La inhibición local sostenida de la trombina conserva la microarquitectura y la función renales después del inicio de la lesión renal aguda

Contacto: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Ian Vargas et al.

Resumen

Lesión renal aguda(AKI) el manejo sigue siendo principalmente de apoyo, ya que ningún agente terapéutico específico dirigido a vías de señalización singulares ha tenido éxito en los ensayos clínicos. Aquí, informamos que la inhibición de la coagulación impulsada por la trombina y la señalización inflamatoria con el uso de nanopartículas de perfluorocarbono dirigidas a la trombina (PFC NP) que actúan localmente protege la vasculatura renal y modula ampliamente diversos procesos inflamatorios que causan lesiones renales por isquemia-reperfusión. Cada PFC NP se complejó con ~ 13 650 copias del inhibidor directo de trombina, PPACK (prolina-fenilalanina-arginina-clorometil-cetona). Los ratones tratados después de la aparición de AKI con PPACK PFC NP exhibieron VCAM-1, ICAM-1, PGD2 prostanoide, M-CSF, IL-6 y mastocitos regulados a la baja. La arquitectura microvascular, las membranas basales tubulares y los componentes del borde en cepillo estaban mejor conservados. La falta de reperfusión se redujo según lo indicado por la reducción de la captura de glóbulos rojos y el hierro no hemo.Riñónla función y la necrosis tubular mejoraron a las 24 horas en comparación con el grupo de control no tratado, lo que sugiere un beneficio para la inhibición dual de la trombosis y la inflamación por PPACK PFC NP.

Palabras clave: Lesión renal aguda; Trombosis; Inflamación; nanopartículas de perfluorocarbono; Daño a la embarcación

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Lesión renal aguda(AKI) es un problema clínico frecuente en jóvenes y ancianos por igual con una incidencia creciente y una tasa de mortalidad inaceptablemente alta que no ha mejorado sustancialmente en décadas.1,2 El síndrome se desarrolla típicamente después de una caída transitoria repentina en el flujo sanguíneo total o regional a lariñóncomo consecuencia de una serie de insultos que incluyen hipotensión, sepsis, toxinas, etc.3 AKI evoca una panoplia compleja de jugadores moleculares fisiopatológicos y eventos de señalización en un proceso de enfermedad que evoluciona con el tiempo en etapas.3–6 Médico selectivo y específico dirigido molecularmente Todavía no existen terapias para la LRA, a pesar de la necesidad médica apremiante.7 De hecho, después de años de esfuerzos de investigación preclínica y clínica, los tratamientos actuales siguen siendo esencialmente de apoyo.

Aquí postulamos que las intervenciones terapéuticas basadas en nanopartículas dirigidas a la trombina que pueden mantener la integridad microvascular y la función de barrera y, al mismo tiempo, reducir la señalización inflamatoria beneficiarán los resultados de AKI. La trombina es una molécula aterogénica y cicatrizante principal que impulsa muchas otras moléculas inflamatorias que participan en la activación endotelial después de una lesión, como NF-κB,8 NADPH oxidasa,⁹

y otros a través de receptores activados por proteasa (PAR-1) tanto en el endotelio como en los macrófagos.10,11 Todos los tipos de células en elriñónexperimentó cambios en el patrón de expresión génica, que incluyen una mayor expresión de marcadores de lesión y genes del desarrollo, como lo demostraron Rudman-Melnick et al. en un estudio de secuenciación de células individuales en el curso del tiempo sobre isquemia-reperfusión unilateralriñónAdemás, un estudio en roedores de la secuenciación del ARN de un solo núcleo en la lesión renal bilateral por isquemia-reperfusión13 identificó una población específica de células del túbulo proximal que sobreexpresa genes de proinflamación y profibróticos después de una lesión por isquemia-reperfusión caliente. Estos resultados indican que la inflamación debería representar un objetivo terapéutico útil. Aunque la formación de coágulos intravasculares sólidos parece poco común en la LRA, también planteamos la hipótesis de que la mitigación de la actividad procoagulante microvascular a través de potentes antagonistas de nanopartículas antitrombina de acción local14–17 podría mejorar el flujo sanguíneo, reducir el "falta de reflujo" y atenuar la señalización inflamatoria para preservar función renal.

Los problemas críticos que se oponen a la aplicación de inhibidores directos de la trombina para prevenir la lesión renal por isquemia-reperfusión (IRI) incluyen sus posibles efectos secundarios tóxicos y el riesgo de hemorragia sistémica. En cuanto a la trombosis, la terapéutica anticoagulante convencional no ha tenido especial éxito, aunque la trombomodulina soluble puede ejercer acciones renoprotectoras18,19, ya que puede activar la proteína C20,21 y la antitrombina III22, aunque con posibles complicaciones de sangrado excesivo21. Además, tanto la warfarina como la dabigatrán se ha asociado con toxicidad renal.^23,24Sin embargo, el hecho de que estos enfoques anticoagulantes aún no hayan tenido éxito clínico no disminuye el valor potencial de la trombina como diana, debido a sus funciones duales tanto en la coagulación como en la inflamación. Aunque no hay ningún estudio clínico sobre el tratamiento con VEGF para la LRA, un estudio preclínico ha demostrado que VEGF es un mediador importante en la renoprotección durante la LRA,25 lo que respalda aún más nuestro mecanismo terapéutico hipotético propuesto de preservación de los vasos renales para proteger la función renal durante la LRA.

Hemos desarrollado una plataforma de nanopartículas de perfluorocarbono (PFC NP) estable, biocompatible y no nefrotóxica que inhibe la actividad de la proteasa de la trombina sin causar una diátesis hemorrágica. núcleo y una capa exterior de fosfolípido-surfactante y cuyo diámetro varía desde ~160-250 nm. En estudios preliminares recientes de AKI, administramos antitrombina PFC NP como pretratamiento para confirmar que la trombina es un objetivo valioso para acelerar la recuperación de la función renal en parte al preservar la integridad microvascular y reducir la no reperfusión en IRI cuando se administra antes de la isquemia-reperfusión. lesión.16 Las NPS antitrombina PFC también protegen los aloinjertos renales de la IRI y exhiben una marcada reducción en el porcentaje de necrosis tubular parenquimatosa asociada con una mayor longevidad del riñón después del trasplante.27 Sin embargo, no está claro si esta nanopartícula antitrombosis sigue siendo efectiva. después del inicio de la LRA, que representa un conjunto completamente diferente de poblaciones de pacientes.

En consecuencia, en el presente trabajo, buscamos extender el uso de este enfoque a AKI establecido después de IRI para dilucidar su potencial para la traducción clínica. Como prueba de concepto, empleamos PPACK (Phe[D]-Pro-Arg-clorometilcetona) como fracción de antitrombina para la conjugación con PFC NP, que hemos demostrado que previene la señalización de trombina y la trombosis microvascular en modelos de aterosclerosis y lesión renal aguda ( AKI).14-17 El propio PPACK es un inhibidor directo e irreversible de la trombina bien conocido, cuya forma libre es eliminada demasiado rápido por el riñón para ser de valor como agente terapéutico.14,15 Aquí aclaramos las respuestas fisiopatológicas tempranas a Terapia PPACK PFC NP que limita los eventos de señalización inflamatoria tanto en el riñón como sistémicamente, preserva la microarquitectura renal y atenúa el daño vascular. Estos datos implican que este enfoque terapéutico basado en nanopartículas para la LRA en curso podría sentar las bases para el desarrollo clínico de un agente antitrombina que ejerce efectos pleiotrópicos limitados localmente y puede administrarse de forma segura en las primeras fases de la LRA.

Métodos

formulación de nanopartículas

Las nanopartículas de perfluorocarbono se formularon como se describió anteriormente.14 Brevemente, una mezcla lipídica de 98,5 mol por ciento de huevo L- - fosfatidilcolina y 1,5 mol por ciento de 1,2-diestearoil snglicero- 3-fosfoetanolamina-N-[ carboxi(polietilenglicol)-2000] (sal de sodio) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) se preparó en cloroformo:metanol (3:1), antes de secarse para formar una película lipídica al vacío. La película lipídica (2 por ciento (peso/vol)) se combinó luego con PFOB (20 por ciento (vol/vol)) (Exfluor Research Corp.) (glicerina 1,7 por ciento (peso/vol)) (Sigma, St. Louis, MO ) y agua MilliQ, antes de emulsionarse (Microfluidics Inc) en hielo durante 4 minutos a 20,000 psi. Para funcionalizar la nanopartícula con conjugación PPACK, utilizamos el método de acoplamiento Amine-carboxyl. Las nanopartículas (1 ml) se mezclaron primero con 2 mg de EDCI 1-[3-(Dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida metiodida (Sigma, St. Louis, MO) durante 1 hora , antes de agregar 12,5 mg de PPACK (BACHEM, Torrance, CA) en un agitador orbital a temperatura ambiente durante la noche. Se realizó diálisis con un límite de peso molecular de 3000-5000 g/mol (Fisher Scientific, Waltham, MA) para eliminar el exceso de EDCI y PPACK. El método de formulación detallado se incluyó en Materiales complementarios.

El modelo de lesión renal aguda

Los ratones C57BL/6 adultos (n=22) se sometieron a isquemia-reperfusión renal tibia bilateral para inducir una lesión renal aguda. Los animales se anestesiaron con un cóctel de ketamina (85 mg/kg) y xilazina (13 mg/kg) antes de someterse a una laparotomía para producir 17 minutos de isquemia caliente. Se introdujo una incisión abdominal en la línea media para exponer tanto la arteria como la vena renal. Se indujo isquemia renal mediante pinzas oclusivas tanto en la arteria como en la vena para restringir el flujo de sangre al riñón. El cese exitoso del flujo sanguíneo renal se confirmó visualmente por un cambio en el color del riñón de rosa a púrpura oscuro. La temperatura corporal de los ratones se mantuvo a 37 grados mediante el uso de un sistema de calentamiento de animales pequeños. Las pinzas se soltaron después de 17 minutos para permitir restaurar el flujo sanguíneo renal, lo que se confirmó por el cambio del color del riñón a rosa. A continuación, la herida quirúrgica se cerró en capas y los animales se controlaron y se devolvieron a la jaula después de moverse libremente. Después de la reperfusión durante 2 horas, una sola dosis de PPACK

PFC NP ({{0}}0,5 ml/kg de PFC NP; 0,05 mg/kg de PPACK) o PFC NP simple (control) se administró por vía intravenosa mediante inyección en la vena de la cola. Dado que nuestro estudio anterior demostró que una sola dosis preventiva de PPACK PFC NP exhibió efectos protectores renales, aquí aplicamos un tratamiento de dosis única después del inicio de AKI para evaluar su efecto protector renal. Los procedimientos y protocolos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad del Sur de Florida.

Recolección y conservación de tejidos 24 horas después de la administración de nanopartículas, se sacrificó a los ratones y se extrajeron los riñones para su análisis. Antes de la extracción del riñón para las evaluaciones histológicas y moleculares, se recolectó sangre a través de una punción cardíaca para el análisis de suero aguas abajo, y luego cada ratón se perfundió sistémicamente con solución salina normal (n.° de catálogo: 23-535435, Fisher Scientific, Waltham, MA) hasta que quedó residual. la sangre se eliminó de los riñones. Para recolectar el suero, se coaguló sangre completa a temperatura ambiente durante 30 minutos, antes de centrifugarla a 2000 ×g durante 10 minutos a 4 grados. El suero recolectado se almacenó a -80 grados antes de las evaluaciones de citoquinas y nitrógeno ureico en sangre. Para el análisis histológico, los riñones extirpados se fijaron en formalina al 10 por ciento, antes del procesamiento del tejido, la inclusión en parafina y el corte. Para las evaluaciones de eicosanoides, los riñones extirpados se diseccionaron aún más para separar la corteza y la médula, antes de congelarse rápidamente en nitrógeno líquido y almacenarse a -80 grados para su análisis.

Histología

Los métodos detallados de tinción histológica y análisis de datos se incluyeron en los Materiales complementarios. Los portaobjetos se desparafinaron y rehidrataron antes de la tinción con hematoxilina y eosina, tinción con ácido peryódico de Schiff (PAS) (Cat#: ab150680, Abcam, Cambridge, MA), tinción con hierro azul de Prusia, tinción inmunohistoquímica para visualizar CD31, VCAM-1, y expresión de ICAM-1, y tinción de eosinófilos de células cebadas (Cat#: 150665, Abcam, Cambridge, MA). Los datos de tinción de control de isotipo IgG de conejo se presentan en las Figuras complementarias 2 y 3 para demostrar la especificidad de los resultados de tinción inmunohistoquímica. Todas las imágenes microscópicas se adquirieron con los mismos ajustes de potencia y parámetros de digitalización. Las evaluaciones microscópicas se realizaron con un microscopio de campo brillante Olympus equipado con una cámara digital DP27 para registrar imágenes de secciones patológicas con un aumento de 20x o 40x. Se realizó un análisis de datos doble ciego en todas las imágenes.

Nitrógeno ureico en sangre (BUN)

Las mediciones de BUN se realizaron con un kit de detección colorimétrica de nitrógeno ureico (BUN) (Cat#: K024-H5, Arbor Assays, Ann Arbor, MI) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Preparación y análisis de eicosanoides

Los eicosanoides se extrajeron mediante un proceso de extracción modificado y se analizaron mediante UPLC ESI-MS/MS como se describió anteriormente.28 Los métodos detallados utilizados para este estudio se incluyeron en Materiales complementarios.

Evaluación de citocinas séricas

Se adquirió una matriz de citoquinas personalizada de R&D Systems (Minneapolis, MN) y se evaluó con Luminex 200 (Northbrook, IL) siguiendo las instrucciones del manual del usuario.

Estadísticas

Los resultados se expresan como media ± error estándar de la media (SEM). El análisis estadístico para cada experimento se resume en la Tabla complementaria 1. Se utilizó la prueba t bilateral o ANOVA unidireccional con la prueba de Scheffe. Se realizaron análisis de correlación para pares seleccionados de métricas para calcular un valor r de Pearson. La significación estadística de las diferencias se atribuyó a P <>

Resultados

El tratamiento PPACK PFC NP mejora la función renal tras la aparición deLesión renal aguda.

El examen microscópico del aspecto general de los riñones 24 horas después del tratamiento con antitrombina (PPACK) PFC NP posterior a la reperfusión indicó una mejora del daño en la LRA establecida (Figura 1, AB). La lesión a las 24 horas se localizó predominantemente en la unión corticomedular del riñón y los túbulos proximales se dañaron preferentemente. El patrón de lesión fue el de necrosis de tipo coagulativo. Hubo un infiltrado inflamatorio menor en el punto de tiempo 24-hrs. La cuantificación del daño tubular en secciones teñidas con H&E (Figura 1, C) reveló que los ratones tratados con PPACK PFC NP manifestaron una reducción general del 33,95 % en la necrosis tubular aguda (ATN) frente a los ratones tratados con control NP (24,44 ± 1,76 % frente a 37).{{ 16}} ± 4,96 por ciento respectivamente, P=0,035). La Figura 1, D muestra que los ratones que recibieron tratamiento manifestaron una reducción del 44,03 % en el BUN a las 24 horas (110,96 ± 6,21 mg/dL frente a 62,10 ± 8,71 mg/dL para el control NP frente a PPACK PFC NP; P=0,0002) . Estos primeros resultados beneficiosos reflejan la protección que observamos previamente con los regímenes de antitrombina previos al tratamiento a las 24 horas,16 lo que sugiere que la trombina sigue desempeñando un papel fundamental en la evolución de la LRA más allá del insulto isquémico inicial.

La Figura 2 ilustra las respuestas regionales de la membrana basal y las estructuras del borde en cepillo al tratamiento con antitrombina en base a la semicuantificación de la tinción con PAS. La Figura 2, AC muestra que el tratamiento mejoró el porcentaje de glomérulos con membranas basales intactas del 51,43 % ± 2,61 % al 70,00 % ± 3,09 % (P=0,00033). La Figura 2, DF ilustra el daño más profundo sufrido por los bordes de arbustos tubulares donde solo una minoría retuvo los bordes de arbustos completamente intactos a las 24 horas. Sin embargo, el tratamiento mejoró la integridad del borde del cepillo en un 50,79 por ciento (P=0,015). El tratamiento redujo la extensión general de los agregados de proteínas en un 54,09 por ciento (P=0,032) (Figura 2, GI), lo que podría esperarse que prevenga la congestión tubular para mantener la función renal.

El tratamiento PPACK PFC NP conservó la integridad vascular tras la aparición de IRI

Para cuantificar el potencial de PPACK PFC NP para proteger elementos vasculares, se tiñeron secciones de riñón para CD31.

La Figura 3 ilustra la mayor prevalencia de la tinción de CD31 a las 24 horas en la corteza y la médula de los ratones tratados con PPACK NP frente al control NP (Figura 3, A y D frente a B y E). En las regiones corticales, la tinción de CD31 comprendía el 4,28 % ± 0,62 % de los animales tratados frente al 1,75 % ± 0,34 % de los animales de control (P=0.0{{ 25}}18), o un aumento relativo del 144,57 por ciento (Figura 3, C). En las regiones medulares, la tinción de CD31 comprendía el 3,24 % ± 0,38 % para los animales tratados con PPACK NP frente al 1,91 % ± 0,29 % para los animales tratados con NP de control (P=0,0073), o un aumento relativo del 88,81 % (Figura 3, F) . La evaluación microscópica de la integridad vascular no reveló necrosis arteriolar apreciable en el punto de tiempo de 24- horas.

La apariencia de los glóbulos rojos (RBC) en las imágenes microscópicas difirió entre los ratones tratados con PPACK NP y el control NP a las 24 horas (Figura 4). Debido a que los ratones recibieron perfusión sistémica para lavar la sangre en territorios renales perfundibles, la presencia de glóbulos rojos indicó agregación dentro de conductos microvasculares mal perfundidos o extravasación intersticial, o posiblemente ambas. En los glomérulos (Figura 4, AB), se observaron glóbulos rojos dentro de los mechones vasculares, pero rara vez en la cápsula de Bowman a las 24 horas. El tratamiento redujo la prevalencia de glóbulos rojos glomerulares en un 40,78 por ciento (P=0,007) (Figura 3, C). En la médula (Figura 4, DE), no fue posible asignar una ubicación definitiva para los glóbulos rojos en función de las tinciones con H&E, pero el tratamiento redujo la prevalencia general de glóbulos rojos en un 34,92 % (P=00,049) (Figura 4, F) .

Para delinear aún más las consecuencias de la deposición y atrapamiento de glóbulos rojos, se realizó una tinción con hierro no hemo con azul de Prusia. Las tinciones de hierro fueron positivas tanto en estructuras celulares glomerulares como tubulares. El tratamiento redujo la prevalencia de hierro tanto en la corteza (reducción del 44,23 %; P=0,022) (Figura 5, AC) como en la médula (reducción del 50,50 %; P=0,006) (Figura 5, DF ) a las 24 h, en consonancia con el efecto del tratamiento con antitrombina en la captura de glóbulos rojos.

El tratamiento PPACK PFC NP redujo la inflamación local y sistémica tras la aparición de LRA

Para dilucidar el papel de la trombina en el mantenimiento de la activación endotelial y la inflamación local en el riñón, cuantificamos ICAM-1 y VCAM-1. La expresión de VCAM-1 en la corteza no cambió con el tratamiento con PPACK (Figura 6, AC). Sin embargo, la expresión de VCAM- 1 en la médula se reguló sustancialmente en un 65,25 por ciento (P=0,011) después del tratamiento (Figura 6, DF). Se observó una expresión mejorada de ICAM endotelial-1 tanto en la corteza como en la médula en los ratones tratados con NP de control (Figura 7, B y E). ICAM-1 fue regulado a la baja por el tratamiento en un 36,89 por ciento (P=0,0083) en la corteza (Figura 7, AC) y en un 31,17 por ciento (P=0,030) en la médula (Figura 7 , DF).

Para delinear el papel de la trombina en la regulación de los lípidos bioactivos inflamatorios en la evolución temprana de AKI, realizamos ensayos lipidómicos en tejidos extraídos por separado de la corteza y la médula a las 24 h. Las tablas complementarias 2 y 3 enumeran los ensayos moleculares específicos, la región renal y los tipos de sujetos (IRA tratada, LRA no tratada o normal sin LRA). La Tabla complementaria 4 enumera el cambio porcentual promedio desde la línea de base normal saludable para cada lípido en la corteza y la médula. En general, tanto las regiones corticales como las medulares manifestaron una expresión desviada de casi todos los lípidos bioactivos evaluados en comparación con los riñones normales (Tablas complementarias 2 y 3), y casi todos los lípidos de señalización tendieron a cambiar hacia niveles normales después de la terapia con antitrombina. Como métrica simplificada para la inflamación regional (Tabla complementaria 4), el cambio porcentual promedio para todos los lípidos fue 65,13 % y 38,60 % para la corteza y 136,42 % y 90,76 % para la médula en los grupos de control NP y PPACK NP respectivamente, lo que indica que la inflamación en la médula superó a la de la corteza según los ensayos lipidómicos.

Aunque las tendencias de resolución fueron evidentes después del tratamiento para casi todas las especies de lípidos, la mayoría no alcanzó significación estadística. Sin embargo, en estos ensayos fue notable la respuesta significativa de PDG2, que disminuyó un 47,62 % en la corteza (Figura 8, A) (P=0,012) y un 50,21 % en la médula (Figura 8, B) ( P=0.0249), respectivamente. Con base en esta observación, cuantificamos la prevalencia de mastocitos infiltrantes, que son una fuente importante conocida de PGD2 inflamatoria. La Figura 8, CE indica que el tratamiento con antitrombina redujo el contenido de mastocitos en la sección de riñón completo en un 54,27 por ciento (P=0,002) a las 24 horas. Esto concuerda con las reducciones observadas en VCAM-1 e ICAM-1 (Figuras 6 y 7) como mastocitos activados que expresan LFA-1 (antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos) y VLA (muy tardío antígeno) ligan las moléculas de adhesión específicas del tejido para la transmigración a los tejidos inflamados.29,30 Además, las quimiocinas/citocinas asociadas a los mastocitos, como M-CSF e IL-6, se regularon a la baja concomitantemente por nanopartículas de antitrombina. Después del tratamiento con PPACK NP, el M-CSF sérico y la IL-6 se redujeron en un 36,60 % (P=00,0448) y 27,44 % (P=00,0454), respectivamente, en comparación con el grupo de control no tratado (Figura 8, F).

Varias correlaciones interesantes surgieron del conjunto de datos relacionados con la infiltración de mastocitos, el daño vascular y la función renal para los grupos combinados totales de animales tratados y no tratados en las regiones de la corteza y la médula. Hubo una relación indirecta entre BUN y CD31 (r=0.75, P=0.000009), lo que indica que el empeoramiento de la insuficiencia renal se asoció con un mayor compromiso vascular (Figura complementaria 1, A). Existía una relación directa entre el número de mastocitos y BUN (r=0.71, P=0.004), lo que indica una disminución progresiva

de la función renal en asociación con la infiltración de mastocitos (Figura complementaria 1, B). Se observó una relación indirecta entre el número de mastocitos y CD31 (r=0.59, P=0.002), lo que indica que el daño vascular empeoró con el aumento de la infiltración de mastocitos (Figura complementaria 1, C). Finalmente, se observó una relación directa entre el número de mastocitos y la expresión global de ICAM-1 (r=0.54, P=0.008), consistente con la expectativa de que las moléculas de adhesión vascular reguladas al alza promover la localización de los mastocitos en los tejidos lesionados (Figura complementaria 1, D). Una relación directa aún más cercana se refería a la expresión de VCAM medular y los recuentos de mastocitos (r=0.69, P=0.009; datos no mostrados).

Discusión

A pesar de décadas de esfuerzos en la búsqueda de una gestión eficaz deLesión renal aguda, current treatments remain essentially supportive. Failure of single agents tested in numerous AKI clinical trials now prompts a renewed search for agents that might exert more pleiotropic or broad-spectrum therapeutic actions for preserving renal function.3–7 The present data indicate that targeting thrombin with locally acting nanoparticle agents represents one such approach to accelerating functional recovery, preserving vascular and tubular integrity, and modulating inflammation. The exceptional local potency of PPACK PFC NP against thrombin with normal bleeding times and clotting parameters by 30-60 min after injection14,15 is due to the fact that each nanoparticle situates >104 restos de antitrombina en sitios de trombosis microvascular y activación de PAR-1 (descripción adicional en Materiales complementarios), una estrategia de amplificación que no se puede lograr mediante la estequiometría 1:1 de agentes libres convencionales que inhiben la trombina, incluido PPACK.

El presente conjunto de datos muestra que la lesión aguda por isquemia-reperfusión renal no está completa 2 horas después de la reperfusión y la trombina sigue siendo un objetivo de alto valor en los tejidos dañados después de la reperfusión. Los esfuerzos anteriores de los asociados de Molitoris y otros respaldan el esfuerzo continuo para diseñar métodos seguros para inhibir directamente la trombina en AKI.^18,31–33A partir de nuestro trabajo previo en el tratamiento previo de AKI con PPACK PFC NP, sabemos que las nanopartículas de antitrombina brindan una vigilancia sostenida contra la trombina activada localmente que mantiene la integridad vascular, atenuando notablemente el fenómeno de falta de reflujo en ~50 por ciento y revierte rápidamente la disfunción renal en 24 hrs.16 Tomados junto con los datos actuales, está claro que las nanopartículas de antitrombina continúan ganando acceso a los tejidos renales dañados pero viables mucho después de la reperfusión para prevenir daños vasculares y tubulares adicionales. Los informes anteriores de que los ratones knockout para PAR-1 sufren una lesión renal por isquemia-reperfusión reducida también concuerdan con nuestra estrategia de inhibición farmacológica fuerte y persistente de la activación de PAR-1 en AKI a través de la inhibición de la trombina.³⁴

La protección de las estructuras vasculares renales (Figura 3), el borde en cepillo y la membrana basal (Figura 2) proporcionada por la antitrombina PFC NP, de acuerdo con nuestros datos previos que muestran que la terapia con antitrombina provoca una mejora de 2 veces en la perfusión en las regiones corticomedulares en AKI,16 confirma un beneficio emergente de mejorar la microangiopatía renal. Aunque la naturaleza exacta del daño a los capilares y vénulas peritubulares no se ha dilucidado por completo en estos puntos de tiempo tempranos después de la reperfusión, se describen el aumento de la permeabilidad de los vasos y la activación de la caspasa proapoptótica endotelial-3, así como la disminución de la señal para CD31 (PECAM),35 que regula la integridad de la unión endotelial.36 La síntesis y expresión de CD31 en las uniones celulares están reguladas a la baja por citoquinas inflamatorias que se expresan por mastocitos activados (TNF- e IFN-), que mejoran la permeabilidad vascular.^37,38Además, la inducción del factor tisular por la trombina a través de la activación de PAR-1 está regulada por CD31, y los ratones knockout para CD31 muestran un aumento de la apoptosis epitelial y endotelial tubular, un aumento del depósito de fibrina y la expresión del factor tisular.³⁹En consecuencia, la capacidad de PPACK PFC NP para preservar la expresión de CD31 puede ser vital para limitar la activación en curso de la cascada de coagulación y para mantener la integridad endotelial.

Existe un nexo local entre la inflamación y la coagulación en la fase de extensión de la LRA que restringe la perfusión de los capilares medulares externos provocando isquemia/hipoxia regionales prolongadas, lo que luego perjudica la reparación y regeneración de las células tubulares.4 Una disminución sostenida en el número de microvasos en la franja interna de la médula externa en AKI indica que el daño del vaso continúa y se suprime la señalización de VEGF.^40–42Además, existe abundante evidencia de que la rarefacción vascular provoca una hipoxia crónica que conduce a una fibrosis tubulointersticial progresiva.⁴³En el modelo de lesión/isquemia aguda de rata, los túbulos proximales son particularmente sensibles a la hipoxia que se manifiesta por el desprendimiento de las células del túbulo e incluso la desintegración total, lo que produce una mortalidad excesiva.44,45 De hecho, el grupo de Humphrey también ha demostrado que la poda microvascular renal es un presagio de enfermedad renal crónica.⁴⁶

Nuestros datos también confirman que el daño vascular promueve la captura de glóbulos rojos y la deposición no hemo (Figuras 4 y 5) que pueden exacerbar la enfermedad renal crónica,⁴⁷pero que es susceptible a la terapia con antitrombina. La fuente tisular de hierro tanto en células glomerulares como tubulares (Figura 5) se originó indudablemente por la ruptura de glóbulos rojos en esos territorios como consecuencia de hemorragia y/o trombosis microvascular, compatible con un cuadro de compromiso vascular que se mitiga con terapia antitrombina. En consecuencia, los enfoques que preservan la integridad vascular pueden representar un primer paso fundamental para mantener las líneas de suministro de sustratos nutritivos que facilitan la curación más rápida de las estructuras tubulares dañadas.

Curiosamente, PPACK PFC NP parece ofrecer una protección temprana de las estructuras vasculares y atenuar varios marcadores de inflamación (Figuras 6 y 7; Tablas complementarias 2-4) tanto en la corteza como en la médula. En los estudios experimentales tradicionales de AKI, se supone que la corteza es más resistente al daño que la médula debido a la menor demanda metabólica, pero la activación endotelial y la inflamación fisiopatológica parecen generalizadas, como lo demuestran nuestros ensayos lipidómicos e histoquímicos. Además, la amplia deposición de hierro no hemo como subproducto de la descomposición de los glóbulos rojos atrapados tanto en la corteza como en la médula, y su mitigación mediante nanopartículas de antitrombina, concuerda con un patrón generalizado de inflamación y daño incluso si la corteza puede resultar más transitoriamente y levemente afectada que la médula durante el curso de la enfermedad.

La sorprendente respuesta temprana de la infiltración de mastocitos dentro de las 24 horas (Figura 8) sugiere un papel importante para las células inflamatorias además de los jugadores tradicionales, como los neutrófilos y los macrófagos. Los mastocitos generalmente se consideran mediadores de las respuestas alérgicas, pero existe una gran cantidad de literatura sobre sus implicaciones fisiopatológicas en la lesión renal aguda y crónica.^48–52 Aunque los neutrófilos son los primeros en responder a la lesión tisular, los macrófagos no entran en escena hasta más tarde en el proceso inflamatorio, lo que sugiere que los mastocitos están desempeñando un papel importante en la fase temprana de la LRA. De hecho, Danelli et al han demostrado que la desgranulación de los mastocitos ocurre temprano en la LRA y que el agotamiento de los mastocitos en el momento de la inducción de la LRA, pero no 48 horas después, confiere un efecto beneficioso a largo plazo sobre la función renal, la atrofia y la fibrosis.⁵³Tong et al. llegaron a conclusiones similares en procedimientos de mastocitos estabilizados con cromoglicato realizados antes de la reperfusión. elaboran niveles reducidos de quimioatrayentes de leucocitos.⁵⁵

Los mastocitos expresan receptores activados por proteasa Los mastocitos expresan receptores activados por proteasa (PAR) que pueden ser activados por la trombina para desgranular y descargar una gran cantidad de quimiocinas preformadas, citocinas y lípidos bioactivos.56–58 La trombina también provoca la adhesión de los mastocitos a la matriz expresión de proteínas (p. ej., fibronectina) e interleucina (p. ej., IL-6) a través de interacciones PAR- 1.⁵⁹Después de la inhibición de la trombina, observamos niveles reducidos de PGD2 que son consistentes con un agotamiento relativo de los mastocitos porque PGD2 es un eicosanoide bioactivo principal secretado por los mastocitos en reacciones de tipo alérgico.60 Además, la regulación a la baja de ICAM-1 y VCAM-1 después del tratamiento con nanopartículas antitrombina es consistente con una infiltración reducida de mastocitos, ya que expresan LFA-1 y VLA y utilizan moléculas de adhesión para lograr la entrada en el tejido.^29,30

Un papel patogénico específico para PGD2 en sí mismo en la evolución de IRI renal hasta ahora no se ha descrito hasta ahora, pero sirve como un biomarcador claro para la activación de mastocitos.⁵²En la inflamación pulmonar, se ha demostrado que PDG2 mejora la expresión de citoquinas proinflamatorias de macrófagos a través de sus receptores (DP1 y DP2), que luego activan la entrada de neutrófilos.61 Nuestra observación de aumento de M-CSF e IL-6 (Figura 8) en AKI que están regulados a la baja por PPACK PFC NP a través de la supresión de mastocitos sería consistente con tal mecanismo putativo. Sin embargo, como se sabe que los mastocitos liberan una gran cantidad de factores potencialmente perjudiciales para la función renal,51,52 cualquier número de determinantes responsables podría ser objeto de estudios futuros para el control mediante la inhibición de la trombina u otros agentes dirigidos molecularmente. En consecuencia, las intervenciones que retardan la atracción y desgranulación temprana de los mastocitos podrían ser muy protectoras de la integridad vascular y la función renal, como se manifiesta por la inhibición local de la trombina en los presentes datos.

Limitaciones

Estos estudios no se diseñaron para dilucidar los beneficios sostenidos de la inhibición de la trombina, ya que el modelo AKI se centra en la protección temprana contra IRI y mecanismos relacionados. Si los beneficios a largo plazo de una dosis única de nanopartículas de antitrombina podrían limitar la progresión a la enfermedad renal crónica está más allá del alcance del presente informe y requeriría un modelo experimental e hipótesis diferentes. Además, la ventana temporal de oportunidad para lograr la recuperación funcional mediante la inhibición de la trombina en la fase de extensión de la LRA no se aborda aquí, pero es un tema de interés para estudios futuros. Sigue siendo una conjetura hasta qué punto los principales efectos beneficiosos de la inhibición local de la trombina en la AKI se deben a la supresión de la activación de los mastocitos, pero sería comprobable en posteriores estudios detallados sobre el mecanismo. Sin embargo, aunque las correlaciones lineales significativas entre los números de mastocitos, CD31 y BUN no necesariamente establecen causa y efecto, su concordancia respalda una fuerte relación entre los mastocitos y el daño vascular en las primeras etapas de la IRI renal. Finalmente, el uso de PPACK como fracción antitrombina es solo un ejemplo de un ingrediente terapéutico conjugable que se puede administrar de manera segura y local en una nanoestructura para atenuar la señalización de la trombina.

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