purificadariñónlas mitocondrias se incubaron con un generador de ●OH [23]. Después de la breve reacción, vimos una fragmentación significativa de ROS del ADN mitocondrial de riñón de rata. Después del insulto de ROS, se solubilizó una alícuota de las mitocondrias en un tampón de carga de gel que contenía SDS, y el ADN mitocondrial se separó y se "dimensionó" mediante cromatografía en gel de agarosa (Figura 7). El insulto de ROS redujo claramente el tamaño medio del ADN mitocondrial de riñón de rata (carril b), y la adición de PrC-210 a las mitocondrias evitó la rotura del ADN (carriles c–g) en un PrC-210 forma dependiente de la concentración.
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4. Discusión
aloinjertoriñónEl trasplante, que desencadena el rechazo innato del riñón mediado por células y anticuerpos del huésped, es un importante contribuyente a corto y largo plazo.riñóndaño durante el trasplante, y la función retardada del injerto asociada se observa en hasta el 50 por ciento de los riñones trasplantados. Realizamos este estudio para determinar si PrC-210 sería eficaz para suprimir la gravedad del daño inducido después de un trasplante de riñón de aloinjerto en un modelo de rata que elimina en gran medida el tiempo de isquemia del trasplante y su estrés oxidativo asociado. Nuestra suposición fue que este enfoque debería permitirnos ver el impacto de PrC-210 en el insulto de inflamación posterior al trasplante con una mínima interferencia de isquemia.
El aumento de TNF-alfa y la infiltración mononuclear sustancial demuestran que el trasplante de riñón con aloinjerto induce una inflamación aguda pronunciada en las 20 horas posteriores al trasplante, y esto se correlacionó con el daño de las células tubulares renales observado en el trasplante.riñónhistología (puntuaciones de Banff). El TNF-alfa es producido principalmente por macrófagos activados y es una proteína de señalización celular involucrada en la inflamación aguda. Está estrechamente asociado con la patogenia del rechazo agudo y crónico del aloinjerto [24].
En contraste con los hallazgos anteriores en BN no tratadariñones, PrC-210 administrado como parte de la solución UW y administrado sistémicamente en ratas después del trasplante redujo tanto el nivel de TNF-alfa como la infiltración renal por células mononucleares, que son signos de reducción de la inflamación aguda. PrC-210 redujo el daño renal como se ve en las puntuaciones histológicas de lesión renal (puntuaciones de Banff) a niveles de fondo no tratados y redujo los niveles de las puntuaciones funcionales de la patología renal, la creatinina y el BUN.
La inflamación en riñones BN no tratados se asoció con un aumento tanto en TIMP-1 como en MIP-3A/CCL20. En comparación, vimos que el tratamiento PrC-210 redujo significativamente el nivel de TIMP-1 y aumentó significativamente el nivel de MIP-3A/CCL20.
El inhibidor tisular de la metaloproteinasa-1 (TIMP-1) es un importante regulador de la síntesis y degradación de la matriz extracelular (MEC). La acumulación excesiva de ECM es el principal mecanismo patológico del desarrollo de fibrosis durante y después de una lesión renal aguda. Esencialmente no hay expresión de TIMP-1 en normalriñóntejido [25], una observación que se corrobora en nuestra Figura 6A, B, pero se sabe que TIMP-1 se expresa en riñones lesionados, principalmente en células epiteliales tubulares renales, membrana basal tubular renal y el citoplasma de intersticial células. El aumento de la expresión de TIMP-1 se correlacionó positivamente con el deterioro simultáneo de la función renal [26]. Las ratas tratadas con PrC-210 mostraron una profunda reducción en los niveles de TIMP-1 (p=0.001), tanto en homogeneizado de riñón como en plasma; esto implica que PrC-210 ejerce un fuerte efecto protector contra la reorganización inducida por el trasplante de la matriz extracelular renal.
La quimiocina MIP-3a/CCL20 activa el receptor CCR6, que se expresa especialmente en las células T reguladoras (Tregs). CCL20 se expresa en células intersticiales y endoteliales tubulares y también se regula positivamente en riñones con lesión renal aguda. La vía CCL20-CCR6 juega un papel vital en el reclutamiento de células T mediado por Treg en el riñón, y se ha descrito que las Treg tienen un papel positivo enriñónreparación, tolerancia al trasplante y supervivencia renal. Tanto el bloqueo de anticuerpos de la vía CCL20-CCR6, así como el uso de ratones deficientes en CCR6-en casos agudosriñónSe demostró que los experimentos con lesiones aumentan la gravedad de la insuficiencia renal y la mortalidad [27]. Esto sugiere que, clínicamente, la mejora de la vía CCL20-CCR6 y la activación de Treg pueden ser una posible ruta terapéutica para limitar el estrés agudo y crónico.riñónlesión [28]. En nuestro estudio (Figura 6D), el nivel de MIP-3a/CCL20 fue significativamente mayor en las ratas tratadas con PrC-210-que en las ratas no tratadas. Especulamos que esta es una de las razones de (i) el reclutamiento significativamente menor de células mononucleares en los riñones (Figura 3C) y (ii) el daño renal significativamente reducido (Figura 2) en las ratas tratadas con PrC-210- .
La función mitocondrial renal normal y, lo que es más importante, las agresiones a ella durante el almacenamiento del riñón, el implante y las etapas de inflamación posteriores al implante son determinantes significativos de la lesión por ROS y la insuficiencia renal durante el trasplante. Por lo tanto, fue significativo que se demostró que PrC-210 confería una supresión completa de la fragmentación del ADN mitocondrial (Figura 7) a concentraciones (2–4 mM) que se habían logrado en el plasma de ratones y ratas que recibieron administración intraperitoneal o intraperitoneal. dosis sistémicas orales 0.5 MTD de PrC-210 que fueron toleradas sin toxicidades detectables [29].
En nuestros estudios anteriores relacionados con el trasplante de riñón [16,17], observamos aumentos sustanciales en la caspasa activada en riñones expuestos a lesiones por "isquemia fría" e "isquemia-reperfusión". Estas agresiones a los riñones inducidas por isquemia se redujeron a un segundo plano mediante el tratamiento con PrC-210 (Figura 8). En los estudios de este manuscrito (Figura 5), en los que la isquemia fría y la isquemia-reperfusión se eliminaron esencialmente mediante trasplante inmediato, no hubo aumento de la caspasa activada en los riñones trasplantados. Más bien, la caspasa activada se redujo significativamente a más de 20 h en los controles "sin tratamiento farmacológico", y el tratamiento con PrC-210 eliminó por completo esta reducción de caspasa en ratas de más de 20 h y mantuvo estable el nivel de caspasa. Nuestra interpretación de estos resultados interesantes es que, en ausencia de cualquier daño significativo de radicales libres inducido por isquemia a través de ROS y RNS en el postrasplanteriñones, no hay marcadores asociados de muerte celular y apoptosis como las caspasas activadas. Más bien, en estos trasplantes de riñón de aloinjerto, las señales inflamatorias de las citocinas y quimiocinas recién expresadas ahora regulan el metabolismo celular, lo que incluye influir en la vía de la apoptosis. La literatura describe que la sobreexpresión de TIMP-1 conduce a la supresión de la apoptosis [26]. Nuestros resultados de caspasa (Figura 5) respaldan este efecto TIMP-1 descrito e implican que TIMP-1 es importante para regular la fisiopatología del daño celular después del trasplante de aloinjerto renal. En corroboración de la supresión anterior de PrC-210 de la expresión TIMP-1 (Figura 6A, B), el tratamiento con PrC-210 eliminó por completo el cambio de caspasa, manteniendo los niveles de caspasa en el mismo nivel observado en los riñones de control "0 h". Debido a que los niveles reducidos de PrC-210 TIMP-1 en suero a más de 20 h (Figura 6B) reflejan con precisión la supresión significativa del aloinjerto: (i) apoptosis (Figura 5), (ii) patología histológica (Figuras 2 y 3) y (iii) infiltración de células inflamatorias (Figura 3), esperamos que monitorear los niveles séricos de TIMP-1 en receptores de aloinjertos de riñón humano sea una forma lógica de monitorear la eficacia clínica de PrC-210 en futuros ensayos clínicos .
En nuestro trabajo hasta la fecha [16,17], hemos demostrado que PrC-210 es capaz de proteger los riñones trasplantados contra las agresiones de isquemia por frío e isquemia-reperfusión. En este estudio, ahora vemos que PrC-210 también protege los riñones de aloinjerto de los insultos inflamatorios no isquémicos que ocurren después del implante renal. PrC-210 reduce significativamente los niveles de citocinas inflamatorias agudas, como TNF-alfa, y suprime la expresión de la quimiocina TIMP-1. Se esperaría que ambos eventos, y potencialmente respaldados por la expresión adicional de CCL20: (i) reduzcan el daño renal del aloinjerto, (ii) supriman el reclutamiento de células T en el riñón y (iii) supriman la activación de la función innata y sistema inmunológico adaptativo. En la Figura 8, resumimos estos hallazgos para respaldar el papel que creemos que PrC- 210 puede desempeñar en el trasplante de riñón humano; suprime: (i) el daño de las especies reactivas de oxígeno (ROS) y las especies reactivas de nitrógeno (RNS) de la isquemia fría al fondo [17],
(ii) daño por ROS de isquemia-reperfusión en el fondo [16], y (iii) daño por inflamación del aloinjerto sustancialmente, en algunos casos, en el fondo. Dado que el principal mecanismo de acción de PrC-210 para PrC-210 es la eliminación de radicales libres de oxígeno y nitrógeno, esto implica que estos radicales libres contribuyen de manera importante al daño renal observado en condiciones no isquémicas, es decir, la inflamación asociada al aloinjerto estudiada en este manuscrito.
En resumen, esto sugiere que PrC-210 podría proporcionar una protección de órganos ampliamente aplicable para muchas condiciones de trasplante de aloinjerto; podría proteger los riñones trasplantados durante y después de todas las etapas del proceso de trasplante, desde la donación de órganos hasta el transporte, la reimplantación y la inflamación posoperatoria, para minimizar el rechazo agudo y crónico.
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Contribuciones de autor:NAW, WZ (Weifeng Zeng), WZ (Weixiong Zhong), BMV y MMCG participaron en la realización de la investigación y análisis de datos; TRG y NAW participaron en el diseño de la investigación y el análisis de datos; WEF y TRG participaron en el diseño de la investigación, la realización de la investigación, el análisis de datos y la redacción del artículo. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.
Fondos:Esta investigación fue financiada por el Instituto de Investigación Clínica y Traslacional de la UW y la subvención UL1TR002373 a la UW ICTR de NIH/NCATS, la Sociedad Estadounidense de Cirujanos de Trasplantes (133 AAA1552), el Colegio Estadounidense de Cirujanos (133 AAB2176) y el apoyo de la subvención a WEF (# R03CA176799).
Declaración de la Junta de Revisión Institucional: Esta investigación fue aprobada prospectivamente por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina y Salud Pública de la Universidad de Wisconsin (Protocolo Animal #M005204).
Declaración de disponibilidad de datos:Los datos del estudio están completamente disponibles en este manuscrito. Conflictos de interés: Los autores declaran no tener ningún conflicto de interés.
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