Inmunidad sinérgica y protección en ratones mediante co-inmunización con vacunas de ADN que codifican la proteína Spike y otras proteínas estructurales del SARS-CoV-2

Abstracto:La aparición de nuevas variantes del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS CoV-2) ha generado brotes de infección recurrentes en todo el mundo. Estas variantes altamente mutadas reducen la eficacia de las vacunas actuales contra la enfermedad del coronavirus 2019 (COVID-19), que están diseñadas para atacar únicamente la proteína de pico (S) del virus original. A excepción de la S del SARS-CoV-2, el potencial inmunoprotector de otras proteínas estructurales (nucleocápside, N; envoltura, E; membrana, M) como antígenos diana de la vacuna aún no está claro y merece ser investigado. En este estudio, se desarrollaron vacunas de ADN sintético que codifican cuatro proteínas estructurales del SARS-CoV-2 (pS, pN, pE y pM), y se inmunizaron ratones con tres dosis mediante inyección intramuscular y electroporación. En particular, la co-inmunización con dos vacunas de ADN que expresaban las proteínas S y N indujo anticuerpos neutralizantes más altos y fue más efectiva para reducir la carga viral del SARS-CoV-2 que la proteína S sola en ratones. Además, la co-inmunización de pS con pN o pE + pM indujo una mayor inmunidad celular específica de la proteína S después de tres inmunizaciones y causó cambios histopatológicos más leves que pS solo después de la exposición. Se debe investigar más a fondo el papel de las proteínas estructurales conservadas del SARS-CoV-2, incluidas las proteínas N/E/M, para sus aplicaciones en el diseño de vacunas, como las vacunas de ARNm.

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Palabras clave: COVID-19; SARS-CoV-2}}; coinmunización; vacuna de ADN; proteína de pico; proteína estructural

1. Introducción

El síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) es la causa de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), que ha causado millones de infecciones y muertes en todo el mundo y ha puesto en peligro la salud humana y la economía global. . Aunque todavía no se dispone de enfoques terapéuticos eficaces, han avanzado rápidamente, incluida la aplicación de la terapia con células CAR-T y la nanotecnología [1,2]. La vacunación es una forma eficaz de controlar la pandemia y varios organismos reguladores de salud han aprobado su uso [3,4]. El genoma del coronavirus codifica cuatro proteínas estructurales principales, a saber, las proteínas de espiga (S), nucleocápside (N), membrana (M) y envoltura (E), que son responsables del ensamblaje del virión y la supresión de la respuesta inmune del huésped [5 ]. La proteína S está compuesta por 1273 residuos de aminoácidos que contienen dos subunidades, a saber, S1 y S2. Media la entrada viral y es un objetivo importante para el desarrollo de vacunas contra el coronavirus [6-11]. Sin embargo, la proteína S del SARS-CoV-2 tiene una alta frecuencia de mutación. No es sorprendente que en el SARS-CoV-2, un virus de ARN, la mutación sea continua e inevitable. Ha habido cinco variantes preocupantes (VOC) del SARS-CoV-2 que han surgido desde septiembre de 2020, incluidas B.1.1.7 (Reino Unido, Alfa), B.1.351 (Sudáfrica, Beta), P.1 (Brasil, Gamma), B.1.617.2 (India, Delta) y B.1.1.529 (Sudáfrica, Omicron) (Andreano y Rappuoli, 2021; Gupta, 2021). Todos ellos tienen varias mutaciones en la proteína de pico [12]. Estas variantes amenazan la eficacia de las vacunas COVID-19 actuales, que están diseñadas para atacar únicamente la proteína de pico.

La proteína N del SARS-CoV-2 se une al ARN viral a través de un 140-dominio de unión de ARN de longitud de aminoácidos en su núcleo en forma de "cuenta en una cuerda". Está altamente conservada entre los coronavirus, comparte una identidad de secuencia de ~90% con la del SARS-CoV, y también es la única proteína estructural dentro del virión [13]. Además, desempeña un papel importante en el empaquetado del ARN viral en el complejo de ribonucleocápside y es necesario para la replicación del ARN viral, el ensamblaje del virión y la liberación de las células huésped [14]. Debido a la alta similitud de secuencia de la proteína N en los coronavirus, se puede sugerir como objetivo de una vacuna de protección cruzada. Anteriormente descubrimos que la co-inmunización con dos vacunas de ADN que expresan proteínas E y M proporciona protección parcial contra el SARS-CoV-2, y este método debe considerarse durante el desarrollo de la vacuna [15]. Según el documento panorámico de la OMS, normalmente existen siete estrategias para las vacunas candidatas contra el SARS-CoV-2, que se pueden dividir en tres categorías: en primer lugar, vacunas basadas en proteínas, incluidas vacunas de virus inactivados, vacunas similares a virus vacunas de partículas y de subunidades proteicas; en segundo lugar, vacunas basadas en genes, incluidas vacunas transmitidas por virus, vacunas de ADN y vacunas de ARNm; tercero, una combinación de enfoques basados ​​en proteínas y en genes, como vacunas de virus vivos atenuados. Las tecnologías de ADN, como nuevas estrategias de vacunas basadas en genes, pueden comparar rápidamente múltiples candidatos y estrategias de vacunas durante las pruebas preclínicas [16,17]. En teoría, casi todas las proteínas virales son inmunógenos potenciales y objetivos de vacunas. Sin embargo, hasta donde sabemos, la inmunogenicidad y el potencial protector de las vacunas de ADN sintético al codificar las proteínas S del SARS-CoV-2 y otras proteínas estructurales aún no se han informado sistemáticamente. Se evaluó la inmunogenicidad y eficacia protectora de cuatro vacunas de ADN que expresan las proteínas S, N, E y M1 del SARS-CoV-2 en ratones para explorar los efectos inmunológicos de la S en combinación con otras proteínas estructurales.

2. Materiales y métodos

2.1. Células

Se cultivaron células Huh7.5 y células 293T de riñón embrionario humano a 37 ◦C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 durante todo el estudio. Las células se cultivaron en medio DMEM (HyClone, Logan, UT, EE. UU.), suplementado con FBS al 10% (GEMINI Co., Shanghai, China) y penicilina-estreptomicina al 1% (Gibco, Nueva York, NY, EE. UU.). Se confirmó que todas las líneas celulares eran negativas para la contaminación por micoplasma.

2.2. Construcción de vacunas de ADN que codifican el SARS-CoV-2 S/N/E/M

El gen que codifica la proteína S/N del SARS-CoV-2, que contiene una secuencia Kozak N-terminal (GCCACC) seguida de un codón de iniciación (ATG), se sintetizó utilizando un codón optimizado para mamíferos (GenScript Co., Nanjing). , Porcelana). Luego se clonó en el vector de expresión pcDNA3.1 (+) mediante digestión con EcoRI y XbaI y se denominó pS/pN (vacunas de ADN) (Figura 1A). La proteína pE/PM se construyó e identificó como se describió anteriormente [15]. Las vacunas se prepararon utilizando kits Maxiprep sin endotoxinas (Qiagen, Beijing, China) y las secuencias se confirmaron mediante la secuenciación de ADN de Sanger. La expresión de la proteína S/N se confirmó mediante transferencia Western y anticuerpos anti-S (Sino Biological, Beijing, China)/anti-N diluidos a 1:1000. Estos experimentos se realizaron como se describió anteriormente [15,18].

Figura 1. Diseño y expresión de construcciones de vacuna con proteína S/N del SARS-CoV-2 basada en ADN recombinante. (A) Diagrama esquemático de las vacunas basadas en ADN recombinante que codifican las proteínas de pico (PS), nucleocápside (pN), envoltura (pE) y/o membrana (PM) del SARS-CoV-2. (B) La expresión de la proteína diana en las vacunas de ADN se validó mediante el análisis de transferencia Western de células 293T transfectadas con los plásmidos pS/pN/pE/pM.

2.3. Inmunización y desafío

Se alojaron ratones BALB/c hembra (Charles River Laboratories, Francia) de 6 semanas de edad en el Instituto Nacional de Salud Ocupacional y Control de Envenenamientos en un ambiente de 21 ◦C y humedad controlada con ciclos de luz/oscuridad de 12 h. Mientras tanto, se proporcionó comida y agua ad libitum, y todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de Experimentos con Animales del Centro Chino para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC de China). La investigación cumplió con las normas éticas pertinentes.

Los ratones se dividieron aleatoriamente en cinco grupos y se inmunizaron con pS/pN solo o se co-inmunizaron con pS + pN o pS + pE + PM los días 0, 21 y 42 mediante inyección intramuscular más electroporación (35 mg/50 ml) (Figura 2) [19,20]. Brevemente, se inyectaron vacunas de ADN en el músculo tibial anterior (TA) y se las impulsó inmediatamente con electricidad utilizando un electrodo de dos agujas con una separación de 5 mm (ECM830; BTX) con agujas. Se recolectaron sueros de los ratones para el análisis de la respuesta inmune humoral y se procesaron los bazos de los ratones para medir la respuesta inmune celular (Figura 2).

Figura 2. Esquema de la inmunización y el desafío SARS-CoV-2. Duración de la vacunación, provocación y muestreo de sangre/tejido. Los ratones BALB/C se dividieron aleatoriamente en grupos.

Los experimentos de exposición al SARS-CoV-2 se realizaron como se describió anteriormente [15,21]. Brevemente, los ratones fueron anestesiados y luego transducidos por vía intranasal con 2,5 × 108 UFP de Ad5-hACE2 en un volumen total de 45 µl. Cinco días después de la transducción, los ratones fueron anestesiados y luego expuestos por vía intranasal a 1 × 105 TCID50 de SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC HB-02/2019) en un volumen total de 50 µL de solución salina. buffer. Todo el trabajo con SARS-CoV-2 vivo en modelos de ratón se realizó en laboratorios de Nivel de bioseguridad animal 3 (ABSL-3).

2.4. Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

Los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) se realizaron como se describió anteriormente [15]. Brevemente, se recubrieron proteínas S (compradas en Sino Biological)/N (un regalo de Song) diluidas en tampón de carbonato (0.1 M, pH 9,6) sobre placas 96-pocillos EIA/RIA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) durante la noche a 4 ◦C. Las placas se bloquearon con 200 µL de suero de cabra al 10% en PBS a 37 ◦C durante 2 h, seguido de lavado cinco veces con PBST. Luego, se agregaron muestras de suero diluidas en serie en suero de cabra al 2% en PBS y se incubaron durante 2 h a 37 ◦C, seguido de cinco lavados con PBST. Se añadió Ab IgG anti-ratón de cabra conjugado con HRP (1:5000) a 37 ◦C durante 1 h. Se añadió un total de 100 µl de sustrato TMB a cada pocillo y se inactivó con 50 µl de H2SO4 2 M. La absorbancia se leyó a una longitud de onda de 450 nm utilizando SPECTR Ostar Nano (BIO-GENE, Hong Kong, China).

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2.5. Experimentos de neutralización e infección por pseudovirus

El ensayo de neutralización de pseudovirus se realizó como se describió anteriormente [21, 22]. Previamente se construyó un plásmido que expresa la proteína S del virus ancestral [22]. Se sintetizó la variante Omicron del gen de la proteína de pico del SARS-CoV-2 (GISAID: EPI_ISL_6590782.2) (un obsequio de Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, China). utilizando un codón optimizado para mamíferos y clonado en el vector pcDNA3.1, como se describió anteriormente [22]. Brevemente, los plásmidos que expresan un indicador de luciferasa y los plásmidos que expresan la proteína S se cotransfectaron en células HEK 293T utilizando el reactivo de transfección de ADN X-treme GENE HP. El cultivo celular se renovó 6 h después de la transfección y el sobrenadante que contenía pseudovirus se recogió después de 48 h y se almacenó a -70 ◦C. En el ensayo de neutralización de pseudovirus, luego se incubó una mezcla igual de suero y virus en 37 volúmenes del sobrenadante que contenía pseudovirus y luego se añadió al suero diluido. ◦C durante 1 h. Luego se reemplazaron los medios de cultivo de células Huh7.5 con 100 µL de la mezcla suero-virus y se incubaron a 37 ◦C durante 12 h. Se procesaron en paralelo células cultivadas únicamente con pseudovirus SARS-CoV-2. Luego, los medios se reemplazaron con DMEM (2% FBS) y la incubación se incubó a 37 ◦C durante 48 h. Luego, se midió la señal de luciferasa utilizando el kit de luciferasa Bright-Glo firefly (Promega).

2.6. Ensayo de neutralización del SARS-CoV-2

En este experimento se utilizó SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC-HB-02/2019). Brevemente, los sueros se diluyeron dos veces a partir de una dilución inicial de 1:10, se mezclaron con un volumen igual (10–15 ufp/pocillo) de SARS-CoV-2 vivo y se incubaron durante 1 h a 37 ◦C. después de lo cual se agregaron a las células Vero sembradas. Después de la incubación a 37 ◦C durante 48 h, se observó un efecto citopático (CPE) y se recogieron 100 µL del sobrenadante del cultivo para la extracción de ácidos nucleicos y la PCR con transcripción inversa por fluorescencia en tiempo real (RT-PCR). La dosis mediana de neutralización (ND50) se calculó utilizando el método de Reed-Munch [15].

2.7. Ensayo IFN-ELISpot

Scilight Biotechnology, LLC sintetizó los grupos de péptidos que abarcan toda la proteína S/N/E/M como 15-meros consecutivos superpuestos por 10 aminoácidos. Aproximadamente 2,5 mg de cada péptido purificado del conjunto de péptidos estaban presentes por vial. El experimento se realizó como se describió anteriormente [18]. Brevemente, se recubrieron placas de 96-pocillos (BD ELISPOT Set, EE. UU.) con Ab anti-captura de IFN y se incubaron durante la noche a 4 ◦C. Las placas se bloquearon con el medio de cultivo completo después de lavar tres veces. Los esplenocitos se recolectaron después de que los ratones fueron sacrificados los días 35 y 120. Se sembraron suspensiones de células individuales frescas de cada grupo a 5 x 106 por pocillo y se agregaron péptidos. Luego, las placas se incubaron a 37 ◦C en CO2 al 5% durante 22 h y se detectaron utilizando un lector de placas ELISpot (Biosys, So. Pasadena, CA, EE. UU.). Una unidad formadora de manchas (SFU) representa un IFN- secretor de células T.

2.8. Evaluación de la protección en ratones después del desafío SARS-CoV-2

Los experimentos se realizaron como se describió anteriormente [15, 21]. Brevemente, se extrajeron los pulmones después de que los ratones fueron sacrificados. La mitad de los tejidos se utilizaron para extracción de ácido nucleico, RT-PCR de fluorescencia en tiempo real y TCID50. La otra mitad fue enviada a la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Agrícola de China para una evaluación patológica.

2.9. Análisis estadístico

Se realizaron pruebas t no pareadas, pruebas ANOVA de dos vías y la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett utilizando GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software LLC). Los valores de p < 0.05 se consideraron estadísticamente significativos (* p < 0.05; ** p < 0.01; * ** p < 0,001; **** p < 0,0001).

3. Resultados

3.1. Caracterización de vacunas de ADN

Los niveles de proteína E y M se detectaron mediante transferencia Western. Medimos la expresión de las proteínas S/N/E/M codificadas del SARS-CoV-2 en células T HEK-293transfectadas con plásmidos pS/pN/pE/pM mediante análisis de transferencia Western, utilizando anti -Anticuerpos S/anti-N y un anticuerpo anti-6 x His, en los lisados ​​celulares. Las bandas se aproximaron al peso molecular previsto de las proteínas S (140–142 kDa), N (45 kDa), E (10 kDa) y M (22–25 kDa) (Figura 1B).

3.2. Producción robusta y sostenida de IgG anti-S y/o anti-N inducida por ADN pS y/o pN

Vacunas Se recogió suero de ratones BALB/c a los 35, 56, 96 y 120 días (Figura 2). Los niveles de IgG anti S/anti-N se detectaron mediante ELISA. La magnitud de la respuesta de IgG específica de S o N inducida por pS o pN aumentó en el suero después del primer y segundo refuerzo. Los títulos de IgG anti-S y anti-N fueron mayores en el grupo pS + pN que en los otros grupos; sin embargo, la diferencia no fue estadísticamente significativa (Figura 3A, B). No se detectaron respuestas sólidas de anticuerpos específicos de la proteína E/M, lo que concuerda con los resultados de un estudio anterior (datos no mostrados) [15].

Figura 3. Respuestas de las células B al SARS-CoV-2 en ratones BALB/c. (A) Títulos de criterio de valoración de unión de IgG en suero para las proteínas SARS-CoV-2 S (A) y N (B). (C) Los títulos de neutralización se determinaron basándose en un sistema de virus pseudotipado SARS-CoV-2. (D) Los títulos de neutralización anti-SARS-CoV-2 se determinaron utilizando un virus SARS-CoV-2. (E) Ensayo de neutralización basado en un sistema de virus pseudotipado Omicron del SARS-CoV-2. Se muestran las proporciones de inhibición de los sueros de los grupos simulado (azul), pS (rojo), pS + pN (verde), pS + pE + pM (rosa) y pN (naranja). Las barras de error representan el SEM y los valores p se calcularon utilizando un ANOVA de dos factores y el análisis post hoc de Sidak, donde * p < 0.05

3.3. Altos niveles de anticuerpos neutralizantes inducidos por la coinmunización con vacunas pS y pN

Los títulos neutralizantes de muestras de suero diluidas en serie se determinaron utilizando el virus pseudotipado SARS-CoV-2. Los niveles más altos de anticuerpos neutralizantes (nAb) se observaron en el grupo pS + pN, con los títulos medios geométricos recíprocos de EC50 alcanzando 2988 (el día 35) y 3578 (el día 56) (Figura 3C). Se observaron resultados similares utilizando el ensayo de microneutralización (MN) de virus vivos, en el que los niveles de nAbs en el grupo pS + pN fueron mayores que los del grupo S en los días 56 y 96 (p < 0.05; Figura 3D). Además, los niveles de nAbs en el grupo pS + pN el día 56 (segundo refuerzo) fueron significativamente más altos que los del día 35 (p <0,05; Figura 3D).

La actividad neutralizante de cada régimen de vacuna contra la variante Omicron del SARS-CoV-2 se determinó además utilizando la plataforma pseudotipada y muestras de suero. El perfil de neutralización contra el virus Omicron en los días 35 y 56 fue similar al del virus ancestral (Figura 3E), lo que sugiere que el tratamiento PS + pN tenía potencia de neutralización cruzada.

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3.4. Respuestas de células T inducidas por la vacunación con ADN

Como se describió anteriormente, las respuestas de las células T contra los antígenos S/N/E/M del SARS-CoV-2 se estimaron utilizando IFN-ELISpot, como se describió anteriormente [15]. Como se esperaba, tanto el régimen PS + pN como el régimen pS + pE + pM indujeron niveles significativamente más altos de células T IFN + específicas para la proteína S el día 120 que el día 35 (p < 0. 05; Figura 4A). Además, el número de células T IFN+ específicas para la proteína N el día 120 (segundo refuerzo) fue significativamente mayor que el del día 35 en el grupo pS + pN (p <0,05; Figura 4B). Finalmente, el número de células T IFN+ específicas para la proteína M el día 120 (segundo refuerzo) fue significativamente mayor que el del día 35 en ambos grupos (p <0,05; Figura 4D).

Figura 4. Respuestas de las células T a las proteínas estructurales individuales del SARS-CoV-2 en ratones BALB/c. (A) Las respuestas de las células T se midieron utilizando IFN-ELISpot en esplenocitos estimulados durante 20 h con grupos de péptidos superpuestos que abarcan el SARS-CoV-2 S, (B) N, (C) E, y proteínas (D)M. Las barras representan la media ± DE. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando un ANOVA de dos factores y la prueba post hoc de Sidak, donde * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,01 y **** p < 0,0001.

3.5. Protección sinérgica inducida por co-inmunización con pS/pN o pS/pE/pM

Luego evaluamos la eficacia protectora de las vacunas de ADN utilizando ratones hACE2 inmunizados después de la exposición con el virus ancestral SARS-CoV-2. Después del desafío, los ratones del grupo simulado mostraron una pérdida de peso gradual. Por el contrario, los ratones inmunizados con pS o pS+ mostraron una leve pérdida de peso inmediatamente después de la infección, seguida de recuperación (Figura 5A). No se detectó virus vivo en los ratones vacunados con pS, pS + pN o pS + pE + pM. Además, la vacunación pS + pN redujo significativamente los números de copias de ARN viral en comparación con los obtenidos con la vacunación pS sola (p=0.0228; Figura 5B). Además, la histopatología pulmonar demostró que los ratones tanto en el grupo simulado como en el pN mostraban parches focales de inflamación, invaginación pleural, colapso alveolar, altos niveles de infiltración de células inflamatorias y áreas hemorrágicas. En comparación, los ratones tratados con pS + pN o pS + pE + pM exhibieron cambios histopatológicos más leves y puntuaciones INHAND más bajas después del desafío que el otro grupo (Figura 5C).

Figura 5. Eficacia protectora de la inmunización tras la exposición al virus vivo SARS-CoV-2. (A) Los ratones se pesaron diariamente (media ± error estándar de la media (SEM), n=4) durante tres días después del desafío. (B) Título infeccioso de SARS-CoV-2 en homogeneizados de pulmón el tercer día posterior a la exposición, según lo determinado mediante el ensayo TCID5{{10}} y el número de copias de ARN. Las diferencias estadísticamente significativas entre los grupos se determinaron mediante un ANOVA unidireccional seguido de la corrección de comparación múltiple de Dunnett (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 y **** p < 0,0001). (C) Análisis histopatológico pulmonar mediante tinción H&E.

4. Discusión

En este estudio, la co-inmunización con dos vacunas de ADN que expresan las proteínas S y N indujo niveles elevados de nAbs y fue muy eficaz para reducir la carga viral del SARS-CoV-2 en ratones. Las vacunas de ADN que expresan la proteína S indujeron un aumento de los niveles de inmunidad celular específica de la proteína S después de tres inmunizaciones cuando los ratones fueron co-inmunizados con proteínas N/E y M y aliviaron los cambios histopatológicos posteriores a la exposición. Hasta donde sabemos, este es el primer informe que revela la mejora sinérgica de la inmunidad y la protección en ratones que utilizan una vacuna de ADN que codifica la proteína S cuando se co-inmunizan con vacunas de ADN que codifican otras proteínas estructurales del SARS-CoV.{{8 }}.

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En varios estudios se han observado epítopos de células B inmunodominantes en regiones del antígeno N. Las vacunas basadas en N generalmente no pueden inducir nAb, probablemente porque la proteína N no se muestra en la superficie viral. En particular, la co-inmunización con las proteínas S y N indujo niveles más altos de nAb contra el virus ancestral y Omicron SARS-CoV-2 que los otros grupos. El aumento de las respuestas de nAb se asocia con una mejor eliminación viral y eficacia protectora. Nuestros resultados demostraron que el tratamiento con pS + pN fue más eficaz que el tratamiento con pS solo para reducir la carga viral del SARS-CoV-2 después de la exposición. Un estudio anterior informó que los hámsteres inmunizados con una vacuna que coexpresa las proteínas M y N estaban protegidos contra la pérdida de peso grave y la patología pulmonar y habían reducido significativamente los títulos virales en la orofaringe y los pulmones después del desafío SARS-CoV-2. lo cual es consistente con nuestros resultados [23]. Desafortunadamente, la reducción en los títulos de virus no se puede atribuir específicamente a la proteína M o N, y los niveles de nAb no se evaluaron en este estudio. Un estudio sobre la vacuna de ARNm del SARS-CoV-2 informó que la co-inmunización S + N indujo una respuesta aumentada de las células T CD8+ específicas de S y una actividad de anticuerpos neutralizantes, lo que proporciona una mejor protección en los pulmones contra la variante Delta. variante en comparación con S solo, lo que es consistente con los resultados de este estudio [24]. Otro estudio informó que la proteína N del coronavirus de la gastroenteritis transmisible promovió la síntesis de anticuerpos neutralizantes cuando las células TGEV-IMMUNE porcinas fueron estimuladas con una combinación de proteínas S y N in vitro, y este efecto podría explicarse por la respuesta de los linfocitos T auxiliares a la proteína N [25].

Los epítopos de células T CD4+/CD8+ inmunodominantes en regiones del antígeno N se han identificado previamente. Varios estudios han informado que las vacunas basadas en la proteína N del SARS-CoV-2 inducen eficazmente respuestas inmunitarias celulares. El grupo S + N mostró mayores niveles de inmunidad celular específica de la proteína S después de tres inmunizaciones. Un estudio sobre la vacuna de ARNm del SARS-CoV-2 informó que la combinación S + N indujo una respuesta aumentada de células T CD8+ específicas de S en comparación con S sola, lo que concuerda con nuestros resultados [24]. Otro estudio informó que las respuestas de las células T a los antígenos S y N después de la vacunación primaria con doble antígeno hAd5 S + N solas eran equivalentes a las de pacientes previamente infectados con SARS-CoV-2-, y los modelos de predicción in silico de células T La unión del epítopo HLA sugirió que las respuestas de las células T a la vacuna hAd5 S + N conservarán su eficacia contra la variante B.1.351. Además, el plasma de pacientes previamente infectados con SARS-CoV-2-mostró una mayor afinidad de unión a las células que expresan el constructo de antígeno dual S-Fusion + N-ETSD que al hAd5 S-Fusion solo, lo que sugiere además que la inmunogenicidad del La vacuna S + N de doble antígeno es mejor que la vacuna S de antígeno único [26].

El virus vivo no se detectó en los pulmones y la pérdida de peso después de la exposición se mitigó en los grupos pS, pS + pN y pS + pE + pM, mientras que el tratamiento con pN no redujo eficazmente el título del virus. Estos hallazgos enfatizan la indispensabilidad y eficacia de la proteína S como objetivo de la vacuna. En particular, la co-inmunización con pS y pN tuvo mejores efectos que pS o pN en la eliminación viral. El grupo pS + pE + pM indicó menos cambios histopatológicos en los pulmones, lo que concuerda con los resultados de nuestro estudio anterior [15]. El grupo S + N tuvo copias bajas de ARN viral en el pulmón, una pérdida de peso reducida y un tiempo de recuperación rápido después de la exposición al SARS-CoV-2 en comparación con el grupo inmunizado solo con S/N, lo cual fue consistente con la resultados de este estudio. Sin embargo, ninguno de los grupos detectó títulos de anticuerpos neutralizantes, lo que podría explicarse por diferencias en la variedad de vacunas y los animales de experimentación [26]. Un estudio de vacuna con vector de adenovirus SARS-CoV-2 informó que la vacuna S solo proporcionaba protección cerebral aguda cuando se co-inmunizaba con una vacuna N [27]. Otro estudio desarrolló vacunas Tri: ChAd, Bi: ChAd y Mono: ChAd que expresan las proteínas S1/N/RdRp, N/RdRp y S1, respectivamente, y las probó en un modelo animal B.1.351. Se observó una patología macroscópica extensa en los pulmones Mono: ChAdlungs, mientras que los pulmones Bi: ChAd y Tri: ChAd parecían casi libres de esta patología [28].

Además, los animales no vacunados tenían cargas virales pulmonares elevadas, mientras que el tratamiento con Tri:ChAd redujo significativamente las cargas virales en 3,5 logs. En comparación, tanto la vacuna Bi: ChAd como la Mono: ChAd solo redujeron moderadamente la carga viral. Estos resultados sugieren que el efecto protector de la vacuna S/N de doble antígeno contra variantes puede ser mejor que el de la vacuna S de antígeno único, lo que concuerda con nuestros resultados [28]. Algunos estudios han informado que los ratones inmunizados con proteína N desarrollan una inflamación pulmonar grave después de la infección por SARS-CoV [29-31]. Estudios previos también han informado que la inmunización con una vacuna de vector de adenovirus que expresa la proteína N del virus de la hepatitis del ratón protege a los ratones contra una infección letal, lo que demuestra que la proteína N podría generar un efecto protector [32]. Además, el grupo inmunizado con la vacuna de ADN CRT/N tuvo un título viral significativamente reducido después del desafío, con un virus vaccinia que expresaba la proteína N del SARS-CoV [33].

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Un estudio sobre la proteína S demostró que la vacuna combinada de ADN/proteína inducía inmunidad tanto humoral como celular mejor que la vacuna de ADN/proteína sola [8]. Las vacunas que se dirigen únicamente a la proteína S han demostrado una eficacia reducida en la protección contra la COVID-19 leve a moderada causada por variantes emergentes. Las funciones de las proteínas estructurales conservadas del SARS-CoV-2, incluidas las proteínas N/E/M, merecen atención en el diseño y las aplicaciones de vacunas, ya que las respuestas de las células T inducidas por la vacuna contra los epítopos conservados generalmente no se ven afectadas por las mutaciones. . Un estudio informó que los pacientes recuperados del SARS (n=23) todavía poseían células T de memoria duradera reactivas a la proteína N del SARS-CoV 17 años después del brote de 2003, que mostró una fuerte reactividad cruzada con el SARS CoV{ {15}} proteína N, lo que valida aún más el uso de la proteína N como objetivo de vacuna de protección cruzada [34]. Este estudio demostró que la co-inmunización pS/pN se asoció con respuestas nAb más altas, una mejor eliminación viral y respuestas inmunes celulares mejoradas y puede proporcionar una mejor protección después de la exposición al SARS-CoV-2 en comparación con pS solo. Además, se ha demostrado que las variantes del SARS-CoV-2 infectan a muchas especies animales y se ha observado transmisión de persona a animal en algunos animales salvajes y mascotas [7]. Por lo tanto, la vacuna veterinaria contra el SARS-CoV-2 necesita más atención. Además, la nanotecnología puede ser una herramienta poderosa para optimizar las vacunas y merece más atención [2].

Este estudio tiene varias limitaciones. En primer lugar, solo observamos la estrategia de la vacuna de ADN en ratones BALB/c, y los estudios futuros deberían evaluar los efectos inmunogénicos de estos regímenes de vacunas en otros modelos animales. En segundo lugar, se necesita investigación adicional para comprender completamente los mecanismos moleculares subyacentes a las respuestas aumentadas de las células T CD8 específicas de nAb y S inducidas por la co-inmunización utilizando las proteínas S y N y aprovechar este conocimiento para optimizar la COVID-19 diseño de vacunas. Finalmente, la función de los anticuerpos específicos de la proteína N merece más estudio.

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En conclusión, este estudio evaluó el potencial inmunoprotector de la co-inmunización con las proteínas S, N, E y M del SARS-CoV-2. Varias vacunas dirigidas únicamente a la proteína S tienen un efecto protector reducido sobre las cepas variantes emergentes. Nuestros resultados sentarán las bases para el desarrollo de una vacuna COVID-19 de reactividad cruzada para controlar las variantes actuales y emergentes del SARS-CoV-2 y prevenir posibles pandemias de coronavirus.

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