Los beneficios del acteósido - tratar el glioblastoma

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TAE WOONG HWANG; DONG HUN KIM; DA BI KIM1;TAE WON JANG;GUN‑HWA KIM;MINHO MOON;KYUNG AH YOON;DAE EUN CHO;JAE HO PARK;JWA‑JIN KIM

1. Introducción

Glioblastomaes el tipo más común de tumor cerebral primario maligno y el tumor cerebral primario más invasivo y devastador (1,2), con una tasa de supervivencia media de ~18 meses con terapia multimodal agresiva. Las decisiones de tratamiento actuales son limitadas e incluyen radiación, quimioterapia y cirugía en combinación con el agente alquilante temozolomida (TMZ) (3,4). A pesar de la disponibilidad de terapias agresivas, los pacientes conglioblastomageneralmente tienen un mal pronóstico (5). TMZ es el principal fármaco quimioterapéutico utilizado en el tratamiento clínico de tumores malignos.glioblastoma(6‑8); como agente alquilante de la serie, es capaz de penetrar la barrera hematoencefálica (9‑11). Durante la progresión del glioblastoma maligno y la invasión extensa por todo el cerebro, el aumento constante de la resistencia al TMZ disminuye su eficacia terapéutica (12,13). En consecuencia, nuevos fármacos terapéuticos para contrarrestarglioblastomase buscan con urgencia.

Estudios previos informaron que las células de glioma sufren muerte celular a través de la autofagia, o muerte celular programada de tipo II, en respuesta a TMZ (14,15). La 3-metiladenina (3-MA) ​​puede inhibir la autofagia mediante la conversión de la cadena ligera 3 de la proteína 1 asociada a los microtúbulos (LC3)-I en LC3-II, lo que reduceglioblastomamuerte celular (16,17); sin embargo, el papel de la autofagia depende del contexto celular. Con la excepción de un papel citotóxico durante la acción de TMZ, la inducción de la autofagia por el estrés celular es un proceso citoprotector que elimina los agregados citoplasmáticos, orgánulos y macromoléculas inducidos por el estrés en las células de los mamíferos a través del sistema lisosomal. A su vez, las células involucradas en el mantenimiento de la homeostasis reciben energía a través de estos procesos catabólicos (18,19). Las funciones complejas de la autofagia sugieren que un activador de la autofagia puede tener efectos anticancerígenos en combinación con el tratamiento con TMZ al inducirglioblastomaautofagia celular sin ejercer efectos deletéreos ni aportar beneficios a los tejidos normales. Es de destacar que TMZ ha exhibido efectos terapéuticos sinérgicos en combinación con vitamina D, incluida la viabilidad celular suprimida y una autofagia mejorada englioblastomacélulas. Además, se ha demostrado que la combinación de TMZ y vitamina D ejerce efectos anticancerígenos in vivo, incluido el tamaño reducido del tumor y la tasa de supervivencia prolongada. Estos estudios sugieren que el tratamiento combinado puede tener efectos anticancerígenos sinérgicos a través de mecanismos autofágicos en TMZ.glioblastomaterapia (15).

Acteósidoes un glucósido feniletanoide que se distribuye ampliamente en varios medicamentos herbales chinos tradicionales tonificantes (20,21). Una serie de acciones farmacológicas, incluidas las acciones antioxidantes, anticancerígenas, antiinflamatorias, antinefríticas y antimetastásicas, se han asociado conacteósido(22‑24). Estudios previos han demostrado queacteósidotiene efectos protectores contra el daño hepático inducido por tetracloruro de carbono y D-galactosamina. Los mecanismos subyacentes a los efectos protectores del acteósido probablemente estén relacionados con su capacidad para inhibir la bioactivación mediada por P450 y los efectos de eliminación de radicales libres inducidos por la exposición al tetracloruro de carbono (25,26).

Por lo tanto, la evidencia sugiere que ambosacteósidoy TMZ inducen efectos anticancerígenos a través de la muerte celular. Sin embargo, su asociación y efectos anticancerígenos en el contexto deglioblastomaquedan por dilucidar. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue verificar los efectos anticancerígenos sinérgicos deacteósidocombinado con TMZ englioblastomaterapia. Se realizó un ensayo de viabilidad celular para analizar los efectos anticancerígenos del tratamiento combinado en C6glioblastomacélulas (una rataglioblastomalínea celular), y los resultados se compararon con los del tratamiento posterior con TMZ solo. Para examinar más a fondo el mecanismo de muerte celular causado por el cotratamiento conacteósidoy TMZ, se examinaron genes relacionados con la apoptosis y la autofagia en células C6.

antitumoral acteósido

2. Materiales y métodos

Cultivo de células:

La rata C6glioblastomala línea celular se adquirió de American Type Culture Collection (Rockville, MD, EE. UU.). Las células se cultivaron en condiciones estériles a 37 ˚C en un ambiente húmedo con 5 % de CO2 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10 % de suero bovino fetal (FBS) y 1 % de antibióticos y antimicóticos (todos Welgene, Daegu , Corea).

Material vegetal:

Abeliophyllum distichum Nakai [vale no. Park1001(ANH)] se recopiló en el parque temático Misun‑hyang, Seongbul‑Mountain Recreation Forest, Corea.

Inducción de callos:

Para inducir la formación de callos (27), se aislaron explantes de hojas de 1 cm2 de las plantas frescas. El explante se cultivó en medio Murachige y Skoog (4 por ciento de sacarosa, 0.9 por ciento de agar suplementado con 1 mg/l de ácido naftaleno acético y 1 mg/l de ácido 2,4-diclorofenoxiacético, pH 5,7) a 25˚C. El callo se indujo 20 días después. Una cantidad suficiente deacteósidose obtuvo a través de subcultivo para separar y purificaracteósidodel callo (Fig. 1). Diferentes lotes de purificadoacteósidose utilizaron en cada experimento. Cada experimento se realizó tres veces utilizando un lote diferente.

Aislamiento y purificación:

Las fracciones de acetato de etilo se concentraron al vacío y se usaron como muestra para la purificación del acteósido.Acteósidose aisló y purificó mediante el sistema de aislamiento cromatográfico acelerado (Isolera™ Spektra, Biotage, Uppsala, Suecia) utilizando cartuchos SNAP KPHOSPHO‑SIL y SNAP Ultra (Biotage). losacteósidopurificada del callo se analizó cuantitativamente usando el acteósido estándar por análisis HPLC-PDA. Finalmente, se obtuvo acteósido de una pureza mayor o igual al 95 por ciento del callo y se usó como muestra para la quimioterapia basada en temozolomida.glioblastoma.

Ensayo de bromuro de 3‑(4,5‑dimetiltiazol‑2‑l)‑,5‑difeniltetrazolio (MTT):

Para identificar la mitad de la concentración inhibitoria máxima de TMZ (valor IC50) frente a las células C6, se sembraron 1x104 células en suspensiones unicelulares en pocillos individuales de placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h a 37 ˚C antes del tratamiento con TMZ a la temperatura indicada. concentraciones (1, 5, 10 y 20 mM) a 37˚C durante 24 h. Tras la determinación del valor IC50 de TMZ como 5 mm, las células se trataron durante 24 h con TMZ 5 mM, 50 µMacteósido, o una combinación de los dos (5 mM TMZ y 50 µMacteósido). Se añadió solución de MTT (5 mg/ml) a cada pocillo (10 µl) y se cultivó a 37 ˚C durante 2 h. Posteriormente, se retiró el medio y se añadió DMSO en un volumen de 200 µl cada uno y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 30 min. Se midió la absorbancia a 595 nm para determinar la viabilidad celular.

Ensayo de cicatrización de heridas:

Se cultivó una suspensión de células C6 en 1 ml en una placa de 12 pocillos y se hizo crecer hasta la confluencia. Las células fueron tratadas con TMZ,acteósido, o TMZ másacteósidoy luego se rascó con una punta de pipeta estéril de 10 µl para crear una herida artificial. A 0 y 24 h después de la herida, se capturaron imágenes digitales del proceso de cicatrización de la herida usando un microscopio invertido. La migración celular se cuantificó midiendo el tamaño de la cicatriz a las 0 y 24 h utilizando el software de análisis de imágenes ImageJ 1.43u/Java1.6.0_22 software (NIH, Bethesda, Maryland, EE. UU.). Cada experimento se realizó tres veces y las mediciones se realizaron por triplicado.

inmunotransferencia:

Las células C6 se trataron con TMZ,acteósido, o TMZ másacteósidodurante 24 h. Las células se lisaron en hielo con el tampón de lisis RIPA (Tris‑HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Nonidet P‑40 al 1 %, desoxicolato de sodio al 1 %, SDS al 0,1 %). suplementado con cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa (Roche, Basilea, Suiza) durante 30 min. Después de centrifugar a 18.341 xg durante 15 min a 4˚C, se obtuvo el sobrenadante. La concentración de proteínas se determinó mediante ensayos de proteínas de Bradford (Bio-rad, Hercules, CA, EE. UU.). Se cargaron cantidades iguales de proteínas totales (30 µg) en pocillos individuales y se fraccionaron mediante electroforesis mediante SDS‑PAGE al 10-15 %. Las proteínas se electrotransfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (EMD Millipore, Bedford, MA, EE. UU.). Después de la incubación en una solución de bloqueo que contiene leche descremada al 5 % en solución salina tamponada con Tween/Tris durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las transferencias se probaron con anticuerpos primarios diluidos 1:1, 000 (cat. n.º 9662, caspasa 3; Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, EE. UU.), linfoma de células B0 2 (sc- 7382, Bcl‑2), proteína X asociada a Bcl‑2 (n.° de cat. 2772, Bax), (p‑)p53 fosforilada (sc‑101762), p53 total (sc‑6243), actina (n.° de cat. n.° 4970; todos; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, EE. UU.), LC‑3 (L8918, Sigma; Merck KGaA, Darmstadt, Alemania), Rab7 (n.° de cat. 9367, Cell Signaling Technology, Inc. ), p62 (cat. n.° 114), p‑p38 (cat. n.° 9211), total‑p38 (cat. n.° 9212), p‑c‑Jun N‑terminal quinasa (cat. n.° 9251, p‑c‑Jun N‑terminal kinase (cat. n.° 9251, p -JNK), total-JNK (n.º de cat. 9252), p-quinasa regulada por señal extracelular (n.º de cat. 9101, p-ERK), total-ERK (n.º de cat. 9102; todo Cell Signaling Technology, Inc. .) durante la noche a 4˚C. A esto le siguió la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (1:2,000; LF‑SA8001A, cabra anti‑ratón IgG‑HRP) o LF‑SA8002A (cabra anti‑conejo IgG‑HRP), AB Frontier, Seúl, Corea.) durante 2 h a temperatura ambiente. Luego, las proteínas se visualizaron mediante la exposición a Chemi-Doc (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, cA, EE. UU.).

Tinción de inmunofluorescencia:

La proteína de membrana 1 asociada a lisosomas (LAMP1) y LC3 son marcadores de lisosomas y autofagia. Las células (1x105 células/pocillo) se prepararon en cubreobjetos de vidrio esterilizado (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.) por triplicado. Después del tratamiento con TMZ,acteósido, o TMZ másacteósidodurante 24 h, las células se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante 30 min, se bloquearon con suero de pollo normal al 5 % (S-3000; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, EE. UU.), Triton X al 0,1 % -100 y luego se incubó 1 h para la permeabilización y para bloquear las interacciones proteína-proteína no específicas. Luego, las células se incubaron con anti‑LAMP1 (1:200; sc‑19992, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) y anti‑LC3 (1:400; PM036, MBL International, Woburn, MA, EE. UU.) durante la noche a 4˚ C. A continuación, las células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron durante 2 h más en la oscuridad con una mezcla de anticuerpos secundarios Alexa Fluor 488 y 594 (1:200; Alexa Fluor 488 (A-11008) y 594 (A-11007), Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU.) y se lavó nuevamente con PBS. Los núcleos se tiñeron con 4,6-diamidino-2-fenilindol (Sigma; Merck KGaA) y luego se lavaron dos veces con PBS. A continuación, se montaron los portaobjetos y se capturaron las imágenes con un microscopio confocal láser LSM‑700.

Figura 1. Estructura química del acteósido.

Citometría de flujo.

Las células se analizaron para Mitotracker Green y MitoSOX mediante citometría de flujo utilizando un citómetro de flujo FACSCanto II, según lo indicado por el fabricante (BD Biosciences). Después de dos lavados con PBS, las células se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante 30 min a temperatura ambiente y se permeabilizaron con Triton X‑100 al 0,25 % en PBS durante 20 min. Las células se tiñeron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C (1:200) y luego con anticuerpos secundarios durante 1 h en hielo. Después de dos lavados con PBS, las células se fijaron en paraformaldehído al 4 por ciento y se analizaron inmediatamente. Los datos de citometría de flujo se recolectaron usando 10,000 celdas y se analizaron usando el software FlowJo 7.6.1 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, EE. UU.).

Análisis estadístico:

Todos los datos se analizaron con GraphPad Prism 5.0 y se presentan como la media ± error estándar de la media. Los datos se analizaron con un análisis de varianza unidireccional con la prueba post hoc de comparaciones múltiples de Tukey para la comparación de valores medios entre múltiples grupos. PAGS<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Cistanche Echinacoside: Anti-apoptosis

3. Resultados

3.1 Cotratamiento con TMZ y suprime acteosideglioblastomaproliferación y migración celular.

Tratamiento combinado con TMZ yacteósidoinhibió la viabilidad de las células C6. TMZ redujo la viabilidad celular de manera dependiente de la dosis (Fig. 2A), mientras que el acteósido solo no tuvo un efecto significativo en ningún nivel de tratamiento (Fig. 2B). Después de la incubación en un medio de cultivo que contenía TMZ con o sin acteósido durante 24 h, se realizó un ensayo MTT para comparar las citotoxicidades de diferentes niveles de tratamiento. TMZ suprimió significativamente la viabilidad celular, mientras que el acteósido no suprimió significativamente el crecimiento celular. El tratamiento combinado con TMZ y acteoside redujo notablemente la viabilidad celular (Fig. 2C). El tratamiento con TMZ o acteósido aplicado solo redujo la capacidad de cicatrización de heridas (Fig. 3A). La distancia de la herida (porcentaje) se midió usando los resultados que se muestran en la Fig. 3A con el software ImageJ. La distancia de la herida aumentó significativamente después del tratamiento combinado (Fig. 3B), en comparación con cualquiera de los tratamientos individuales. Estos resultados indican que el cotratamiento con TMZ y acteoside fue un inhibidor efectivo deglioblastomaproliferación y migración celular.

3.2 Acteoside y TMZ afectan la apoptosis sinérgicamente en células C6.

Los resultados del análisis de transferencia Western revelaron que los niveles de caspasa‑3 escindida, Bax y p53 fosforilada eran más altos y los niveles de Bcl‑2 eran más bajos después del tratamiento combinado con TMZ yacteósidoque seguir el tratamiento con TMZ solo (Fig. 4A).ActeósidoA continuación, se observaron la función mitocondrial mediada por y la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), que son mediadores clave de la señalización apoptótica, en las células C6 tratadas con TMZ. Para verificar la masa mitocondrial, se realizó un análisis de clasificación de células activado por fluorescencia utilizando MitoTracker Green. Cotratamiento con TMZ yacteósidoresultó en una masa mitocondrial más alta que el tratamiento con TMZ solo (Fig. 4B). La generación de ROS fue significativamente mayor después del cotratamiento con TMZ y acteoside que el tratamiento con TMZ solo (Fig. 4C). Estos resultados sugieren que la generación de ROS y la función mitocondrial son importantes en la apoptosis inducida por el tratamiento con TMZ más acteósido. El cotratamiento con TMZ y acteósido induce autofagia en células C6. Se ha informado que TMZ induce la autofagia (28,29); por lo tanto, el presente estudio examinó la medida en que la autofagia fue inducida por el tratamiento con TMZ más acteoside. Las células C6 se trataron con TMZ con o sin acteósido; después de 24 h, y las células se tiñeron para inmunofluorescencia para detectar LAMP1 y LC3 como marcadores de autofagia. Se observaron niveles de expresión más altos de LAMP1 y LC3 después del tratamiento combinado (Fig. 5A). También se examinó la expresión de proteínas relacionadas con la autofagia y se descubrió que TMZ inducía la conversión de LC3-I a LC3-II, que es una firma de la generación de autofagosomas. Se observó una mayor tasa de conversión de LC3‑I a LC3‑II después del tratamiento conjunto con TMZ y acteósido que con el tratamiento con TMZ solo. Los niveles de expresión de Rab7 y p62 indicaron inducción de autofagia en las células tratadas con TMZ (Fig. 5B). Estos hallazgos sugieren que el tratamiento conjunto con TMZ y acteoside mejoró el proceso autofágico englioblastomacélulas.

3.3 Acteoside induce la expresión del gen de la vía MAPK en el tratamiento basado en TMZ.

Estudios previos han demostrado que TMZ regula la vía MAPK, incluidos p38, JNK y ERK (30). Por lo tanto, el presente estudio investigó siacteósidoafecta la expresión del gen MAPK relacionado con TMZ. Las células C6 se trataron con TMZ con o sinacteósido. Después de 24 h, el tratamiento con TMZ resultó en niveles de expresión más altos de p‑p38, p‑JNK y p‑ERK. La expresión de los genes regulados por TMZ fue significativamente mayor después del tratamiento con TMZ más acteósido que con el tratamiento con TMZ solo (Fig. 6). Estas observaciones sugieren queacteósidoafecta los mecanismos terapéuticos basados ​​en TMZ a través de la vía MAPK.

Acteósido anti-glioblastoma

Discusión

Los resultados del presente estudio establecen que el tratamiento combinado con TMZ conacteósidoofrece potencial terapéutico paraglioblastomatratamiento, y proporcionar evidencia de que la quimiosensibilización a una combinación de TMZ yacteósidopuede ocurrir a través de la mejora de la autofagia. Como la mutación deglioblastomalas células pueden conducir a la inactivación de la vía apoptótica, la inducción de la autofagia por TMZ másacteósidoEl cotratamiento puede representar un método alternativo paraglioblastomaterapia. Sin embargo, si la autofagia es el único mecanismo paraglioblastomaterapia con TMZ plusacteósidoel cotratamiento queda por dilucidar.

La autofagia es un mecanismo celular esencial para la degradación de proteínas y orgánulos citoplasmáticos. La ventaja catabólica de la autofagia inducida puede ser importante en condiciones de estrés; por lo tanto, la inducción de la autofagia puede ser un mecanismo adaptativo para la prevención de la muerte celular (31‑33). Estudios previos han informado que la autofagia reducida se correlaciona con el cáncer (34‑36). Además, varias proteínas y vías de señalización asociadas con la autofagia se desregulan durante la transformación maligna, lo que da como resultado una reducción de la actividad autofágica. Los altos niveles de expresión de LC3 también se han asociado con mayores tasas de supervivencia en pacientes conglioblastomacon malas puntuaciones de rendimiento (37,38). De manera similar, los resultados del presente estudio indican que la restauración de la autofagia normal puede ser una estrategia latente paraglioblastomay puede servir como mecanismo para la restricción del crecimiento anormal de células tumorales.

En la autofagia normal, los componentes citoplasmáticos particulares se aíslan dentro de los autofagosomas que luego se fusionan con un lisosoma para degradarse y reciclarse (39,40). Cuando la autofagia aumenta, las tasas de formación de autofagosomas superan las tasas de degradación de los lisosomas; esta condición se denomina estrés autofágico. Si continúa el estrés o la autofagia anormal, la muerte celular puede ocurrir a través del agotamiento de la energía o cambios en el equilibrio beclin‑1/Bcl‑2. La apoptosis también puede desencadenarse por la hiperactividad del autofagosoma, que engulle orgánulos citoplasmáticos, incluidas las mitocondrias o el retículo endoplásmico (41). Se ha sugerido que la autofagia general puede inducir la muerte celular durante el recambio normal de orgánulos y citoplasma en células sanas. En este proceso, la célula se 'canibaliza' a sí misma desde el interior, una característica clave de la muerte celular programada de tipo II. Aunque los mecanismos por los cualesacteósidomejora el efecto terapéutico de TMZ-basedglioblastomaAunque aún no se ha dilucidado completamente la terapia, los efectos anticancerígenos exhibidos por el tratamiento combinado examinado en el presente estudio pueden estar asociados con estos mecanismos autofágicos.

Acteósidoes un glucósido feniletanoide derivado de plantas (22,26). Estudios previos han informado sobre las diversas actividades biológicas del acteósido. Los cambios en los niveles de expresión de caspasa-3 escindida y LC3 en el presente estudio demuestran que el tratamiento con una combinación de TMZ yacteósidoindujo apoptosis y autofagia en células C6 (Figs. 4 y 5). Se demostró que el tratamiento combinado tiene un efecto sinérgico sobreglioblastomacélulas. Aunque quedan por dilucidar otros posibles mecanismos de estos efectos sinérgicos, el presente estudio identificó la inducción de la autofagia como un mecanismo tumoricida crucial deacteósidoquimiosensibilización durante TMZ-basedglioblastomaterapia.

Acteoside tratar el glioblastoma

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